Name: natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Forfatterne takker Heather Roshon (Canadian Phycological Culture centre, University of Waterloo for at levere cyanobakterier-kulturen undersøgt og Sawsan Abusharkh (Carleton University) for teknisk assistance.

1. fremstilling af ikke-målrettet væskekromatografi (LC)-MS/MS datasæt
Bemærk: DFF kan udføres ved hjælp af et massespektrometer med høj opløsning og en analytisk metode, der er optimeret til en målklasse af analysander. MC optimeret LC-MS/MS betingelser på Orbitrap massespektrometer er opført i tabellen af materialer.
<ol><li>
Download MZmine 2 (http://mzmine.github.io/) Bemærk: eksempeldata CPCC300. RAW kan findes på https://drive.google....

<ol>
	<li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry.">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li><li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS&#8211;NRPS.">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS&#8211;NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li><li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering.">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins.">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides.">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li><li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins.">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).</li><li>Bart&#243;k, T., Sz&#233;csi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterh&#225;zy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bart&#243;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li><li>Bart&#243;k, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+(FB1)+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).</li><li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3:+tables+of+microcystins+and+nodularins.">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li><li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blooming+algae:+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria.">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li><li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms:+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes.">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li><li>Mayumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+microcystins+by+LC/MS/MS+under+ion+trap+conditions.">Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions.</a> The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).</li><li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event.">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+(Microcystis+aeruginosa)+under+culture+conditions.">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li><li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins.">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li><li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions:+differences+of+electrospray+ionization/collision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda.">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li><li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science &#38; technology. 48 (4), 2097 (2014).</li></ol>

DFF er en straight-Forward og hurtig strategi til påvisning af hele klasser af forbindelser, især relevant for naturlige produkt sammensatte opdagelse. Det vigtigste aspekt af DFF er at definere de specifikke MS/MS fragmentering kriterier for den målrettede klasse af forbindelser. I dette repræsentative eksempel blev DFF anvendt til at påvise alle Adda-rester indeholdende MCs, der fandtes i et M. aeruginosa -celle ekstrakt. Selv om langt størstedelen af MCs indeholder en Adda-rest, har andre rester på den...

Tandem massespektrometri (MS/MS) er en meget udbredt massespektrometri metode, der involverer isolering af en prækursor og inducerende fragmentering via anvendelse af aktiveringsenergi såsom kollisions induceret afkobling (CID)1. Den måde, hvorpå en ion fragmenter er tæt forbundet med sin molekylære struktur. Naturlige produkter er ofte biosyntetiseret som blandinger af strukturelt lignende forbindelser snarere end som en enkelt unik kemisk2. Strukturelt beslægtede stoffer, der er en del af den samme biosyntetiske klasse, deler ofte centrale MS/MS-fragmenterings karakteristika, herunder fælles produktioner og/eller neutrale tab. Evnen til at screene komplekse prøver for forbindelser, der besidder klasse specifikke produkt ioner og/eller neutrale tab er en stærk strategi til at opdage hele klasser af forbindelser, potentielt fører til opdagelsen af nye naturlige produkter3, 4 af , 5 ) i , 6. i årtier har massespektrometri metoder såsom neutral Loss scanning og forløber ion scanning udført på lav opløsning instrumenter tilladt ioner med samme neutrale tab eller produkt ioner, der skal påvises. De specifikke ioner eller overgange skal dog defineres, før forsøgene udføres. Da massespektrometre med høj opløsning er blevet mere populære i forskningslaboratorier, er komplekse prøver nu almindeligt screenet ved hjælp af ikke-målrettede, data-afhængige erhvervelse (DDA) metoder. I modsætning til traditionelle neutrale tab og prækursor scanning, kan strukturelt beslægtede forbindelser identificeres ved post-erhvervelse analyse7. I dette arbejde, vi demonstrere en strategi, vi har udviklet kaldet diagnostisk fragmentering filtrering (DFF)5,6, en straight-Forward og brugervenlig tilgang til at opdage hele klasser af forbindelser inden for komplekse matricer. Dette DFF modul er blevet implementeret i open source, MZmine 2 platform og tilgængelig ved at downloade MZmine 2,38 eller nyere udgivelser. DFF giver brugerne mulighed for effektivt at screene dda-datasæt for MS/MS spektre, som indeholder produkt ion (er) og/eller neutralt tab (er), der er diagnostiske for hele klasser af forbindelser. En begrænsning af DFF er karakteristiske produkt ioner og/eller neutrale tab for en klasse af forbindelser skal defineres af analytikeren.
For eksempel, hver af de mere end 60 forskellige fumonisin mykotoksiner identificeret8,9 besidder en tricarballylic sidekæde, der genererer en m/z 157,0142 (C6H5O5-) produkt ion ved fragmentering af [M-H]- ion4. Derfor kan alle formodede fumonisiner i en prøve påvises ved hjælp af DFF ved screening af alle MS/MS-spektre i et DDA-datasæt, der indeholder den fremtrædende m/z 157,0142-produkt ion. Tilsvarende kan sulferede forbindelser påvises ved screening af dda-datasæt for MS/MS spektre, der indeholder et diagnostisk neutralt tab på 79,9574 da (so3)3. Denne fremgangsmåde er også blevet anvendt med succes til påvisning af nye cykliske peptider5 og naturlige produkter, der indeholder tryptophan eller phenylalanin rester6.
For at demonstrere effektiviteten af DFF og dets brugervenlighed inden for MZmine-platformen10har vi anvendt denne fremgangsmåde til analyse af mikrocystiner (MCS); en klasse af over 240 strukturelt beslægtede toksiner produceret af ferskvands cyanobakterier11,12,13.
De hyppigst rapporterede cyanotoksiner er MCs, med MC-LR (leucin [L]/Arginine [R]) kongener hyppigst undersøgt (figur 1). MCs er monocycliske ikke-ribosomale heptapeptider, biosyntetiseret af flere cyanobakterier slægter, herunder microcystis, Anabaena, Nostoc, og Planktothrix12,13. MCs består af fem almindelige rester og to variable positioner besat af L-aminosyrer. Næsten alle MCs besidder en karakteristisk β-aminosyre 3-amino-9-methoxy-2, 6, 8-trimethyl-10-phenyldeca-4, 6-dienoinsyre (Adda) rest på position 511.  MS/MS fragmenterings vejene for MCS er godt beskrevet14,15; Adda rester er ansvarlig for de fremtrædende MS/MS produkt ion, m/z 135,0803+ (C9H11O+) samt andre produkt ioner, herunder m/z 163,1114+ (C11H15 O+) (figur 2). Ikke-målrettede DDA-datasæt for Mikrocystis aeruginosa -cellulære ekstrakter kan screenes for alle mikrocystiner, der er til stede ved hjælp af disse diagnostiske ioner, da mikrocystinerne har en Adda-rest.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td>
			<td>CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE</td>
			<td>CPCC300</td>
			<td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteowizard (software)</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mzmine 2</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://mzmine.github.io/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipped with HESI ionization source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1290 UHPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with binary pump, autosampler, column compartment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959757-902</td>
			<td>Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 &#215; 100 mm, 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LC-MS grade Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Water</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade Formic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-772-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber HPLC vials 2 mL/caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716/5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m PTFE syringe filters</td>
			<td>Pall Corp.</td>
			<td>4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1820047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA media (pH 8.6) ( quantity / L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watanabe, M. F. &#38; Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)&#183;4H2O, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4, 40 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium glycerophosphate, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3, 20 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine, 500 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES1151B-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P(IV) metal solution, 5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bring the following to 1 L with ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaEDTA&#183;2HO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3 &#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3061-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis

Naturlige produkter er ofte biosyntetiseret som blandinger af strukturelt lignende forbindelser, snarere end en enkelt forbindelse. På grund af deres fælles strukturelle træk, mange forbindelser inden for samme klasse gennemgår samme MS/MS fragmentering og har flere identiske produkt ioner og/eller neutrale tab. Formålet med diagnostisk fragmentering filtrering (DFF) er effektivt at detektere alle forbindelser af en given klasse i en kompleks ekstrakt ved screening ikke-målrettede LC-MS/MS datasæt for MS/MS spektre, der indeholder klasse specifikke produkt ioner og/eller neutrale tab. Denne metode er baseret på et DFF modul implementeret i open source MZmine platform, der kræver prøveekstrakter analyseres ved data-afhængige erhvervelse på en høj opløsning massespektrometer såsom firpol Orbitrap eller firpolet Time-of-Flight masse Analysatorer. Den vigtigste begrænsning af denne tilgang er analytikeren skal først definere, hvilke produkter ioner og/eller neutrale tab er specifikke for den målrettede klasse af naturlige produkter. DFF giver mulighed for efterfølgende opdagelse af alle relaterede naturprodukter i en kompleks prøve, herunder nye forbindelser. I dette arbejde, vi demonstrere effektiviteten af DFF ved screening ekstrakter af microcystis aeruginosa, en fremtrædende skadelige alge flor forårsager cyanobakterier, til produktion af mikrocystiner.

Det DFF-plot, der genereres efter analysen af M. aeruginosa CPCC300, er vist i figur 4. X-aksen i dette plot er m/z af prækurierne, der opfyldte de definerede DFF-kriterier, mens y-aksen viser m/z af alle produkt ioner inden for MCS MS/MS Spectra. Til denne analyse omfattede kriterierne for MC-detektion prækurioner inden for m/z -intervallet på 440-1200, retentionstider mellem 2,00 – 6.00 min. Vigtigs...

Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

Diagnostisk fragmentering filtrering, implementeret i MZmine, er en elegant, post-erhvervelse tilgang til skærmen LC-MS/MS datasæt for hele klasser af både kendte og ukendte naturlige produkter. Dette værktøj søger MS/MS spektre for produkt ioner og/eller neutrale tab, at analytikeren har defineret som værende diagnostisk for hele klassen af forbindelser.

Naturprodukt opdagelse med LC-MS/MS diagnostisk fragmentering filtrering: ansøgning om Microcystin analyse

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

Naturlige produkter er ofte biosyntetiseret som en klasse af forbindelser, og ikke som et enkelt produkt. Diagnostisk fragmentering filtrering er en enkel tilgang til påvisning af alle strukturelt beslægtede forbindelser i en kompleks blanding. Diagnostisk fragmentering filtrering, der gennemføres i MZmine software, gør det muligt for analytikeren at udforske massespektrometri datasæt for nye naturlige produkter, der ellers ville blive savnet.Dette omfatter nye bioprodukter, og også nye toksiner. Diagnostisk fragmentering filtrering, der anvendes på toksin klasser, der forurener mad og vand, kan informere eksponering vurderinger. Når det anvendes på mikrobielle og planteekstrakter, det kan resultere i opdagelsen af nye forbindelser.Brug af diagnostisk fragmenteringsfiltrering kræver en forståelse af de vigtigste tandemmassespektrometrifunktioner, der definerer en kemisk klasse. Det betyder, at strukturelt lignende forbindelser vil generere karakteristiske ioner. Jeg hedder Shawn Hoogstra.Jeg er forskningstekniker og softwareudvikler i vores center, og jeg vil demonstrere proceduren. Til fremstilling af en prøve til mikrocystinanalyse skal der under aseptiske forhold inokuleres 30 milliliter sterilt cyanobakteriervækstmedium til ca. fem gange-10-til-femte celler pr. milliliter under aseptiske forhold i 250 milliliter Erlenmeyerkolber, hvor celletætheden overvåges med et hæmocytometer. Efter 26 dages fotoautotrofisk kultur, belyst med køligt hvidt fluorescerende lys ved hjælp af et 12-timers lysmørk regime ved 27 grader Celsius, med hvirvlende en gang dagligt, skal du bruge 47-milliliter diameter GF/ C glas mikrofiber filter papirer til at adskille cellerne fra kulturmediet ved vakuumfiltrering.Tilsæt tre milliliter 80% methanol til de høstede celler i 14-milliliter reagensglas, og vortex og efterfølgende sonikere hvert rør i 30 sekunder. Efter sonikering skal prøverne lyses med tre på hinanden følgende en time, minus-20 grader celsius fryse, og 15-minutters stuetemperatur tø cykler, og filtrere hver resulterende cyanobakterier celle ekstrakt gennem individuelle 0,22-mikrometer polytetrafluorethylen sprøjte filtre. Ved hjælp af en blid strøm af nitrogen gas, tør ekstrakterne med en fordamper ved 30 grader Celsius, og gemme ekstrakter tørre ved minus-20 grader Celsius.For analyse af flydende kromatografi tandemmassespektrometri skal de tørrede restkoncentrationer, der skal analyseres, rekonstitueres med 500 mikroliter på 90 % methanol, og prøverne i vortex i 30 sekunder. Overføres til et gult højtryksvæskekromatografiglas. Analysér derefter cyanobakterierekstraktet ved hjælp af en dataafhængig anskaffelsesmetode på et massespektrometer med høj opløsning i henhold til standardprotokoller.De fleste mikrocystiner indeholder en ATA-rest, der producerer to diagnostiske produktioner i tandemmassespektrometri, M til Z 135.0803 og 163.1114. For ikke-målrettet flydende kromatografi tandem massespektrometri datasæt forberedelse, åbne MZmine 2, og vælg Raw data import "under Raw data metoder"drop-down menu. Vælg derefter datafilerne fra microcystin-analysen, og vælg det maksimale plukfilter for at anvende en centroidingalgoritme, der leveres af leverandører.I forbindelse med filtrering af diagnosticeringsfragmentering eller DFF af de importerede dataafhængige anskaffelsesfiler skal du bruge markøren til at fremhæve datafilerne og åbne rullemenuen Visualisering", for at vælge indstillingen DFF. I dff-dialogboksen, der vises, skal du indtaste de forskellige retentionstider og -minutter, hvor den målrettede klasse af analysander vil blive elute, og for at finde masse-til-afgift-forholdet for den målrettede klasse af analysander, herunder muligheden for flere ladede forbindelser, når det er relevant. Indgangen til massenedyspektrometriens agenlighed ved den opnåelige tandemmasse i massespektrometriinstrumentet, og de klassespecifikke produktioner i masse-til-afgift-forholdet indføres.De klassespecifikke neutrale tab ind, og definer minimumsintensiteten for diagnostiske produktioner og/eller neutrale tab, der skal betragtes som en procentdel af basistoppen for tandemmassespektrometrispektre. Vælg derefter en sti og et filnavn for at udskrive resultaterne, og klik på OK"for at starte DFF. Der vises et DFF-plot, når installationen er fuldført.Analytikeren skal fortolke tandem massespektre af kendte forbindelser inden for en sammensat klasse for at identificere de produktioner og/eller neutrale tab, der er diagnostiske for hele klassen af forbindelser. Dette DFF-plot blev genereret efter analysen af M.aeruginosa CPCC 300. X-aksen repræsenterer dette masse-til-lade-forhold mellem prækursorionioner, der opfyldte de definerede DFF-kriterier, mens y-aksen viser masse-til-lade-forholdet mellem alle produktionerne inden for tandemmassespektrometrispektre.Til denne analyse omfattede kriterierne for mikrocystindetektion prækursorioner i masse-til-afgift-forholdet på 400 til 1, 200 og retentionstider mellem to og seks minutter. Vigtigst af alt indeholdt disse tandemmassespektrometrispektre både masse-til-afgift-forhold over den definerede tærskelværdi for basistopintensitet på 15 %. Af de 4, 116 tandem massespektrometrispektre erhvervet under analysen opfyldte 26 DFF-kriterierne og blev påvist i M.aeruginosa CPCC 300-ekstraktet.De vigtigste mikrocystiner opdaget kunne trygt tildeles som microcystin leucin arginin og demethyleret aspartic syre microcystin leucin arginin. Som nye forbindelser opdages ved hjælp af diagnostiske fragmentering filtrering, organismerne kan dyrkes i stor skala for isolation og karakterisering af forbindelserne ved NMR. Når det anvendes på microcystins, diagnostisk fragmentering filtrering giver os mulighed for at afgøre, om traditionelle målrettede screening metoder er at opdage de vigtigste toksiner til stede i en prøve.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR spektroskopi som et robust værktøj til Rapid Evaluering af Lipid Profil af fiskeolie kosttilskud

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Integration af miniaturiseret fastfaseekstraktion og LC-MS / MS-detektion af 3-nitrotyrosin i human urin til kliniske applikationer

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Minimum Burning Pressures of Water-based Emulsion Explosives

Minimum brændende pres af vandbaseret Emulsion sprængstoffer

This manuscript describes a protocol to measure the minimum pressure required for sustained burning of water-based emulsion explosives. Pumping ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Ånde samling fra børn til sygdom biomarkør opdagelse

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

En to-trins pyrolyse-gaskromatografi metode med massespektrometrisk detektion til identifikation af tatovering blæk ingredienser og forfalskede produkter

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Anvendelse af spænding i dynamisk lysspredning partikelstørrelse analyse

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Syntese af Aptamer-PEI-g-PEG Modificeret Guld Nanopartikler Fyldt med Doxorubicin for målrettet drug delivery

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomprøvesprængningsmikroskopi kombineret med infrarød spektroskopi som et værktøj til sonde enkelt bakteriekemi

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

Nanopartikelsporingsanalyse af guldnanopartikler i vandige medier gennem en sammenligning mellem laboratorier

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Preparation of Nanoparticles for ToF-SIMS and XPS Analysis

Forberedelse af nanopartikler til ToF-SIMS- og XPS-analyse

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, ...