Name: natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00
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Les auteurs remercient Heather Roshon (Centre canadien de culture phycologique de l’Université de Waterloo pour avoir fourni la culture des cyanobactéries étudiées et sawsan Abusharkh (Université Carleton) pour l’assistance technique.

1. préparation des ensembles de données de chromatographie en phase liquide non ciblées (LC)-MS/MS
Remarque: le DFF peut être effectué à l’aide d’un spectromètre de masse à haute résolution et d’une méthode analytique optimisée pour une classe cible d’analytes. Les conditions LC-MS/MS optimisées pour MC sur le spectromètre de masse Orbitrap sont répertoriées dans le tableau des matériaux.
<ol><li>
Téléchargement de MZmine 2 (http:...

<ol>
	<li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry.">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li><li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS&#8211;NRPS.">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS&#8211;NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li><li>Kelman, M. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blooming+algae:+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria.">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li><li>Carmichael, W. W., Boyer, G. 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DFF est une stratégie directe et rapide pour la détection de classes entières de composés, particulièrement pertinent pour la découverte de composés naturels de produits. L’aspect le plus important de la DFF est de définir les critères spécifiques de fragmentation MS/MS pour la classe ciblée de composés. Dans cet exemple représentatif, le DFF a été utilisé pour détecter tous les résidus d’Adda contenant des MCs présents dans un extrait cellulaire de M. aeruginosa . Bien que la grande major...

La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) est une méthode de spectrométrie de masse largement utilisée qui consiste à isoler union précurseur et à induire la fragmentation par l’application d’énergie d’activation telle que la dissociation induite par collision (CID)1. La manière dont un fragment d’ion est intimement lié à sa structure moléculaire. Les produits naturels sont souvent biosynthétisés comme des mélanges de composés structurellement similaires plutôt que comme un seul produit chimique unique2. En tant que tels, les composés structurellement apparentés qui font partie de la même classe biosynthétique partagent souvent les principales caractéristiques de fragmentation des MS/MS, y compris les ions de produit partagés et/ou les pertes neutres. La capacité à échantillonne des échantillons complexes pour des composés qui possèdent des ions de produit spécifiques à la classe et/ou des pertes neutres est une stratégie puissante pour détecter des classes entières de composés, conduisant potentiellement à la découverte de nouveaux produits naturels3, le 4 , 5 la plupart des , 6. pendant des décennies, des méthodes de spectrométrie de masse telles que la numérisation des pertes neutres et l’analyse des ions précurseurs effectuées sur des instruments à faible résolution ont permis de détecter les ions ayant les mêmes ions de perte ou de produit neutre. Cependant, les ions ou les transitions spécifiques devaient être définis avant d’effectuer les expériences. Comme les spectromètres de masse à haute résolution sont devenus plus populaires dans les laboratoires de recherche, les échantillons complexes sont maintenant couramment examinés en utilisant des méthodes d’acquisition non ciblées, dépendantes des données (DDA). Contrairement à la perte neutre traditionnelle et à la numérisation des ions précurseurs, les composés structurellement apparentés peuvent être identifiés par l’analyse post-acquisition7. Dans ce travail, nous démontrons une stratégie que nous avons développée appelée filtrage de fragmentation diagnostique (DFF)5,6, une approche simple et conviviale pour détecter des classes entières de composés dans des matrices complexes. Ce module DFF a été mis en œuvre dans la plate-forme open-source, MZmine 2 et disponible en téléchargeant MZmine 2,38 ou des versions plus récentes. DFF permet aux utilisateurs d’écran efficacement les jeux de données DDA pour les spectres MS/MS qui contiennent des ions de produit (s) et/ou des pertes neutres qui sont diagnostiques pour des classes entières de composés. Une limitation de DFF est des ions produits caractéristiques et/ou des pertes neutres pour une classe de composés doivent être définies par l’analyste.
Par exemple, chacune des plus de 60 différentes mycotoxines fumonisines identifiées8,9 possèdent une chaîne latérale tricarballylic, qui génère union de produit m/z 157,0142 (C6H5O5-) sur fragmentation du [M-H]- ion4. Par conséquent, toutes les fumonisines putatives d’un échantillon peuvent être détectées à l’aide de DFF en criblant tous les spectres MS/MS dans un jeu de données DDA contenant l’ion de produit m/z 157,0142 en évidence. De même, les composés sulfatés peuvent être détectés en criblage de jeux de données DDA pour les spectres MS/MS qui contiennent une perte diagnostique neutre de 79,9574 da (SO3)3. Cette approche a également été appliquée avec succès pour la détection de nouveaux peptides cycliques5 et des produits naturels qui contiennent des résidus de tryptophane ou de phénylalanine6.
Pour démontrer l’efficacité de la DFF et sa facilité d’utilisation au sein de la plate-forme MZmine10, nous avons appliqué cette approche à l’analyse des microcystines (MCS); une classe de plus de 240 toxines structurellement apparentées produites par les cyanobactéries d’eau douce11,12,13.
Les cyanotoxines les plus couramment signalées sont des MCs, avec le congénère MC-LR (leucine [L]/arginine [R]) le plus fréquemment étudié (figure 1). Les MCs sont des heptapeptides monocycliques non ribosomiques, biosynthétisés par plusieurs genres de cyanobactéries, dont Microcystis, Anabaena, Nostoc et Planktothrix12,13. Les MCs sont composés de cinq résidus communs et de deux positions variables occupées par les acides aminés L. Presque tous les MCs possèdent un résidu caractéristique de l’acide β-amino-3-amino-9-méthoxy-2, 6, 8-triméthyl-10-phényldéca-4, 6-diénoïque (Adda) à la position 511.  Les voies de fragmentation MS/MS des MCS sont bien décrites14,15; le résidu Adda est responsable de l’ion de produit MS/MS, m/z 135,0803+ (c9h11O+), ainsi que d’autres ions produits, y compris m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (figure 2). Les ensembles de données DDA non ciblés des extraits cellulaires de Microcystis aeruginosa peuvent être examinés pour toutes les microcystines présentes à l’aide de ces ions diagnostiques, étant donné que les microcystines ont un résidu Adda.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td>
			<td>CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE</td>
			<td>CPCC300</td>
			<td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteowizard (software)</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mzmine 2</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://mzmine.github.io/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipped with HESI ionization source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1290 UHPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with binary pump, autosampler, column compartment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959757-902</td>
			<td>Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 &#215; 100 mm, 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LC-MS grade Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Water</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade Formic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-772-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber HPLC vials 2 mL/caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716/5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m PTFE syringe filters</td>
			<td>Pall Corp.</td>
			<td>4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1820047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA media (pH 8.6) ( quantity / L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watanabe, M. F. &#38; Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)&#183;4H2O, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4, 40 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium glycerophosphate, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3, 20 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine, 500 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES1151B-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P(IV) metal solution, 5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bring the following to 1 L with ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaEDTA&#183;2HO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3 &#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3061-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis

Les produits naturels sont souvent biosynthétisés comme des mélanges de composés structurellement similaires, plutôt qu’un seul composé. En raison de leurs caractéristiques structurelles communes, de nombreux composés au sein de la même classe subissent une fragmentation MS/MS similaire et ont plusieurs ions de produit identiques et/ou des pertes neutres. Le but du filtrage de fragmentation diagnostique (DFF) est de détecter efficacement tous les composés d’une classe donnée dans un extrait complexe en criblant des jeux de données LC-MS/MS non ciblés pour les spectres MS/MS qui contiennent des ions de produit spécifiques à la classe et/ou des pertes neutres. Cette méthode est basée sur un module DFF implémenté dans la plate-forme open-source MZmine qui nécessite l’analyse d’extraits d’échantillons par acquisition dépendante des données sur un spectromètre de masse à haute résolution tel que l’Orbitrap quadrupolaire ou la masse de temps de vol quadrupolaire Analyseurs. La principale limitation de cette approche est l’analyste doit d’abord définir quels ions de produit et/ou pertes neutres sont spécifiques pour la classe ciblée de produits naturels. DFF permet la découverte subséquente de tous les produits naturels connexes dans un échantillon complexe, y compris les nouveaux composés. Dans ce travail, nous démontrons l’efficacité de la DFF en criblant des extraits de Microcystis aeruginosa, une floraison algale nocive importante causant des cyanobactéries, pour la production de microcystines.

Le tracé DFF généré suite à l’analyse de M. aeruginosa CPCC300 est illustré à la figure 4. L’axe xde cette parcelle est le m/z des ions précurseurs qui satisfont aux critères DFF définis tandis que l’axe ymontre le m/z de tous les ions de produit dans les spectres MS/MS MCS. Pour cette analyse, les critères de détection des MC comprenaient des ions précurseurs dans la gamme m/z de 440-12...

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Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

Le filtrage de fragmentation diagnostique, implémenté dans MZmine, est une approche élégante et post-acquisition pour filtrer les jeux de données LC-MS/MS pour des classes entières de produits naturels connus et inconnus. Cet outil recherche les spectres MS/MS pour les ions produits et/ou les pertes neutres que l’analyste a définies comme étant diagnostiques pour l’ensemble de la classe de composés.

Découverte de produits naturels avec filtrage de fragmentation diagnostique LC-MS/MS: application pour l’analyse microcystine

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

Les produits naturels sont souvent biosynthésisés comme une classe de composés, et non comme un seul produit. Le filtrage diagnostique de fragmentation est une approche simple pour détecter tous les composés structurellement liés dans un mélange complexe. Le filtrage de la fragmentation diagnostique, implémenté dans le logiciel MZmine, permet à l’analyste d’explorer des ensembles de données de spectrométrie de masse pour de nouveaux produits naturels qui, autrement, seraient manqués.Cela inclut de nouveaux bioproduits, ainsi que de nouvelles toxines. Le filtrage diagnostique de fragmentation, appliqué aux classes de toxines qui contaminent les aliments et l’eau, peut éclairer les évaluations de l’exposition. Lorsqu’il est appliqué sur des extraits microbiens et végétaux, il peut entraîner la découverte de nouveaux composés.L’utilisation du filtrage à fragmentation diagnostique exige une compréhension des principales caractéristiques de spectrométrie de masse tandem qui définissent une classe chimique. Cela signifie que des composés structurellement similaires généreront des ions caractéristiques. Je m’appelle Shawn Hoogstra.Je suis un technicien de recherche et développeur de logiciels à notre centre, et je vais démontrer la procédure. Pour préparer un échantillon pour l’analyse de la microcystine, inoculer 30 millilitres de cyanobactéries stériles de croissance moyenne à environ cinq fois-10-à-la-cinquième cellules par millilitre, dans des conditions aseptiques, dans des flacons Erlenmeyer de 250 millilitres, la surveillance de la densité cellulaire avec un hemocytomètre. Après 26 jours de culture photoautotrophique, éclairés par une lumière fluorescente blanche fraîche utilisant un régime clair-foncé de 12 heures à 27 degrés Celsius, avec tourbillonnant une fois par jour, utilisez des papiers filtres en microfibre en verre GF/C de 47 millilitres de diamètre pour séparer les cellules du milieu de culture par filtration sous vide.Ajouter trois millilitres de 80% de méthanol aux cellules récoltées dans des tubes à essai de 14 millilitres, et vortex et sonifier par la suite chaque tube pendant 30 secondes. Après la sonication, lyse les échantillons avec trois cycles consécutifs de gel d’une heure, moins-20 degrés Celsius, et 15 minutes cycles de dégel de température ambiante, et filtrer chaque extrait de cellules cyanobactéries résultant par des filtres individuels de seringue de polytétrafluoroethylène de 0,22 micromètre. À l’aide d’un doux flux de gaz azoté, séchez les extraits à l’aide d’un évaporateur à 30 degrés Celsius et stockez les extraits à sec à moins-20 degrés Celsius.Pour l’analyse de spectrométrie de masse en tandem chromatographie liquide, reconstituer les résidus séchés à analyser avec 500 microlitres de 90% de méthanol, et vortex les échantillons pendant 30 secondes. Transférer dans un flacon de chromatographie liquide haute pression ambrée. Analysez ensuite l’extrait de cyanobactéries à l’aide d’une méthode d’acquisition dépendante des données sur un spectromètre de masse haute résolution selon les protocoles standard.La plupart des microcystines contiennent un résidu d’ATA qui produit deux ions de produit diagnostiques dans la spectrométrie de masse tandem, M par Z 135.0803, et 163.1114. Pour la chromatographie liquide non ciblée tandem spectrométrie de masse préparation ensemble de données, ouvrir MZmine 2, et sélectionnez Raw data import"under Raw data methods"drop-down menu. Sélectionnez ensuite les fichiers de données à partir de l’analyse de la microcystine, et sélectionnez le filtre de sélection de pointe pour appliquer un algorithme de centroïde fourni par le fournisseur.Pour le filtrage de fragmentation diagnostique, ou DFF, des fichiers d’acquisition dépendants des données importés, utilisez le curseur pour mettre en surbrillance les fichiers de données et ouvrez le menu visualisation « drop-down » pour sélectionner l’option DFF. Dans la boîte de dialogue DFF qui apparaît, entrez la plage de temps et de minutes de rétention lorsque la classe ciblée d’analytes s’élit, et pour trouver la plage de ratio masse-charge de la classe ciblée d’analytes, y compris la possibilité de plusieurs composés chargés le cas échéant. Entrez la précision de masse de spectrométrie de masse tandem réalisable de l’instrument de spectrométrie de masse et entrez les ions de produit spécifiques à la classe du rapport masse-charge.Entrez les pertes neutres propres à la classe et définissez l’intensité minimale des ions de produits diagnostiques et/ou des pertes neutres à considérer comme un pourcentage du pic de base des spectres de spectrométrie de masse tandem. Sélectionnez ensuite un chemin et un nom de fichier pour produire les résultats et cliquez sur OK"pour démarrer le DFF. Un terrain DFF apparaîtra à la suite d’une fin réussie de la configuration.L’analyste doit interpréter les spectres de masse tandem de composés connus au sein d’une classe composée pour identifier les ions du produit et/ou les pertes neutres qui sont diagnostiques pour toute la classe de composés. Cette parcelle DFF a été générée à la suite de l’analyse de M.aeruginosa CPCC 300. L’axe x représente ce rapport masse-charge des ions précurseurs qui satisfaisaient aux critères définis du DFF, tandis que l’axe y montre le rapport masse-charge de tous les ions produits dans les spectres de spectrométrie de masse tandem de microcystines.Pour cette analyse, les critères de détection de la microcystine comprenaient des ions précurseurs dans le rapport masse-charge de 400 à 1 200 et des temps de rétention entre deux et six minutes. Plus important encore, ces spectres de spectrométrie de masse tandem contenaient les deux ratios masse-charge supérieurs au seuil d’intensité maximale de base défini de 15 %. Sur les 4 116 spectres de spectrométrie de masse tandem acquis au cours de l’analyse, 26 satisfaisaient aux critères du DFF et ont été détectés dans l’extrait M.aeruginosa CPCC 300.Les principales microcystines détectées pourraient être assignées en toute confiance sous forme d’arginine de leucine de microcystine et de microcystine d’acide aspartique déméthylique lucine arginine. Au fur et à mesure que de nouveaux composés sont découverts à l’aide du filtrage diagnostique de la fragmentation, les organismes peuvent être cultivés à grande échelle pour l’isolement et la caractérisation des composés par NMR. Lorsqu’il est appliqué aux microcystines, le filtrage diagnostique de fragmentation nous permet de déterminer si les méthodes traditionnelles de dépistage ciblées détectent les principales toxines présentes dans un échantillon.

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