Name: natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

המחברים מודים הת רושון (מרכז התרבות Phycological הקנדי, אוניברסיטת ווטרלו על מתן התרבות הקיבקקטריה למד וסורסאן אבושרף (אוניברסיטת קרפלטון) לקבלת סיוע טכני.

1. הכנת כרומטוגרפיה בלתי ממוקדת (LC)-ערכות נתונים MS/MS
הערה: DFF ניתן לבצע באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה ושיטה אנליטית ממוטבת עבור מחלקת היעד של האנליטים. התנאים של מיטוב LC-MS/MS על ספקטרומטר המסה של אורדרראפ מפורטים בטבלת החומרים.
<ol><li>
הורדת MZmine 2 (http://mz...

<ol>
	<li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry.">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li><li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS&#8211;NRPS.">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS&#8211;NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li><li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering.">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins.">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides.">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li><li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins.">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).</li><li>Bart&#243;k, T., Sz&#233;csi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterh&#225;zy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bart&#243;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li><li>Bart&#243;k, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+(FB1)+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).</li><li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3:+tables+of+microcystins+and+nodularins.">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li><li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blooming+algae:+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria.">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li><li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms:+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes.">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li><li>Mayumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+microcystins+by+LC/MS/MS+under+ion+trap+conditions.">Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions.</a> The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).</li><li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event.">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+(Microcystis+aeruginosa)+under+culture+conditions.">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li><li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins.">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li><li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions:+differences+of+electrospray+ionization/collision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda.">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li><li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science &#38; technology. 48 (4), 2097 (2014).</li></ol>

DFF היא אסטרטגיה ישר-קדימה ומהירה לזיהוי מחלקות שלמות של תרכובות, רלוונטיות במיוחד עבור גילוי מתחם טבעי מוצר. ההיבט החשוב ביותר של DFF הוא הגדרת קריטריונים ספציפיים MS/MS הפיצול עבור המעמד המיועד של תרכובות. בדוגמה זו, השתמשו ב-DFF כדי לאתר את כל שאריות Adda המכילים מחשבי MCs בתמצית סלולרית של M. aerug...

טנדם המסה (MS/MS) היא בשימוש נרחב ספקטרומטר מסה שיטה הכוללת בידוד יון מקודמת וגורם לפיצול באמצעות יישום של אנרגיה הפעלה כגון התנגשות המושרה (CID)1. האופן שבו שברי יונים מקושרים בצורה אינטימית למבנה המולקולרי שלו. מוצרים טבעיים הם לעתים קרובות biosynthesized סונתז תערובות של תרכובות דומות מבנית ולא כמו כימיקל יחיד ייחודי2. ככאלה, תרכובות קשורות מבנית המהווים חלק מאותה מחלקה biosynthetic לעתים קרובות לשתף מאפיינים מרכזיים MS/MS הפיצול, כולל יוני מוצרים משותפים ו/או הפסדים ניטרליים. היכולת להקרין דגימות מורכבות עבור תרכובות בעלות יוני מוצר ספציפיים לכיתה ו/או הפסדים ניטרליים היא אסטרטגיה רבת עוצמה כדי לזהות מחלקות שלמות של תרכובות, שעשויות להוביל לגילוי של מוצרים טבעיים חדשים3, ד , מיכל 5 , 6. במשך עשרות שנים, שיטות ספקטרומטר המסה כגון סריקת הפסד נייטרלי וסריקת יון מקודמות שבוצעו על מכשירים ברזולוציה נמוכה אפשרה יונים עם הפסד נייטרלי או יוני מוצר זהים להתגלות. עם זאת, היונים או המעברים הספציפיים הנחוצים להגדרה לפני ביצוע הניסויים. כאשר ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה הפכו לפופולריים יותר במעבדות מחקר, דוגמאות מורכבות מוקרן כעת בדרך כלל באמצעות שיטות רכישה לא ממוקדות ותלויות נתונים. בניגוד לאובדן נייטרלי מסורתי סריקת יון מקודמן, תרכובות קשורות מבנית ניתן לזהות על ידי ניתוח לאחר הרכישה7. בעבודה זו, אנו מוכיחים אסטרטגיה שפיתחנו לסנן פיצול אבחון (dff)5,6, ישר קדימה וידידותי למשתמש גישה לזהות מחלקות שלמות של תרכובות בתוך מטריצות מורכבות. מודול DFF זה כבר יושם לתוך מקור פתוח, MZmine 2 פלטפורמת והוא זמין על ידי הורדת MZmine 2.38 או מהדורות חדשות יותר. DFF מאפשר למשתמשים למסך ביעילות את מערכות הנתונים של ד. א. ל. (MS/MS ספקטרה המכילים את יון מוצר (ים) ו/או הפסד נייטרלי (es) כי הם אבחון עבור כיתות שלמות של תרכובות. מגבלה של DFF הוא יונים אופייניים מוצר ו/או הפסדים ניטרליים עבור מחלקה של תרכובות חייב להיות מוגדר על ידי האנליסט.
לדוגמה, כל אחד יותר מ 60 שונים של fumonisin פטרת מזוהה8,9 בעלי שרשרת של tricarballylic אשר יוצר m/z 157.0142 (C6H5O5-) מוצר יון על פיצול של [M-H]- יון4. לכן, כל pumonisins במדגם ניתן לזהות באמצעות DFF על ידי הקרנת כל MS/MS ספקטרום בתוך ערכת נתונים של לוד המכילים את הבולטים m/z 157.0142 המוצר יון. באופן דומה, תרכובות sulfated ניתן להבחין על ידי הקרנת מגדיר הנתונים של דה לטרשת נפוצה/ms המכילים אובדן ניטרלי אבחון של 79.9574 Da (SO3)3. גישה זו גם הוחל בהצלחה לגילוי חדש פפטידים מחזורי5 ומוצרים טבעיים המכילים טריפטופן או שאריות פנילאלטין6.
כדי להדגים את האפקטיביות של DFF ואת קלות השימוש שלה בתוך פלטפורמת MZmine10, החלתי גישה זו לניתוח microcystins (mcs); מחלקה של מעל 240 רעלים הקשורים מבחינה מבנית המיוצר על ידי כחוליות מים מתוקים11,12,13.
מרבית הרעלים שדווחו הם MCs, עם MC-LR (לאוצין [L]/arginine [R]) congener לרוב למדו (איור 1). מחשבי MCs הם מונלוציציתיים שאינם הריבוזומפיים, ביוסינתזה על ידי מספר סייאובקטריה כולל מיקרוצילסטיס, אננינה, Nostoc, ו- plankto,12. מחשבי MCs מורכבים מחמישה שאריות משותפים ושני תנוחות משתנה שנכבשו על ידי חומצות אמינו. כמעט כל MCs בעלי מאפיין β-אמינו חומצה 3-אמינו-9-מתיונין-2, 6, 8-triמתיק-10-פנילdeca-4, 6-חומצה dienoic (Adda) שאריות בעמדה 511.  משעולים הפיצול ms/ms של mcs מתוארים היטב14,15; שאריות adda אחראי יון מוצר ms/ms בולטים, m/z 135.0803+ (C9H11O+) כמו גם יוני מוצרים אחרים כולל m/z 163.1114+ (C11H15 O+) (איור 2). לא ממוקד הנתונים של מערכת המידע הנייד של מיקרוצילף שניתן להציג עבור כל microcystins הנמצאים באמצעות יוני אבחון אלה, והעניק כי המיקרוcystins יש שאריות adda.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td>
			<td>CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE</td>
			<td>CPCC300</td>
			<td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteowizard (software)</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mzmine 2</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://mzmine.github.io/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipped with HESI ionization source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1290 UHPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with binary pump, autosampler, column compartment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959757-902</td>
			<td>Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 &#215; 100 mm, 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LC-MS grade Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Water</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade Formic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-772-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber HPLC vials 2 mL/caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716/5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m PTFE syringe filters</td>
			<td>Pall Corp.</td>
			<td>4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1820047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA media (pH 8.6) ( quantity / L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watanabe, M. F. &#38; Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)&#183;4H2O, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4, 40 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium glycerophosphate, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3, 20 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine, 500 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES1151B-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P(IV) metal solution, 5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bring the following to 1 L with ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaEDTA&#183;2HO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3 &#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3061-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis

מוצרים טבעיים הם לעתים קרובות biosynthesized סונתז תערובות של תרכובות דומות מבנית, ולא מתחם אחד. בשל תכונות מבניות נפוצות שלהם, תרכובות רבות בתוך אותה מחלקה עוברים פיצול MS/MS דומה ויש להם כמה יונים מוצר זהה ו/או הפסדים ניטרליים. המטרה של סינון פיצול אבחון (DFF) היא לזהות ביעילות את כל התרכובות של מחלקה נתונה בתמצית מורכבת על-ידי הקרנת מערכות נתונים מסוג LC-MS/MS לצורך הגדרת מערך MS/ms, המכילות יוני מוצרים ספציפיים למחלקה ו/או הפסדים ניטרליים. שיטה זו מבוססת על מודול DFF מיושם בתוך פלטפורמת MZmine מקור פתוח הדורש תמציות לדוגמה להיות מנותח על ידי רכישה תלוי נתונים על ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה, כגון אוריוראפ פי ארבעה או מאסה פי ארבעה של הטיסה. אנלייזרים. המגבלה העיקרית של גישה זו היא שהאנליסט חייב להגדיר תחילה אילו יוני מוצר ו/או הפסדים ניטרליים הם ספציפיים למעמד היעד של מוצרים טבעיים. DFF מאפשר את הגילוי הבא של כל המוצרים הטבעיים הקשורים במדגם מורכב, כולל תרכובות חדשות. בעבודה זו, אנו מדגימים את האפקטיביות של dff על ידי הקרנת תמציות של מיקרוקילף aeruginosa, בולט פריחת אצות בולטים מזיקים גרימת חיידקים, לייצור של microcystins.

העלילה DFF שנוצרה לאחר ניתוח של M. aeruginosa CPCC300 מוצג באיור 4. ציר ה-xשל מחלקה זו הוא m/z של היונים המקודרים המביעות את קריטריוני ה-dff המוגדרים כאשר ציר ה- yמציג את ה- m/z של כל יוני המוצרים בתוך ספקטרום ה-mcs ms/ms. עבור ניתוח זה, הקריטריונים של זיהו...

Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

סינון פיצול אבחון, מיושם לתוך MZmine, היא גישה אלגנטית, לאחר הרכישה למסך LC-MS/MS datasets עבור מחלקות שלמות של מוצרים טבעיים ידועים ולא ידועים. כלי זה מחפש את MS/MS ספקטרום עבור יוני מוצרים ו/או הפסדים ניטרליים כי האנליסט הגדיר כאבחון עבור המחלקה כולה של תרכובות.

גילוי מוצר טבעי עם סינון פיצול LC-MS/MS: בקשה ניתוח Microcystin

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

מוצרים טבעיים הם לעתים קרובות biosynthesized כמו סוג של תרכובות, ולא כמוצר אחד. סינון פיצול אבחון הוא גישה פשוטה לזיהוי כל התרכובות הקשורות מבנית בתוך תערובת מורכבת. סינון פיצול אבחון, המיושם בתוכנת MZmine, מאפשר לאנליסט לחקור ערכות נתונים ספקטרומטריות מסה עבור מוצרים טבעיים חדשים שאחרת היו מפספסים.זה כולל תוצרים ביולוגיים חדשים, וגם רעלנים חדשים. סינון פיצול אבחון, המוחל על מחלקות רעלנים המזהמות מזון ומים, יכול ליידע הערכות חשיפה. כאשר מוחל על תמציות מיקרוביאלית וצמחים, זה יכול לגרום לגילוי של תרכובות חדשות.שימוש בסינון פיצול אבחון דורש הבנה של תכונות ספקטרומטריית מסת טנדם מרכזיות המגדירות מחלקה כימית. משמעות הדבר היא כי תרכובות דומות מבנית ייצרו יונים אופייניים. שמי שון הוגסטרה.אני טכנאי מחקר ומפתח תוכנה במרכז שלנו, ואני אדגים את ההליך. כדי להכין מדגם לניתוח מיקרוציסטין, לחסן 30 מיליליטר של ציאנובקטריה סטרילית צמיחה בינונית עד כ 5 פעמים-10-the-החמישי תאים למיליליטר, בתנאים אספטיים, ב 250 מיליליטר ארלנזייר flasks, ניטור צפיפות התא עם המוציטמטר. לאחר 26 ימים של תרבות פוטואטוטרופית, מואר עם אור פלואורסצנטי לבן קריר באמצעות משטר 12 שעות בהיר כהה ב 27 מעלות צלזיוס, עם מערבולת פעם ביום, להשתמש 47 מיליליטר קוטר GF / C מיקרופייבר זכוכית ניירות מסנן להפריד את התאים מן מדיום התרבות על ידי סינון ואקום.הוסף שלושה מיליליטר של 80% מתנול לתאים שנקטפו במבחנות 14 מיליליטר, ומערבולת ולאחר מכן sonicate כל צינור במשך 30 שניות. לאחר sonication, lyse את הדגימות עם שלוש שעה אחת רצופה, מינוס 20 מעלות צלזיוס להקפיא, ו 15 דקות טמפרטורת החדר להפשיר מחזורים, ולסנן כל תמצית תא ציאנובקטריה וכתוצאה מכך באמצעות מסנני מזרק פוליטרא-פוליאלורואתילן בודדים 0.22 מיקרומטר. בעזרת זרם עדין של גז חנקן, ייבשו את התמציות עם אידוי ב-30 מעלות צלזיוס, ואחסנו את התמציות יבשות במינוס 20 מעלות צלזיוס.לניתוח ספקטרומטריית מסת טנדם כרומטוגרפיה נוזלית, יש לבנות מחדש את השאריות המיובשת שיש לנתח עם 500 מיקרוליטרים של 90% מתנול, ומערבולת הדגימות למשך 30 שניות. מעבירים לבקבוקון כרומטוגרפיה נוזלי בלחץ גבוה ענבר. לאחר מכן לנתח את תמצית ציאנובקטריה באמצעות שיטת רכישה תלוית נתונים על ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.רוב המיקרוציסטינים מכילים שאריות ATA המייצרות שני יונים של מוצרי אבחון בספקטרומטריית מסה דו-מושבית, M עד Z 135.0803 ו- 163.1114. להכנת ערכת נתונים של ספקטרומטריית מסה טנדם נוזלית לא ממוקדת, פתחו את MZmine 2 ובחרו ייבוא נתונים גולמיים"תחת שיטות נתונים גולמיות". לאחר מכן בחר את קבצי הנתונים מניתוח המיקרוציסטין ובחר את מסנן איסוף השיא כדי להחיל אלגוריתם centroiding שסופק על-ידי הספק.לסינון פיצול אבחון, או DFF, של קבצי הרכישה המיובאים התלויים בנתונים, השתמש בסמן כדי לסמן את קבצי הנתונים ופתח את התפריט הנפתח 'פריט חזותי' כדי לבחור באפשרות DFF. בתיבת הדו-שיח DFF שמופיעה, הזן את טווח זמני השמירה ודקות שבהם המחלקה הממוקדת של אנליטים תימשך, ולמצוא את טווח יחס המסה-לטעינה של המחלקה הממוקדת של אנליטים, כולל האפשרות עבור תרכובות טעונות מרובות בעת הצורך. הזן את דיוק מסת מסת הדו-מושבית בר השגה של מכשיר ספקטרומטריית המסה, והזן את יונות המוצר הספציפיות לקבוצה של יחס המסה לטעינה.הזן את ההפסדים הניטרליים הספציפיים לקבוצה והגדר את העוצמה המינימלית עבור יווני מוצרי אבחון ו/או הפסדים ניטרליים שייחשבו כאחוז מהשיא הבסיסי של ספקטרומטריית ספקטרומטריית מסת הדו-מושבית. לאחר מכן בחרו נתיב ושם קובץ כדי ליצור פלט של התוצאות ולחצו על הלחצן 'אשר'' כדי להפעיל את ה- DFF. התוויית DFF תופיע עם השלמת ההתקנה בהצלחה.האנליסט חייב לפרש ספקטרום מסה טנדם של תרכובות ידועות בתוך מחלקה מורכבת כדי לזהות את היונים המוצר ו / או הפסדים ניטרליים כי הם אבחון עבור כל המחלקה של תרכובות. עלילה זו DFF נוצרה בעקבות הניתוח של M.aeruginosa CPCC 300. ציר ה- x מייצג יחס מסה-לטעינה זה של היונים המבשרים שהתאימו לקריטריוני ה- DFF המוגדרים, בעוד ציר ה- y מציג את יחס המסה לטעינה של כל היונים של המוצר בתוך ספקטרום ספקטרומטריית מסת הדו-שאדם של המיקרו-cystins.לניתוח זה, הקריטריונים לגילוי מיקרוצסטין כללו היונים המבשרים ביחס המסה לטעינה של 400 עד 1, 200, ושעות שמירה בין שתיים לשש דקות. והכי חשוב, ספקטרום ספקטרומטריית מסת טנדם אלה הכיל את שני יחסי המסה לטעינה מעל לסף עוצמת השיא המוגדר של 15%. מתוך 4, 116 ספקטרום ספקטרומטריית מסה טנדם שנרכש במהלך הניתוח, 26 הסתפקו בקריטריוני DFF וזוהו בתמצית M.aeruginosa CPCC 300.המיקרוציסטינים העיקריים שזוהו יכולים להיות מוקצים בביטחון כמיקרוציסטין לאוצין ארגינין וחומצה אספרטית דמתילציה מיקרוציסטין לאוצין ארגינין. כמו תרכובות חדשות מתגלים באמצעות סינון פיצול אבחון, האורגניזמים ניתן לגדל בקנה מידה גדול לבידוד ואפיון של תרכובות על ידי NMR. כאשר מוחל על microcystins, סינון פיצול אבחון מאפשר לנו לקבוע אם שיטות סינון ממוקדות מסורתיות מזהות את הרעלים העיקריים הקיימים בתוך מדגם.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR ספקטרוסקופיה כמו כלי חזק עבור ההערכה המהירה של פרופיל השומנים של תוספי שמן דגים

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

אינטגרציה של מיצוי שלב מוצק ממוזער ו LC-MS / MS איתור של 3-Nitrotyrosine בשתן האדם עבור יישומים קליניים

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Minimum Burning Pressures of Water-based Emulsion Explosives

מינימום שריפת לחצים של חומרי נפץ אמולסיה על בסיס מים

This manuscript describes a protocol to measure the minimum pressure required for sustained burning of water-based emulsion explosives. Pumping ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

נשימה אוסף ילדים למען גילוי סמן מחלה

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

דו-שלב פירוליזה-גז כרומטוגרפיה שיטה עם זיהוי ספקטרומטרי המוני לזיהוי של החומרים דיו קעקועים מוצרים מזויפים

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

יישום מתח בניתוח מידת החלקיקים של פיזור אור דינמי

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

סינתזה של Aptamer-PEI-g-PEG שונה חלקיקי זהב טעון עם וקסורוביצ'ין עבור משלוח תרופות ממוקדות

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם ספקטרוסקופיית אינפרא אדום ככלי לחקירת כימיה של חיידק יחיד

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

ניתוח מעקב חלקיקים של חלקיקי זהב במדיה מימית באמצעות השוואה בין מעבדות

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Preparation of Nanoparticles for ToF-SIMS and XPS Analysis

הכנת חלקיקים לניתוח ToF-SIMS ו- XPS

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, ...