Name: natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Gli autori ringraziano Heather Roshon (centro di cultura Phycologica canadese, Università di Waterloo per aver fornito la coltura di cianobatteri studiata e Sawsan Abusharkh (Carleton University) per l'assistenza tecnica.

1. preparazione di DataSet di cromatografia liquida non mirata (LC)-MS/MS
Nota: la DFF può essere eseguita utilizzando uno spettrometro di massa ad alta risoluzione e un metodo analitico ottimizzato per una classe di analiti target. Le condizioni LC-MS/MS ottimizzate per MC sullo spettrometro di massa Orbitrap sono elencate nella tabella dei materiali.
<ol><li>
Scaricamento di MZmine 2 (http://mzmine.github.io/) Nota: i dati di esempio CPCC300. RAW pos...

<ol>
	<li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry.">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li><li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS&#8211;NRPS.">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS&#8211;NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li><li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering.">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins.">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides.">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li><li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins.">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).</li><li>Bart&#243;k, T., Sz&#233;csi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterh&#225;zy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bart&#243;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li><li>Bart&#243;k, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+(FB1)+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).</li><li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3:+tables+of+microcystins+and+nodularins.">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li><li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blooming+algae:+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria.">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li><li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms:+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes.">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li><li>Mayumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+microcystins+by+LC/MS/MS+under+ion+trap+conditions.">Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions.</a> The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).</li><li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event.">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+(Microcystis+aeruginosa)+under+culture+conditions.">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li><li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins.">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li><li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions:+differences+of+electrospray+ionization/collision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda.">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li><li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science &#38; technology. 48 (4), 2097 (2014).</li></ol>

DFF è una strategia diretta e rapida per la rilevazione di intere classi di composti, particolarmente rilevanti per la scoperta di composti naturali di prodotti. L'aspetto più importante della DFF è la definizione dei criteri specifici di frammentazione MS/MS per la classe mirata di composti. In questo esempio rappresentativo, DFF è stato utilizzato per rilevare tutti i residui di Adda contenenti MCs presenti in un estratto cellulare M. aeruginosa . Sebbene la stragrande maggioranza dei MCs contenga un resid...

La spettrometria di massa tandem (MS/MS) è un metodo di spettrometria di massa ampiamente utilizzato che comporta l'isolamento di uno ione precursore e l'induzione della frammentazione tramite l'applicazione di energia di attivazione come la dissociazione indotta da collisione (CID)1. Il modo in cui un frammento di ioni è intimamente legato alla sua struttura molecolare. I prodotti naturali sono spesso biosintetizzati come miscele di composti strutturalmente simili piuttosto che come un unico chimico unico2. In quanto tali, i composti strutturalmente correlati che fanno parte della stessa classe biosintetica condividono spesso caratteristiche chiave di frammentazione MS/MS, tra cui ioni di prodotti condivisi e/o perdite neutre. La capacità di schermo campioni complessi per composti che possiedono ioni di prodotti specifici per classe e/o perdite neutre è una potente strategia per rilevare intere classi di composti, potenzialmente portando alla scoperta di nuovi prodotti naturali3, 4 , 5 il , 6. per decenni, metodi di spettrometria di massa come la scansione di perdita neutra e la scansione di ioni precursori eseguite su strumenti a bassa risoluzione hanno consentito agli ioni con la stessa perdita neutra o gli ioni di prodotto da rilevare. Tuttavia, gli ioni o le transizioni specifiche dovevano essere definite prima di eseguire gli esperimenti. Poiché gli spettrometri di massa ad alta risoluzione sono diventati più popolari nei laboratori di ricerca, i campioni complessi sono ora comunemente sottoposti a screening utilizzando metodi di acquisizione dipendenti dai dati non mirati (DDA). Contrariamente alla tradizionale perdita neutra e alla scansione a ioni precursori, i composti strutturalmente correlati possono essere identificati mediante l'analisi post-acquisizione7. In questo lavoro, si dimostra una strategia che abbiamo sviluppato definito filtraggio della frammentazione diagnostica (DFF)5,6, un approccio semplice e facile da usare per rilevare intere classi di composti all'interno di matrici complesse. Questo modulo DFF è stato implementato nella piattaforma open-source MZmine 2 e disponibile scaricando MZmine 2,38 o versioni più recenti. DFF consente agli utenti di seriare in modo efficiente i DataSet DDA per gli spettri MS/MS che contengono ioni di prodotto e/o perdite neutre (es) che sono diagnostiche per intere classi di composti. Una limitazione della DFF è la caratteristica degli ioni di prodotto e/o le perdite neutre per una classe di composti devono essere definite dall'analista.
Ad esempio, ognuna delle più di 60 diverse micotossine fumonisine identificate8,9 possiedono una catena laterale tricarballilico, che genera una m/z 157,0142 (C6H5O5-) prodotto ione su frammentazione della [M-H]- Ion4. Pertanto, tutte le fumonisine putativo in un campione possono essere rilevate utilizzando DFF mediante lo screening di tutti gli spettri MS/MS all'interno di un DataSet DDA che contengono lo ione di prodotto m/z 157,0142 prominente. Analogamente, i composti Solfatati possono essere rilevati mediante screening dei DataSet DDA per gli spettri MS/MS che contengono una perdita diagnostica neutra di 79,9574 da (SO3)3. Questo approccio è stato anche applicato con successo per la rilevazione di nuovi peptidi ciclici5 e prodotti naturali che contengono i residui di triptofano o fenilalanina6.
Per dimostrare l'efficacia del DFF e la sua facilità d'uso all'interno della piattaforma MZmine10, abbiamo applicato questo approccio all'analisi delle microcistine (MCS); una classe di oltre 240 tossine strutturalmente correlate prodotte da acqua dolce cianobatteri11,12,13.
Le cianotossine più comunemente segnalate sono MCs, con il congenitore MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) più frequentemente studiato (Figura 1). Gli MCs sono heptapeptides monociclici non ribosomiali, biosintetizzati da diversi generi di cianobatteri tra cui Microcystis, Anabaena, Nostoc e Planktothrix12,13. Gli MCs sono composti da cinque residui comuni e due posizioni variabili occupate da aminoacidi L. Quasi tutti i MCs possiedono un residuo di acido β-aminoacido 3-ammino-9-metossi-2, 6, 8-trimetil-10-fenildeca-4, 6-dienoico (Adda) alla posizione 511.  I percorsi di frammentazione MS/MS di MCS sono ben descritti14,15; il residuo di Adda è responsabile della prominente ione MS/MS, m/z 135,0803+ (c9h11O+) e di altri ioni di prodotto tra cui m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (Figura 2). I DataSet DDA non mirati degli estratti cellulari Microcystis aeruginosa possono essere proiettati per tutte le microcistine presenti utilizzando questi ioni diagnostici, dato che le microcistine hanno un residuo di Adda.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td>
			<td>CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE</td>
			<td>CPCC300</td>
			<td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteowizard (software)</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mzmine 2</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://mzmine.github.io/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipped with HESI ionization source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1290 UHPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with binary pump, autosampler, column compartment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959757-902</td>
			<td>Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 &#215; 100 mm, 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LC-MS grade Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Water</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade Formic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-772-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber HPLC vials 2 mL/caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716/5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m PTFE syringe filters</td>
			<td>Pall Corp.</td>
			<td>4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1820047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA media (pH 8.6) ( quantity / L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watanabe, M. F. &#38; Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)&#183;4H2O, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4, 40 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium glycerophosphate, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3, 20 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine, 500 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES1151B-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P(IV) metal solution, 5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bring the following to 1 L with ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaEDTA&#183;2HO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3 &#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3061-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis

I prodotti naturali sono spesso biosintetizzati come miscele di composti strutturalmente simili, piuttosto che un singolo composto. A causa delle loro caratteristiche strutturali comuni, molti composti all'interno della stessa classe subiscono una simile frammentazione MS/MS e hanno diversi ioni di prodotto identici e/o perdite neutre. Lo scopo del filtraggio della frammentazione diagnostica (DFF) è quello di rilevare in modo efficiente tutti i composti di una determinata classe in un estratto complesso, vagliando DataSet LC-MS/MS non mirati per gli spettri MS/MS che contengono ioni di prodotti specifici per classe e/o perdite neutre. Questo metodo è basato su un modulo DFF implementato all'interno della piattaforma MZmine open-source che richiede estratti campione essere analizzati da acquisizione dipendente dai dati su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione come quadrupolo Orbitrap o quadrupolo di massa di tempo di volo Analizzatori. La limitazione principale di questo approccio è l'analista deve prima definire quali ioni di prodotto e/o le perdite neutre sono specifici per la classe mirata di prodotti naturali. DFF consente la successiva scoperta di tutti i prodotti naturali correlati all'interno di un campione complesso, compresi i nuovi composti. In questo lavoro, dimostreremo l'efficacia del DFF mediante screening degli estratti di Microcystis aeruginosa, una prominente fioritura algale nociva che causa cianobatteri, per la produzione di microcistine.

Il grafico DFF generato in seguito all'analisi di M. aeruginosa CPCC300 è mostrato in Figura 4. L'asse xdi questa trama è la m/z degli ioni precursori che SODDISFACEVANO i criteri di DFF definiti mentre l'asse yMostra la m/z di tutti gli ioni di prodotto all'interno degli spettri MCS MS/MS. Per questa analisi, i criteri per il rilevamento MC includevano ioni precursori all'interno della gamma m/z di 440-...

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Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

Il filtraggio della frammentazione diagnostica, implementato in MZmine, è un approccio elegante e post-acquisizione per lo schermo di DataSet LC-MS/MS per intere classi di prodotti naturali conosciuti e sconosciuti. Questo strumento ricerca gli spettri MS/MS per gli ioni prodotto e/o le perdite neutre che l'analista ha definito come diagnostica per l'intera classe di composti.

Individuazione di prodotti naturali con filtraggio della frammentazione diagnostica LC-MS/MS: applicazione per l'analisi microcystin

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

I prodotti naturali sono spesso biosintesi come una classe di composti, e non come un singolo prodotto. Il filtraggio diagnostico della frammentazione è un approccio semplice per rilevare tutti i composti strutturalmente correlati all'interno di una miscela complessa. Il filtro a frammentazione diagnostica, implementato all'interno del software MZmine, consente all'analista di esplorare set di dati di spettrometria di massa per nuovi prodotti naturali che altrimenti sarebbero mancati.Ciò include nuovi bioprodutti e anche nuove tossine. Il filtraggio diagnostico della frammentazione, applicato alle classi di tossine che contaminano cibo e acqua, può informare le valutazioni dell'esposizione. Se applicato agli estratti microbici e vegetali, può portare alla scoperta di nuovi composti.L'utilizzo del filtro a frammentazione diagnostica richiede la comprensione delle caratteristiche chiave della spettrometria di massa tandem che definiscono una classe chimica. Ciò significa che composti strutturalmente simili genereranno ioni caratteristici. Mi chiamo Shawn Hoogstra.Sono un tecnico di ricerca e sviluppatore di software presso il nostro centro e darò prova della procedura. Per preparare un campione per l'analisi della microcistina, inoculare 30 millilitri di terreno sterile di crescita dei cianobatteri a circa cinque volte 10-al-quinto cellule per millilitro, in condizioni asettiche, in flaconi Erlenmeyer da 250 millilitri, monitorando la densità cellulare con un emocitometro. Dopo 26 giorni di coltura fotoautotrofica, illuminata con luce fluorescente bianca fredda utilizzando un regime di buio chiaro di 12 ore a 27 gradi Celsius, con vorticoso una volta al giorno, utilizzare carte filtranti in microfibra in vetro GF/C di 47 millilitri di diametro per separare le cellule dal mezzo di coltura mediante filtrazione sottovuoto.Aggiungere tre millilitri di 80% di metanolo alle celle raccolte in provette da 14 millilitri e vortice e successivamente sonicare ogni tubo per 30 secondi. Dopo la sonicazione, liscivia i campioni con tre cicli consecutivi di disgelo di un'ora, meno 20 gradi Celsius e cicli di disgelo a temperatura ambiente di 15 minuti e filtra ogni estratto di cellule cianobatteri risultante attraverso singoli filtri a siringa in politetrafluoroetilene da 0,22 micrometri. Utilizzando un flusso delicato di gas azoto, asciugare gli estratti con un evaporatore a 30 gradi Celsius e conservare gli estratti asciutti a meno 20 gradi Celsius.Per l'analisi della spettrometria di massa tandem cromatografica liquida, ricostituire il residuo essiccato da analizzare con 500 microlitri di metanolo al 90% e vortice i campioni per 30 secondi. Trasferire in una fiala di cromatografia liquida ad alta pressione ambrata. Quindi analizzare l'estratto di cianobatteri utilizzando un metodo di acquisizione dipendente dai dati su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione secondo protocolli standard.La maggior parte delle microcistina contiene un residuo ATA che produce due ioni di prodotto diagnostico in spettrometria di massa tandem, da M a Z 135.0803 e 163.1114. Per la preparazione di set di dati di spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida non mirata, aprire MZmine 2 e selezionare Importazione dati grezzi"in Raw data methods"menu a discesa. Selezionare quindi i file di dati dall'analisi della microcistina e selezionare il filtro di prelievo di picco per applicare un algoritmo di baricentro fornito dal fornitore.Per il filtro a frammentazione diagnostica, o DFF, dei file di acquisizione importati dipendenti dai dati, utilizzare il cursore per evidenziare i file di dati e aprire il menu a discesa Visualizzazione per selezionare l'opzione DFF. Nella finestra di dialogo DFF visualizzata inserire l'intervallo di tempi e minuti di ritenzione in cui la classe di aaliti di destinazione eluterà e trovare l'intervallo di rapporto massa-carica della classe di aaliti di destinazione, inclusa la possibilità di più composti caricati quando appropriato. Inserire la precisione di massa della spettrometria di massa tandem raggiungibile dello strumento di spettrometria di massa e inserire gli ioni prodotto specifici della classe del rapporto massa-carica.Immettere le perdite neutre specifiche della classe e definire l'intensità minima per gli ioni di prodotto diagnostici e/o le perdite neutre da considerare come percentuale del picco di base degli spettri di spettrometria di massa tandem. Selezionare quindi un percorso e un nome di file per generare i risultati e fare clic su OK" per avviare il DFF. Un plottaggio DFF apparirà al completamento della configurazione.L'analista deve interpretare gli spettri di massa tandem di composti noti all'interno di una classe composta per identificare gli ioni prodotto e /o le perdite neutre che sono diagnostiche per l'intera classe di composti. Questo grafico DFF è stato generato a seguito dell'analisi di M.aeruginosa CPCC 300. L'asse x rappresenta questo rapporto massa-carica degli ioni precursori che soddisfaceva i criteri DFF definiti, mentre l'asse y mostra il rapporto massa-carica di tutti gli ioni prodotto all'interno degli spettri di spettrometria di massa tandem microcistins.Per questa analisi, i criteri per il rilevamento della microcistina includevano ioni precursori all'interno del rapporto massa-carica da 400 a 1,200 e tempi di ritenzione compresi tra due e sei minuti. Ancora più importante, questi spettri di spettrometria di massa tandem contenevano entrambi rapporti massa-carica al di sopra della soglia di intensità di picco di base definita del 15%. Dei 4.116 spettri di spettrometria di massa tandem acquisiti durante l'analisi, 26 soddisfacevano i criteri DFF e sono stati rilevati nell'estratto di M.aeruginosa CPCC 300.Le principali microcistina rilevate potrebbero essere assegnate con sicurezza come microcistina leucina arginina e acido aspartico demetilato microcistina leucina arginina. Man mano che nuovi composti vengono scoperti utilizzando il filtraggio diagnostico della frammentazione, gli organismi possono essere coltivati su larga scala per l'isolamento e la caratterizzazione dei composti da parte della NMR. Se applicato ai microcistina, il filtraggio diagnostico della frammentazione ci consente di determinare se i metodi di screening mirati tradizionali rilevano le principali tossine presenti all'interno di un campione.

Research

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Ricerca

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