Name: natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

著者たちは、Roshon (カナダ林内藻類相文化センター、ウォータールー大学で、研究しているシアノバクテリアの文化を提供し、Sawsan Abusharkh (カールトン大学) の技術支援に感謝した。

1. 非標的液体クロマトグラフィー (LC)-MS/MS データセットの作成
注: DFF は、高分解能質量分析計を使用し、対象クラスの検体に最適化された分析方法で実行できます。MC Orbitrap 質量分析計での LC-MS/MS 条件を材料表に記載しています。
<ol><li>
ダウンロード MZmine 2(http://mzmine.github.io/) 注: サンプルデータ CPCC300 は https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCM...

<ol>
	<li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry.">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li><li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS&#8211;NRPS.">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS&#8211;NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li><li>Kelman, M. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blooming+algae:+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria.">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li><li>Carmichael, W. W., Boyer, G. 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F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+(Microcystis+aeruginosa)+under+culture+conditions.">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li><li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins.">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li><li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions:+differences+of+electrospray+ionization/collision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda.">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li><li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science &#38; technology. 48 (4), 2097 (2014).</li></ol>

DFF は、化合物のクラス全体を検出するための簡単で迅速な戦略で、特に天然物の化合物の発見に関連しています。DFF の最も重要な側面は、対象となる化合物クラスの特定の MS/MS フラグメンテーションの基準を定義することです。この代表例では、DFF は、 m. 膿菌細胞抽出物中に存在する MCs を含むすべての Adda 残基を検出するために使用した。MCs の大半は Adda 残留物を含んでいるが?...

タンデム質量分析法 (MS/MS) は、前駆体イオンを単離し、衝突誘導解離 (CID) のような活性化エネルギーの適用を介して断片化を誘導することを含む、広く使用されている質量分析方法です。イオンフラグメントがその分子構造と密接に結びついている方法。天然物は、多くの場合、単一のユニークな化学物質2としてではなく、構造的に類似した化合物の混合物として生合成。そのため、同じ生合成クラスの一部である構造的に関連する化合物は、共通の製品イオンおよび/または中性損失を含む重要な MS/MS フラグメンテーション特性を共有することが多い。クラス固有の製品イオンおよび/または中性損失を有する化合物のための複雑なサンプルをスクリーニングする能力は、化合物のクラス全体を検出する強力な戦略であり、潜在的に新しい天然産物の発見につながる3、4,5,6.何十年もの間、低分解能の測定器で実行される中性損失スキャンや前駆体イオンスキャニングなどの質量分析法により、同じ中性損失または製品イオンによるイオンの検出が可能になりました。しかし、実験を行う前に特定のイオンまたは遷移を定義する必要があった。研究室では高分解能の質量分析計が普及しているため、複雑なサンプルは、対象外のデータ依存型集録 (DDA) メソッドを使用して一般的に選別されています。従来の中性損失および前駆体イオン走査とは対照的に、構造的に関連する化合物は、捕捉後分析7によって同定することができる。本研究では、複雑な行列内の化合物の全クラスを検出するための、診断断片化フィルタリング (DFF)5,6と呼ばれる、簡単でわかりやすい方法を開発した戦略を示します。この DFF モジュールは、オープンソースの MZmine 2 プラットフォームに実装されており、MZmine 2.38 またはそれ以降のリリースをダウンロードすることで利用できます。DFF により、ユーザーは、化合物のクラス全体の診断である製品イオン (複数可) および/または中性損失 (es) を含む MS/MS スペクトルの DDA データセットを効率的にスクリーニングすることができます。DFF の制限は、化合物のクラスのための特徴的な製品イオンおよび/または中性損失がアナリストによって定義されなければならない。
例えば、60以上の異なるフモニシンマイコトキシンのそれぞれが8、9が tricarballylic 側鎖を有していることを識別し、その上にm/z 157.0142 (C6H5-5-) 積イオンを発生する[M-H]-イオン4の断片化。したがって、サンプル中のすべての推定 fumonisins は、著名なm/z 157.0142 製品イオンを含む DDA データセット内のすべての MS/ms スペクトルをスクリーニングすることにより、DFF を使用して検出することができます。同様に、硫酸化化合物は、79.9574 Da (SO3)3の診断中立損失を含む ms/MS スペクトルのための DDA データセットをスクリーニングすることによって検出することができる。このアプローチは、新しい環状ペプチド5およびトリプトファンまたはフェニルアラニン残基6を含む天然産物の検出にも首尾よく適用されている。
MZmine プラットフォーム10内での DFF の有効性とその使いやすさを実証するために、ミクロシスチン (MCs) の分析にこのアプローチを適用しました。淡水シアノバクテリア11、12、13によって生成された240以上の構造的に関連する毒素のクラス。
最も一般的に報告されるシアノトキシンは MCs であり、MC-LR (ロイシン [L]/arginine [R]) コンジナー最もよく研究されている (図 1)。MCs は、効果非リボソーム heptapeptides、 Microcystis、アナベナ、ネンジュモ属、およびPlanktothrix12,13を含む複数のシアノバクテリア属によって生合成。MCs は、L-アミノ酸によって占められている5つの共通残基と二つの可変位置からなる。ほぼ全ての Mc は、位置 511に特徴的なβ-アミノ酸 3-アミノ-9-メトキシ-2, 6, 8-トリメチル-10-phenyldeca-4, 6-dienoic 酸 (Adda) 残基を有する。 MCs の ms/ms フラグメンテーション経路はよく説明されています14,15;Adda 残基は、著名な ms/ms 製品イオン、 m/z 135.0803+ (c9H11O+) だけでなく、 m/z 163.1114+ (c11h 15 を含む他の製品のイオンを担当していますO+) (図 2)。Microcystis 膿菌の非標的 DDA データセット細胞抽出物は、これらの診断イオンを使用して存在するすべてのミクロシスチンについてスクリーニングすることができ、ミクロシスチンは Adda 残基を有することが認められる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td>
			<td>CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE</td>
			<td>CPCC300</td>
			<td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteowizard (software)</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mzmine 2</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://mzmine.github.io/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipped with HESI ionization source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1290 UHPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with binary pump, autosampler, column compartment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959757-902</td>
			<td>Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 &#215; 100 mm, 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LC-MS grade Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Water</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade Formic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-772-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber HPLC vials 2 mL/caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716/5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m PTFE syringe filters</td>
			<td>Pall Corp.</td>
			<td>4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1820047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA media (pH 8.6) ( quantity / L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watanabe, M. F. &#38; Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)&#183;4H2O, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4, 40 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium glycerophosphate, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3, 20 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine, 500 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES1151B-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P(IV) metal solution, 5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bring the following to 1 L with ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaEDTA&#183;2HO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3 &#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3061-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis

天然物は、多くの場合、単一の化合物ではなく、構造的に類似した化合物の混合物として生合成。共通の構造的特徴のために、同じクラス内の多くの化合物は、同様の MS/MS 断片化を受け、いくつかの同一の製品イオンおよび/または中性損失を有する。診断フラグメンテーションフィルタリング (DFF) の目的は、クラス固有の製品イオンおよび/または中性損失を含む MS/MS スペクトルの非ターゲット LC-ms/MS データセットをスクリーニングすることにより、複雑な抽出で特定のクラスのすべての化合物を効率的に検出することです。この方法は、四重極 Orbitrap または四重極のタイムオブフライト質量などの高分解能質量分析計でのデータ依存型集録によって分析されるサンプル抽出を必要とするオープンソース MZmine プラットフォーム内に実装した DFF モジュールに基づいています。アナライザー。このアプローチの主な制限は、アナリストは、天然物の対象となるクラスに固有の製品のイオンおよび/またはニュートラルな損失を最初に定義する必要があります。DFF は、新しい化合物を含む複雑なサンプル内のすべての関連する天然物のその後の発見を可能にします。本研究では、藍藻の原因となるMicrocystis 膿菌の抽出物を、ミクロシスチンの産生に対してスクリーニングすることにより、DFF の有効性を実証する。

CPCC300 の分析に従って生成された DFF プロットを図 4に示します。このプロットのx軸は、定義された DFF 基準を満たした前駆体イオンのm/zであり、 y軸は MCs MS/MS スペクトル内の全製品イオンのm/zを示しています。この分析では、MC 検出のための基準には、440-1200 のm/z範囲内の前駆体イオンが含まれ、保存時...

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Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

MZmine に実装された診断フラグメンテーションフィルタリングは、既知および未知の天然製品のクラス全体について、LC-MS/MS データセットをスクリーニングするための、エレガントで取得後のアプローチです。このツールは、分析者が化合物クラス全体の診断として定義した製品イオンおよび/または中性損失の MS/MS スペクトルを検索します。

LC-MS/MS 診断フラグメンテーションによる自然な製品の発見: ミクロシスチン分析のためのアプリケーション

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

天然物は、多くの場合、化合物のクラスとして生合成され、単一の製品としてではありません。診断フラグメンテーション フィルタリングは、複雑な混合物内のすべての構造的に関連する化合物を検出するための簡単なアプローチです。MZmineソフトウェア内で実装された診断断片化フィルタリングにより、アナリストは、見逃される可能性のある新しい天然物の質量分析データセットを探索することができます。これには、新しいバイオ製品、および新しい毒素が含まれます。食物および水を汚染する毒素クラスに適用される診断断片化フィルタリングは、暴露評価を知らせることができる。微生物や植物抽出物に適用すると、新しい化合物の発見につながる可能性があります。診断フラグメント化フィルタリングを使用するには、化学クラスを定義する主要なタンデム質量分析機能を理解する必要があります。これは、構造的に類似した化合物が特徴的なイオンを生成することを意味します。私の名前はショーン・フーグストラです。私は私たちのセンターで研究技術者とソフトウェア開発者であり、私は手順をデモンストレーションします。ミクロシスチン分析用の試料を調製するために、無菌シアノバクテリア増殖培地の30ミリリットルを1ミリリットル当たり約5倍の10〜5番目の細胞に接種し、無菌状態下、250ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで、血球計で細胞密度をモニタリングする。26日間の光オートトローフ培養後、12時間のライトダークレジームを摂氏27度で用いたクールホワイト蛍光灯で照らし、1日1回旋回し、直径47ミリリットルのGF/Cガラスマイクロファイバーフィルターペーパーを使用して、真空濾過によって細胞を培地から分離する。14ミリリットルの試験管で収穫された細胞に80%メタノールの3ミリリットルを加え、渦を加え、その後30秒間各管を超音波処理します。超音波処理の後、3つの連続した1時間、マイナス20°C凍結、および15分間の室温融解サイクルでサンプルを分解し、個々の0.22マイクロメートルポリテトラフルオロエチレンシリンフィルターを介して各得られるシアノバクテリア細胞抽出物を濾過します。窒素ガスの穏やかな流れを使用して、30°Cでエバポレーターで抽出物を乾燥させ、マイナス20度で乾燥した抽出物を保存します。液体クロマトグラフィータンデム質量分析の場合、分析する乾燥残渣を90%メタノールの500マイクロリットルで再構成し、30秒間ボルテックスサンプルを再生する。琥珀色の高圧液体クロマトグラフィーバイアルに移します。次に、標準的なプロトコルに従って、高分解能質量分析計でデータ依存的な取得方法を用いてシアノバクテリア抽出物を分析します。ほとんどのマイクロシスチンは、タンデム質量分析、MからZ 135.0803、および163.1114の2つの診断産物イオンを生成するATA残基を含んでいます。非ターゲット液体クロマトグラフィータンデム質量分析データセットの準備の場合は、MZmine 2を開き、未処理データメソッドの下の「生データインポート」を選択します。.ドロップダウンメニュー。次に、マイクロシスチン分析からデータ ファイルを選択し、ピーク ピッキング フィルターを選択して、ベンダー提供の送心アルゴリズムを適用します。インポートされたデータ依存取得ファイルの診断フラグメンテーション フィルタリング(DFF)の場合は、カーソルを使用してデータ ファイルを強調表示し、[視覚化] ドロップダウン メニューを開いて DFF オプションを選択します。表示される DFF ダイアログ ボックスで、対象とする検地クラスが溶出する保持時間と分の範囲を入力し、適切な場合に複数の荷電化合物の可能性を含む、標的クラスの検数の質量対充電比範囲を求めます。質量分析装置の達成可能なタンデム質量分析質量精度を入力し、質量電荷比のクラス特異的な生成物イオンを入力します。クラス固有の中性損失を入力し、タンデム質量分析スペクトルの基本ピークに対する割合として考慮される診断製品イオンおよび/または中性損失の最小強度を定義します。次に、結果を出力するパスとファイル名を選択し、「OK」をクリックしてDFFを開始します。セットアップが正常に完了すると、DFF プロットが表示されます。解析者は、化合物クラス内の既知の化合物のタンデム質量スペクトルを解釈して、化合物のクラス全体の診断である生成イオンおよび/または中性損失を特定する必要があります。このDFFプロットは、M.aeruginosa CPCC 300の分析に続いて生成された。X軸は、定義されたDFF基準を満たす前駆体イオンの質量電荷比を表し、y軸はマイクロシスチンタンデム質量分析スペクトル内のすべての生成イオンの質量電荷比を示します。この分析では、ミクロシスチン検出の基準には、質量電荷比400~1、200、および2〜6分間の保持時間内の前駆体イオンが含まれていました。最も重要なことは、これらのタンデム質量分析スペクトルは、定義された15%ベースピーク強度閾値を超える質量電荷比の両方を含んでいた。分析中に取得した4、116タンデム質量分析スペクトルのうち、26はDFF基準を満たし、M.aeruginosa CPCC 300抽出物で検出した。検出された主要なマイクロシスチンは、自信を持ってマイクロシスチンロイシンアルギニンおよび脱メチル化アスパラギン酸ミクロシスチンロイシンアルギニンとして割り当てることができました.診断フラグメント化フィルタリングを使用して新しい化合物が発見されると、NMRによる化合物の分離と特性評価のために生物を大規模に増殖させることができます。マイクロシスチンに適用すると、診断断片化フィルタリングにより、従来の標的スクリーニング方法がサンプル内に存在する主要な毒素を検出しているかどうかを判断できます。

Research

JoVE Journal

Chemistry

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