Name: natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Forfatterne takker Heather Roshon (Canadian Phycological Culture Centre, University of Waterloo for å gi den cyanobakterier kulturen studert og sawsan Abusharkh (Carleton University) for teknisk assistanse.

1. utarbeidelse av ikke-målrettede flytende kromatografi (LC)-MS/MS datasett
Merk: DFF kan utføres ved hjelp av en hvilken som helst høyoppløselig masse spektrometer og analytisk metode optimalisert for en mål klasse av analytter. MC-optimaliserte LC-MS/MS-forhold på Orbitrap masse spektrometer er listet opp i materialfortegnelsen.
<ol><li>
Laste ned MZmine 2 (http://mzmine.github.io/) Merk: eksempel data CPCC300. Raw kan finnes på https://drive....

<ol>
	<li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry.">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li><li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS&#8211;NRPS.">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS&#8211;NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li><li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering.">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins.">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides.">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li><li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins.">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).</li><li>Bart&#243;k, T., Sz&#233;csi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterh&#225;zy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bart&#243;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li><li>Bart&#243;k, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+(FB1)+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).</li><li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3:+tables+of+microcystins+and+nodularins.">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li><li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blooming+algae:+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria.">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li><li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms:+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes.">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li><li>Mayumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+microcystins+by+LC/MS/MS+under+ion+trap+conditions.">Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions.</a> The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).</li><li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event.">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+(Microcystis+aeruginosa)+under+culture+conditions.">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li><li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins.">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li><li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions:+differences+of+electrospray+ionization/collision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda.">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li><li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science &#38; technology. 48 (4), 2097 (2014).</li></ol>

DFF er en rett-frem og rask strategi for å oppdage hele klasser av forbindelser, spesielt relevant for naturlig produkt sammensatte oppdagelse. Det viktigste aspektet ved DFF er å definere bestemte MS/MS fragmentering kriterier for målrettede klasse av forbindelser. I dette representative eksempelet ble DFF brukt til å oppdage alle Adda rester som inneholdt MCs som finnes i en M. aeruginosa Cellular ekstrakt. Selv om det store flertallet av MCs inneholder en Adda rester, har andre rester i denne stillingen v...

Tandem masse massespektrometri (MS/MS) er en mye brukt masse massespektrometri metode som innebærer å isolere en forløper ion og inducing fragmentering via anvendelse av aktiveringsenergi som kollisjon indusert DISSOSIASJON (Cid)1. Måten en ion fragmenter er nært knyttet til sin molekylære struktur. Naturlige produkter er ofte biosynthesized som blandinger av strukturelt lignende forbindelser i stedet for som en enkelt unik kjemisk2. Som sådan, strukturelt relaterte forbindelser som er en del av den samme biosyntetiske klassen ofte deler nøkkelen MS/MS fragmentering egenskaper, inkludert delte produkt-ioner og/eller nøytrale tap. Evnen til skjermen komplekse prøver for forbindelser som besitter klasse-spesifikke produkt-ioner og/eller nøytrale tap er en kraftig strategi for å oppdage hele klasser av forbindelser, potensielt fører til oppdagelsen av nye naturlige produkter3, 4 andre priser , 5 andre priser , 6. i flere ti år, masse massespektrometri metoder som nøytral tap skanning og forløper ion skanning utført på lav oppløsning instrumenter har tillatt ioner med samme nøytrale tap eller produkt ioner som skal oppdages. Men de spesifikke ioner eller overganger som trengs for å bli definert før du utfører eksperimentene. Som høyoppløselige masse spektrometre har blitt mer populært i forskningslaboratorier, komplekse prøver er nå vanligvis vist ved hjelp av ikke-målrettede, data-avhengige oppkjøp (DDA) metoder. I motsetning til tradisjonell nøytral tap og forløper ion skanning, strukturelt relaterte forbindelser kan identifiseres ved post-oppkjøpet analyse7. I dette arbeidet viser vi en strategi vi har utviklet kalt diagnostisk fragmentering filtrering (DFF)5,6, en rett fram og brukervennlig tilnærming for å oppdage hele klasser av forbindelser innen komplekse matriser. Denne DFF modul er blitt gjennomført inn i åpen-kilde, MZmine 2 plattform og anvendelig av dataoverfører MZmine 2,38 eller nyere befrir. DFF tillater brukere å effektivt skjermen DDA datasett for MS/MS Spectra som inneholder produktet ion (s) og/eller nøytral tap (e) som er diagnostiske for hele klasser av forbindelser. En begrensning av DFF er karakteristiske produkt ioner og/eller nøytrale tap for en klasse av forbindelser må defineres av analytikeren.
For eksempel, hver av de mer enn 60 forskjellige fumonisin mykotoksiner identifisert8,9 ha en tricarballylic side kjede, som genererer en m/z 157,0142 (C6H5O5-) Produktion upon fragmentering av [M-H]- ion4. Derfor kan alle antatte fumonisins i en prøve oppdages ved hjelp av DFF ved screening alle MS/MS Spectra innenfor en DDA datasett som inneholder den prominente m/z 157,0142 Produktion. Tilsvarende kan sulfated forbindelser oppdages ved screening DDA datasett for MS/MS Spectra som inneholder en diagnostisk nøytralt tap av 79,9574 da (SO3)3. Denne tilnærmingen har også blitt brukt for å oppdage nye sykliske peptider5 og naturlige produkter som inneholder tryptofan eller fenylalanin rester6.
For å demonstrere effektiviteten av DFF og dens brukervennlighet innenfor MZmine-plattformen10har vi brukt denne tilnærmingen til analyse av Mikrocystiner (MCS); en klasse av over 240 strukturelt relaterte giftstoffer produsert av ferskvann cyanobakterier11,12,13.
De hyppigst rapporterte cyanotoxins er MCs, med MC-LR (leucine [L]/Arginine [R]) congener hyppigst studert (figur 1). MCs er monocyclic ikke-ribosomal heptapeptides, biosynthesized av flere cyanobakterier slekter inkludert Microcystis, Anabaena, Nostoc, og Planktothrix12,13. MCs er sammensatt av fem vanlige rester og to variable posisjoner okkupert av L-aminosyrer. Nesten alle MCs besitter en karakteristisk β-aminosyre 3-amino-9-metoksy-2, 6, 8-trimethyl-10-phenyldeca-4, 6-dienoic acid (Adda) rester i posisjon 511.  I MS/MS fragmentering trasé av MCS er godt beskrevet14,15; Adda rester er ansvarlig for det fremtredende MS/MS Produktion, m/z 135,0803+ (C9H11O+) samt andre produkt ioner inkludert m/z 163,1114+ (C11H15 O+) (figur 2). Ikke-målrettede DDA datasett av Microcystis aeruginosa Cellular ekstrakter kan bli vist for alle mikrocystiner tilstede ved hjelp av disse diagnostiske ioner, gitt at mikrocystiner har en Adda rester.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td>
			<td>CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE</td>
			<td>CPCC300</td>
			<td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteowizard (software)</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mzmine 2</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://mzmine.github.io/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipped with HESI ionization source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1290 UHPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with binary pump, autosampler, column compartment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959757-902</td>
			<td>Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 &#215; 100 mm, 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LC-MS grade Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Water</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade Formic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-772-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber HPLC vials 2 mL/caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716/5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m PTFE syringe filters</td>
			<td>Pall Corp.</td>
			<td>4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1820047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA media (pH 8.6) ( quantity / L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watanabe, M. F. &#38; Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)&#183;4H2O, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4, 40 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium glycerophosphate, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3, 20 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine, 500 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES1151B-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P(IV) metal solution, 5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bring the following to 1 L with ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaEDTA&#183;2HO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3 &#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3061-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis

Naturlige produkter er ofte biosynthesized som blandinger av strukturelt lignende forbindelser, snarere enn en enkelt sammensatt. På grunn av deres felles strukturelle funksjoner, mange forbindelser innenfor samme klasse gjennomgår lignende MS/MS fragmentering og har flere identiske produkt ioner og/eller nøytrale tap. Formålet med diagnostiske fragmentering filtrering (DFF) er å effektivt oppdage alle forbindelser av en gitt klasse i et komplekst ekstrakt ved screening ikke-målrettede LC-MS/MS datasett for MS/MS Spectra som inneholder klasse spesifikke produkt-ioner og/eller nøytrale tap. Denne metoden er basert på en DFF modul implementert innenfor åpen kildekode-MZmine plattform som krever prøve ekstrakter analyseres av data avhengig oppkjøpet på en høyoppløselig masse spektrometer som quadrupole Orbitrap eller quadrupole time-of-Flight masse Analyserer. Den viktigste begrensningen av denne tilnærmingen er analytiker må først definere hvilke produkt-ioner og/eller nøytrale tap er spesifikke for målrettet klassen av naturlige produkter. DFF gjør det mulig for den påfølgende oppdagelsen av alle relaterte naturlige produkter innenfor en kompleks prøve, inkludert nye forbindelser. I dette arbeidet viser vi effektiviteten av DFF ved screening ekstrakter av Microcystis aeruginosa, en fremtredende skadelig alger blomst forårsaker cyanobakterier, for produksjon av mikrocystiner.

DFF-plottet generert etter analyse av M. aeruginosa CPCC300 er vist i Figur 4. X-aksen i dette plottet er m/z av forløperen ioner som tilfredsstiller definerte DFF kriterier mens y-aksen viser m/z av alle produkt ioner innenfor MCS MS/MS Spectra. For denne analysen inkluderte kriteriene for MC-deteksjon forløperen ioner innen m/z -området på 440-1200, oppbevaringstid mellom 2,00 – 6,00 min. Viktigst,...

Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

Diagnostisk fragmentering filtrering, implementert i MZmine, er en elegant, post-oppkjøpet tilnærming til skjermen LC-MS/MS datasett for hele klasser av både kjente og ukjente naturlige produkter. Dette verktøyet søker MS/MS Spectra for produktet ioner og/eller nøytrale tap at analytikeren har definert som diagnostiske for hele klassen av forbindelser.

Naturlig produkt oppdagelse med LC-MS/MS Diagnostic fragmentering filtrering: søknad om Microcystin analyse

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

Naturlige produkter er ofte biosyntetisert som en klasse av forbindelser, og ikke som et enkelt produkt. Diagnostisk fragmenteringsfiltrering er en enkel tilnærming for å oppdage alle strukturelt relaterte forbindelser i en kompleks blanding. Diagnostisk fragmentering filtrering, implementert i MZmine programvare, tillater analytikeren å utforske massespektrometri datasett for nye naturlige produkter som ellers ville bli savnet.Dette inkluderer nye bioprodukter, og også nye giftstoffer. Diagnostisk fragmentering filtrering, brukt på toksin klasser som forurenser mat og vann, kan informere eksponeringsvurderinger. Når det påføres mikrobielle og planteekstrakter, kan det resultere i oppdagelsen av nye forbindelser.Ved hjelp av diagnostisk fragmentering filtrering krever en forståelse av de viktigste tandem massespektrometri funksjoner som definerer en kjemisk klasse. Dette betyr at strukturelt lignende forbindelser vil generere karakteristiske ioner. Jeg heter Shawn Hoogstra.Jeg er en forskningstekniker og programvareutvikler på senteret vårt, og jeg vil demonstrere prosedyren. For å forberede en prøve for mikrocystinanalyse, inokulerer 30 milliliter sterile cyanobakterier vekstmedium til omtrent fem ganger-10-til-femte celler per milliliter, under aseptiske forhold, i 250-milliliter Erlenmeyer flasker, overvåke celletettheten med et hemocytometer. Etter 26 dager med fotoautotrofisk kultur, opplyst med kjølig hvitt fluorescerende lys ved hjelp av et 12-timers lys-mørkt regime ved 27 grader Celsius, med virvlende en gang daglig, bruk 47-milliliter diameter GF / C glass mikrofiber filterpapirer for å skille cellene fra kulturmediet ved vakuumfiltrering.Tilsett tre milliliter med 80% metanol til de høstede cellene i 14-milliliter testrør, og vortex og deretter sonikere hvert rør i 30 sekunder. Etter sonikering, lyse prøvene med tre påfølgende en time, minus-20-graders Celsius fryse, og 15-minutters romtemperatur tine sykluser, og filtrere hver resulterende cyanobakterier celle ekstrakt gjennom individuelle 0,22-mikrometer polytetrafluoroetylen sprøyte filtre. Bruk en mild strøm av nitrogengass, tørk ekstraktene med en fordamper ved 30 grader Celsius, og lagre ekstraktene tørre ved minus-20 grader Celsius.For flytende kromatografi tandem massespektrometri analyse, rekonstituer den tørkede rester som skal analyseres med 500 mikroliter på 90% metanol, og vortex prøvene i 30 sekunder. Overfør til et gult høytrykks flytende kromatografi hetteglass. Analyser deretter cyanobakterierekstraktet ved hjelp av en dataavhengig oppkjøpsmetode på et høyoppløselig massespektrometer i henhold til standardprotokoller.De fleste mikrocystiner inneholder en ATA-rester som produserer to diagnostiske produktioner i tandemmassespektrometri, M til Z 135.0803 og 163.1114. For ikke-målrettet flytende kromatografi tandem massespektrometri datasett forberedelse, åpne MZmine 2, og velg Råddata import"under Råd data metoder"rullegardinmenyen. Velg deretter datafilene fra mikrocystinanalysen, og velg toppplukkingsfilteret for å bruke en leverandør-levert centroiding algoritme.For filtrering av diagnosefragmentering, eller DFF, av de importerte dataavhengige anskaffelsesfilene, bruker du markøren til å utheve datafilene og åpne rullegardinmenyen Visualisering for å velge DFF-alternativet. I DFF-dialogboksen som vises, skriver du inn omfanget av oppbevaringstider og minutter når den målrettede klassen av analyser vil elute, og for å finne masse-til-lade-forholdsområdet for den målrettede klassen av analytter, inkludert muligheten for flere ladede forbindelser når det er hensiktsmessig. Skriv inn den oppnåelige tandemmassespektrometriens massenøyaktighet av massespektrometriinstrumentet, og skriv inn de klassespesifikke produktionene i masse-til-lade-forholdet.Angi klassespesifikke nøytrale tap, og definer minimumsintensiteten for diagnostiske produktioner og/eller nøytrale tap som skal betraktes som en prosentandel av basistoppen for tandemmassespektrometrispektraet. Velg deretter en bane og filnavn for å sende ut resultatene og klikk OK"for å starte DFF. En DFF-tomt vises når oppsettet er fullført.Analytikeren må tolke tandem massespektra av kjente forbindelser i en sammensatt klasse for å identifisere produktioner og / eller nøytrale tap som er diagnostiske for hele klassen av forbindelser. Dette DFF-plottet ble generert etter analysen av M.aeruginosa CPCC 300. X-aksen representerer dette masse-til-lade-forholdet mellom forløperionene som oppfylte de definerte DFF-kriteriene, mens y-aksen viser masse-til-lade-forholdet mellom alle produktionene innenfor mikrocystinene tandemmassespektrometrispektra.For denne analysen inkluderte kriteriene for mikrocystindeteksjon for forløperioner innenfor masse-til-lade-forholdet på 400 til 1, 200 og oppbevaringstider mellom to til seks minutter. Viktigst, disse tandem massespektrometri spektra inneholdt begge masse-til-lade forhold over den definerte 15% base peak intensitet terskelen. Av de 4, 116 tandem massespektrometri spektra ervervet under analysen, 26 fornøyd DFF kriterier og ble oppdaget i M.aeruginosa CPCC 300 ekstrakt.De store mikrocystinene som oppdages, kan trygt tildeles som mikrocystin leucin arginin og demetylert aspartiksyre mikrocystin leucin arginin. Etter hvert som nye forbindelser oppdages ved hjelp av diagnostisk fragmenteringsfiltrering, kan organismene dyrkes i stor skala for isolasjon og karakterisering av forbindelsene ved NMR. Når det brukes på mikrocystiner, tillater diagnostisk fragmenteringsfiltrering oss å avgjøre om tradisjonelle målrettede screeningmetoder oppdager de store toksinene som finnes i en prøve.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR spektroskopi som et robust verktøy for rask evaluering av Lipid profil av fiskeolje kosttilskudd

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Integrasjon av miniatyrisert Solid Phase Extraction og LC-MS / MS Detection av 3-Nitrotyrosin i Human Urin for Kliniske Applications

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Minimum Burning Pressures of Water-based Emulsion Explosives

Minimum brenner presset av vannbasert emulsjon eksplosiver

This manuscript describes a protocol to measure the minimum pressure required for sustained burning of water-based emulsion explosives. Pumping ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Pusten samling fra barn for sykdom biomarkør oppdagelsen

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

En to-trinns pyrolyse-gass kromatografi metode med MASS Spectrometric Detection for identifisering av Tattoo Ink ingredienser og forfalskede produkter

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Anvendelse av spenning i dynamisk lys spredning partikkel størrelse analyse

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Syntese av Aptamer-PEI-g-PEG Modifisert Gull Nanopartikler Lastet med Doxorubicin for målrettet legemiddellevering

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomkraftmikroskopi kombinert med infrarød spektroskopi som et verktøy for å sondere enkeltbakteriekjemi

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

Nanopartikkelsporingsanalyse av gull nanopartikler i vandige medier gjennom en inter-laboratoriesammenligning

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Preparation of Nanoparticles for ToF-SIMS and XPS Analysis

Forberedelse av nanopartikler for ToF-SIMS og XPS-analyse

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, ...