Name: natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Авторы благодарят Хизер Рошон (Канадский центр Фитологических культур, Университет Ватерлоо за предоставление изучаемых цианобактерий и Сасан Абушарх (Карлтонский университет) за техническую помощь.

1. Подготовка нецелевых жидкостных хроматографии (LC)-МС/МС наборы данных
Примечание: ДФФ может быть выполнена с использованием любого высокого разрешения масс-спектрометра и аналитического метода, оптимизированного для целевого класса анализатов. MC оптимизированы усло?...

<ol>
	<li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry.">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li><li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS&#8211;NRPS.">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS&#8211;NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li><li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering.">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins.">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides.">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li><li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins.">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).</li><li>Bart&#243;k, T., Sz&#233;csi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterh&#225;zy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bart&#243;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li><li>Bart&#243;k, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+(FB1)+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).</li><li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3:+tables+of+microcystins+and+nodularins.">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li><li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blooming+algae:+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria.">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li><li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms:+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes.">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li><li>Mayumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+microcystins+by+LC/MS/MS+under+ion+trap+conditions.">Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions.</a> The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).</li><li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event.">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+(Microcystis+aeruginosa)+under+culture+conditions.">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li><li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins.">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li><li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions:+differences+of+electrospray+ionization/collision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda.">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li><li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science &#38; technology. 48 (4), 2097 (2014).</li></ol>

ДФФ является прямым и быстрая стратегия для обнаружения целых классов соединений, особенно актуально для природного продукта соединения открытия. Наиболее важным аспектом ДФФ является определение конкретных критериев фрагментации МС/МС для целевого класса соединений. В этом репрезе...

Тандем масс-спектрометрия (МС/МС) является широко используемым методом масс-спектрометрии, который включает изолирование ионного прекурсора и индуцирование фрагментации через применение энергии активации, например, индуцированной столкновением ДИССОЦИАЦИИ (СИД)1. Манера, в которой фрагменты ионов тесно связана с его молекулярной структурой. Натуральные продукты часто биосинтиразмерные как смеси структурно аналогичных соединений, а не как единое уникальное химическое вещество2. Таким образом, структурно связанные соединения, которые являются частью одного и того же биосинетического класса, часто разделяют основные характеристики фрагментации MS/MS, включая общие ионы продукта и/или нейтральные потери. Способность экрана сложных образцов для соединений, которые обладают класса конкретных ионов продукта и/или нейтральных потерь является мощной стратегией для выявления целых классов соединений, что потенциально приводит к открытию новых натуральных продуктов3, 4 , 5 , 6. на протяжении десятилетий массовые спектрометрии, такие как сканирование нейтральных потерь и сканирование ионов-прекурсоров на аппаратурах с низким разрешением, позволили обнаружить ионы с одинаковой нейтральной потерей или ионами продукта. Однако, специфические ионы или переходы необходимо определить до выполнять эксперименты. Как масс-спектрометры с высоким разрешением стали более популярными в исследовательских лабораториях, сложные образцы теперь обычно проверяются с использованием нецелевых, зависимых от данных методов приобретения (ДВР). В отличие от традиционных нейтральных потерь и сканирования ионов-прекурсоров, структурно связанные соединения могут быть идентифицированы по послеприобретному анализу7. В этой работе, мы демонстрируем стратегию, которую мы разработали называется диагностическая фрагментация фильтрации (ДФФ)5,6, прямой и удобный подход, чтобы обнаружить целые классы соединений в сложных матриц. Этот модуль ДФФ был реализован на платформе с открытым исходным кодом, Мммин 2 и доступен, загрузив 2,38 мин или новых релизов. ДФФ позволяет пользователям эффективно экран DDA наборы для MS/MS спектры, которые содержат продукт Ион (ы) и/или нейтральных потерь (ES), которые являются диагностическими для целых классов соединений. Ограничением ДФФ являются характерные ионы продукта и/или нейтральные потери для класса соединений, которые должны определяться аналитиком.
Например, каждый из более чем 60 различных микотоксина идентифицировали8,9 обладают трикарбаллиевой боковой цепью, которая генерирует m/z 157,0142 (C6H5O5-) продукт Ион на Фрагментация [M-H]- Ion4. Таким образом, все предполагаемые фумонилины в образце могут быть обнаружены с помощью ДФФ путем скрининга всех спектров MS/MS в наборе данных ДВР, которые содержат видный m/z 157,0142 продукт Ион. Аналогичным образом, Сульфированный соединений могут быть обнаружены путем скрининга наборов данных ДВР для MS/MS спектры, которые содержат диагностические нейтральной потери 79,9574 Da (SO3)3. Этот подход также был успешно применен для обнаружения новых циклических пептидов5 и натуральных продуктов, содержащих триптофан или фенилаланин остатков6.
Для того чтобы продемонстрировать эффективность ДФФ и его простоту использования в рамках платформы Ммммин10, мы применили этот подход к анализу микроцистинов (МС); класс из более чем 240 структурно связанных токсинов, производимых пресноводной цианобактерий11,12,13.
Наиболее часто сообщаемых цианотоксинов являются МС, с MC-LR (лейцин [L]/аргинин [R]) конгенер чаще всего изучал (рис. 1). МС-Моноцикл, не-рибосомальных гептапептиды, биосинтроразмерный многочисленными цианобактерий, включая Микроциды, Анабаена, Nostoc, и Планктотрикс12,13. МС состоят из пяти распространенных остатков и двух переменных позиций, занимаемых L-аминокислотами. Почти все МС обладают характерной b-аминокислотой 3-амино-9-метокси-2, 6, 8-триметил-10-фенилдека-4, 6-диеновая кислота (Адда) остаток в положении 511.  МС/МС фрагментация пути МС хорошо описаны14,15; остаток Adda ответственн для видно MS/MS продукт Ион, m/z 135,0803+ (C9H11O+) также, как другие ионы продукта включая m/z 163,1114+ (C11H15 O+) (рис. 2). Нецелевые наборы данных ДВР aeruginosa клеточных экстрактов могут быть проверены на все микроцистины, присутствующие с помощью этих диагностических ионов, предоставляемые микроцистины имеют остаток Adda.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td>
			<td>CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE</td>
			<td>CPCC300</td>
			<td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteowizard (software)</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mzmine 2</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://mzmine.github.io/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipped with HESI ionization source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1290 UHPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with binary pump, autosampler, column compartment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959757-902</td>
			<td>Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 &#215; 100 mm, 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LC-MS grade Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Water</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade Formic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-772-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber HPLC vials 2 mL/caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716/5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m PTFE syringe filters</td>
			<td>Pall Corp.</td>
			<td>4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1820047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA media (pH 8.6) ( quantity / L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watanabe, M. F. &#38; Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)&#183;4H2O, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4, 40 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium glycerophosphate, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3, 20 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine, 500 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES1151B-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P(IV) metal solution, 5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bring the following to 1 L with ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaEDTA&#183;2HO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3 &#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3061-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis

Натуральные продукты часто биосинтиразмерные как смеси структурно аналогичных соединений, а не одного соединения. Из-за их общих структурных особенностей, многие соединения в пределах одного класса проходят аналогичную фрагментация MS/MS и имеют несколько идентичных ионов продукта и/или нейтральных потерь. Целью диагностической фильтрации фрагментации (ДФФ) является эффективное обнаружение всех соединений данного класса в сложном экстракте путем скрининга нецелевых наборов данных LC-MS/MS для спектров MS/MS, содержащих специфические ионы продукта и/или нейтральные потери. Этот метод основан на модуле ДФФ, реализуем в рамках платформы с открытым исходным кодом ммпо, которая требует, чтобы образцы проб анализировались с помощью приобретения, зависимого от данных, от масс-спектрометра высокого разрешения, таких как четырехполюсный Орбитрапа или четырехполюсный период времени полета Анализаторы. Основным ограничением этого подхода является аналитик должен сначала определить, какие ионы продукта и/или нейтральных потерь являются специфическими для целевого класса натуральных продуктов. ДФФ допускает последующее обнаружение всех сопутствующих натуральных продуктов в рамках сложного образца, включая новые соединения. В этой работе мы демонстрируем эффективность ДФФ путем скрининга экстрактов aeruginosa, видного вредного цветения водорослей, вызывающего цианобактерии, для производства микроцистинов.

Участок ДФФ, созданный после анализа M. aeruginosa CPCC300, показан на рисунке 4. X-ось этого участка- m/z ионов-прекурсоров, которые УДОВЛЕТВОРЯЮТ определенным критериям ДФФ, в то время как y-ось показывает m/z всех ионов продукта в спектрах М?...

Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

Фильтрация по диагностическим фрагментация, внедрен в МНА, представляет собой элегантный подход после приобретения для проверки наборов данных LC-MS/MS для целых классов как известных, так и неизвестных натуральных продуктов. Этот инструмент ищет MS/MS спектры для ионов продуктов и/или нейтральных потерь, которые аналитик определил как диагностические для всего класса соединений.

Естественный продукт обнаружение с LC-MS/MS диагностическая фрагментация фильтрации: применение для анализа Микроцистин

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

Натуральные продукты часто биосинтезированы как класс соединений, а не как единый продукт. Диагностическая фрагментация фильтрации является простым подходом для обнаружения всех структурно связанных соединений в сложной смеси. Диагностическая фильтрация фрагментации, реализованная в программном обеспечении МЗмин, позволяет аналитику исследовать наборы данных масс-спектрометрии для новых натуральных продуктов, которые в противном случае были бы пропущены.Это включает в себя новые биопродукты, а также новые токсины. Диагностическая фрагментация фильтрации, применяемая к классам токсинов, которые загрязняют пищу и воду, может информировать оценки воздействия. При применении к микробным и растительным экстрактам, это может привести к открытию новых соединений.Использование диагностической фрагментации фильтрации требует понимания ключевых функций масс-спектрометрии тандема, определяющих химический класс. Это означает, что структурно аналогичные соединения будут генерировать характерные ионы. Меня зовут Шон Хугстра.Я специалист по исследованиям и разработчик программного обеспечения в нашем центре, и я буду демонстрировать процедуру. Чтобы подготовить образец для анализа микроцистина, привить 30 миллилитров стерильных цианобактерий роста среднего примерно в пять раз-к-пятой клетки на миллилитр, в асетических условиях, в 250-миллилитровых колбы Erlenmeyer, мониторинг плотности клеток с гемоцитометром. После 26 дней фотоавтотрофной культуры, освещенной прохладным белым флуоресцентным светом с использованием 12-часового светло-темного режима при 27 градусах Цельсия, с закрученной один раз в день, используйте 47-миллилитровый диаметр GF/C стеклянные фильтры микрофибер для того чтобы отделить клетки от среды культуры вакуумной фильтрацией.Добавьте три миллилитров 80%метанола в собранные клетки в 14-миллилитровых пробирках, и вихрь, а затем sonicate каждой трубки в течение 30 секунд. После sonication, lyse образцы с тремя последовательными один час, минус-20 градусов по Цельсию заморозить, и 15-минутная комнатная температура оттепели циклов, и фильтровать каждый результат цианобактерий клеточный экстракт через отдельные 0,22-микрометровый фильтры полиэтиленовых шприцев. Используя нежный поток азотного газа, высушите экстракты испарителем при температуре 30 градусов по Цельсию и храните экстракты сухими при температуре минус 20 градусов по Цельсию.Для анализа жидкой хроматографии тандема масс-спектрометрии, восстановить высушенные остатки для анализа с 500 микролитров 90% метанола, и вихрь образцов в течение 30 секунд. Перенесите в янтарь жидкий хроматографический флакон высокого давления. Затем проанализируйте экстракт цианобактерий с помощью метода получения данных на масс-спектрометре высокого разрешения в соответствии со стандартными протоколами.Большинство микроцистинов содержат остатки АТА, который производит два диагностических ионов продукта в тандеме масс-спектрометрии, M через No 135.0803, и 163.1114. Для нецелитической жидкой хроматографии тандем масс-спектрометрии набор данных подготовки, открыть МЗмин 2, и выбрать сырье импорта данных "в соответствии с методами сырье данных" падение вниз меню. Затем выберите файлы данных из анализа микроцистина и выберите фильтр пикового выбора для применения алгоритма центроидирования, поставляемого поставщиком.Для диагностической фрагментации фильтрации, или DFF, импортированных файлов приобретения, зависящих от данных, используйте курсор для выделения файлов данных и откройте меню Visualization"drop-down для выбора опции DFF. В поле диалога DFF, которое появляется, ввнося диапазон времени хранения и минут, когда целевой класс аналитов будет elute, и найти диапазон соотношения массы к зарядке целевого класса аналитов, в том числе возможность для нескольких заряженных соединений, когда это необходимо. Ввнося достижимую тандемную масс-спектрометрию массовой точности прибора масс-спектрометрии, ввнося класс-специфические ионы продукта в соотношение массы к заряду.Введите нейтральные потери класса и определите минимальную интенсивность ионов диагностического продукта и/или нейтральных потерь, которые будут рассматриваться в процентах от базового пика спектрометрии тандема. Затем выберите путь и имя файла, чтобы выработать результаты и нажмите OK ", чтобы начать DFF. Сюжет DFF появится после успешного завершения установки.Аналитик должен интерпретировать тандемные массовые спектры известных соединений в составном классе для определения ионов продукта и/или нейтральных потерь, которые диагностичны для всего класса соединений. Этот сюжет DFF был создан после анализа M.aeruginosa CPCC 300. Х-ось представляет это соотношение массы к заряду ионов-предшественников, удовлетворях которым удовлетворяли определенным критериям DFF, в то время как у оси показывает соотношение массы к заряду всех ионов продукта в микроцистиновом тандеме масс-спектрометрии.Для этого анализа критерии обнаружения микроцистина включали ионы-прекурсоры в соотношении массы к зарядке от 400 до 1200 и время удержания от двух до шести минут. Самое главное, эти тандемные спектрометрические спектрометрии тандема содержали оба соотношения массы к заряду выше установленного порога пиковой интенсивности в 15%. Из 4, 116 тандемных спектрометрии тандема, приобретенных в ходе анализа, 26 удовлетворяли критериям DFF и были обнаружены в экстракте M.aeruginosa CPCC 300.Основные микроцистины обнаружены могут быть уверенно назначены в качестве микроцистина лейцин аргинина и деметилированной аспарагиновой кислоты микроцистина аргинина. По мере того как новые соединения открынные используя диагностическую фильтрацию фрагментации, организмы можно вырастить в большом маштабе для изоляции и характеристики соединений NMR. При применении к микроцистинам, диагностическая фрагментация фильтрации позволяет нам определить, если традиционные методы целевого скрининга обнаруживают основные токсины, присутствующие в образце.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

Спектроскопия ЯМР как надежный инструмент для быстрой оценки липидного профиля рыбьего жира добавки

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Интеграция миниатюрной твердофазной экстракции и LC-MS / MS Обнаружение 3-нитротирозина в моче человека для клинических применений

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Minimum Burning Pressures of Water-based Emulsion Explosives

Минимальный горения давления на водной основе эмульсионных взрывчатых веществ

This manuscript describes a protocol to measure the minimum pressure required for sustained burning of water-based emulsion explosives. Pumping ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Дыхание коллекции от детей для открытия биомаркеров болезни

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Двухступенчатый пиролиза-газ хроматографии метод с масс спектрометрическое обнаружение для идентификации татуировки чернила ингредиенты и контрафактной продукции

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Применение напряжения в анализе динамического рассеяния света

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Синтез Aptamer-PEI-g-PEG Модифицированные золотые наночастицы загружены доксорубицином для целевой доставки лекарств

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Атомно-силовая микроскопия в сочетании с инфракрасной спектроскопией в качестве инструмента для исследования химии одиночных бактерий

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

Анализ слежения за наночастицами золота в Aqueous Media с помощью межлабораторного сравнения

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Preparation of Nanoparticles for ToF-SIMS and XPS Analysis

Подготовка наночастиц для анализа ToF-SIMS и XPS

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, ...