Name: natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Los autores agradecen a Heather Roshon (centro de cultura phycological canadiense, Universidad de Waterloo por proporcionar la cultura de las cianobacterias estudiadas y Sawsan Abusharkh (Universidad de Carleton) para la asistencia técnica.

1. preparación de los datasets de cromatografía líquida no objetivo (LC)-MS/MS
Nota: DFF se puede realizar utilizando cualquier espectrómetro de masas de alta resolución y un método analítico optimizado para una clase objetivo de analitos. Las condiciones de LC-MS/MS optimizadas para MC en el espectrómetro de masas Orbitrap se enumeran en la tabla de materiales.
<ol><li>
Descargar MZmine 2 (http://mzmine.github.io/) Nota: los datos de ejemplo CP...

<ol>
	<li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry.">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li><li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS&#8211;NRPS.">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS&#8211;NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li><li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering.">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins.">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides.">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li><li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins.">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).</li><li>Bart&#243;k, T., Sz&#233;csi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterh&#225;zy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bart&#243;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li><li>Bart&#243;k, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+(FB1)+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).</li><li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3:+tables+of+microcystins+and+nodularins.">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li><li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blooming+algae:+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria.">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li><li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms:+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes.">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li><li>Mayumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+microcystins+by+LC/MS/MS+under+ion+trap+conditions.">Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions.</a> The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).</li><li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event.">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+(Microcystis+aeruginosa)+under+culture+conditions.">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li><li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins.">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li><li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions:+differences+of+electrospray+ionization/collision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda.">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li><li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science &#38; technology. 48 (4), 2097 (2014).</li></ol>

La DFF es una estrategia rápida y directa para detectar clases enteras de compuestos, especialmente relevantes para el descubrimiento compuesto de productos naturales. El aspecto más importante de DFF es definir los criterios específicos de fragmentación de MS/MS para la clase de compuestos específica. En este ejemplo representativo, DFF se usó para detectar todos los residuos de Adda que contienen MCs presentes en un extracto celular de M. aeruginosa . Aunque la gran mayoría de los MCs contienen un resid...

LA espectrometría de masas en tándem (MS/MS) es un método de espectrometría de masas ampliamente utilizado que implica aislar un ion precursor e inducir la fragmentación mediante la aplicación de energía de activación como la disociación inducida por colisión (CID)1. La forma en que un fragmento de iones está íntimamente ligado a su estructura molecular. Los productos naturales son a menudo biosintetizados como mezclas de compuestos estructuralmente similares en lugar de como un único químico único2. Como tal, compuestos estructuralmente relacionados que son parte de la misma clase biosintética a menudo comparten características de fragmentación de MS/MS clave, incluyendo iones de productos compartidos y/o pérdidas neutrales. La capacidad de detectar muestras complejas para compuestos que poseen iones de productos específicos de la clase y/o pérdidas neutrales es una estrategia poderosa para la detección de clases enteras de compuestos, lo que podría llevar al descubrimiento de nuevos productos naturales3, 4 , 5 , 6. durante décadas, los métodos de espectrometría de masas como el escaneo de pérdida neutra y el escaneo de iones precursor realizado en instrumentos de baja resolución han permitido la detección de iones con la misma pérdida neutra o iones de producto. Sin embargo, los iones o transiciones específicos debían definirse antes de realizar los experimentos. Como los espectrómetros de masas de alta resolución se han vuelto más populares en los laboratorios de investigación, las muestras complejas ahora se examinan comúnmente utilizando métodos de adquisición dependientes de datos (DDA) no dirigidos. En contraste con la pérdida neutra tradicional y el escaneo de iones precursores, los compuestos estructuralmente relacionados pueden identificarse mediante el análisis posterior a la adquisición7. En este trabajo, demostramos una estrategia que hemos desarrollado denominado filtrado de fragmentación de diagnóstico (DFF)5,6, un enfoque sencillo y fácil de usar para detectar clases enteras de compuestos dentro de matrices complejas. Este módulo DFF se ha implementado en la plataforma de código abierto MZmine 2 y está disponible descargando MZmine 2,38 o versiones más recientes. DFF permite a los usuarios de pantalla eficientemente los datasets de DDA para espectros MS/MS que contienen iones del producto y/o pérdidas neutrales que son diagnósticos para clases enteras de compuestos. Una limitación de DFF son los iones de producto característicos y/o las pérdidas neutrales para una clase de compuestos deben ser definidos por el analista.
Por ejemplo, cada una de las más de 60 micotoxinas fumonisina diferentes identificadas como8,9 poseen una cadena lateral tricarballylic, que genera un ion m/z 157,0142 (C6H5O5-) deproducto al fragmentación de la [M-H]- ion4. Por lo tanto, todas las fumonisinas putativas en una muestra pueden detectarse utilizando DFF mediante la detección de todos los espectros MS/MS dentro de un DataSet de DDA que contienen el ion de producto m/z 157,0142 prominente. Del mismo modo, los compuestos sulfados pueden detectarse mediante la detección de datasets DDA para espectros MS/MS que contengan una pérdida diagnóstica neutra de 79,9574 da (SO3)3. Este enfoque también se ha aplicado con éxito para la detección de nuevos péptidos cíclicos5 y productos naturales que contienen residuos de triptófano o fenilalanina6.
Para demostrar la efectividad de dff y su facilidad de uso dentro de la plataforma mzmine10, hemos aplicado este enfoque al análisis de microcistinas (MCS); una clase de más de 240 toxinas relacionadas estructuralmente producidas por las cianobacterias de agua dulce11,12,13.
Las cicotoxinas más comúnmente reportadas son MCS, con el congénere MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) más frecuentemente estudiado (figura 1). Los MCs son heptapéptidos monocíclicos no ribosómicos, biosintetizados por múltiples géneros de cianobacterias incluyendo Microcystis, Anabaena, Nostoc, y Planktothrix12,13. Los MCs se componen de cinco residuos comunes y dos posiciones variables ocupadas por los aminoácidos L. Casi todos los MCs poseen un residuo característico de β-Amino ácido 3-amino-9-metoxi-2, 6, 8-trimetil-10-fenildeca-4, 6-ácido dienoico (ADDA) en la posición 511.  Las vías de fragmentación de MS/MS de MCS se describen bien14,15; el residuo de ADDA es responsable del producto prominente de MS/MS, m/z 135,0803+ (c9h11O+), así como otros iones de producto incluyendo m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (figura 2). Los datasets de DDA no dirigidos de extractos celulares de Microcystis aeruginosa pueden ser examinados para todas las microcistinas presentes utilizando estos iones diagnósticos, ya que las microcistinas tienen un residuo de ADDA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td>
			<td>CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE</td>
			<td>CPCC300</td>
			<td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteowizard (software)</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mzmine 2</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://mzmine.github.io/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipped with HESI ionization source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1290 UHPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with binary pump, autosampler, column compartment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959757-902</td>
			<td>Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 &#215; 100 mm, 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LC-MS grade Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Water</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade Formic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-772-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber HPLC vials 2 mL/caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716/5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m PTFE syringe filters</td>
			<td>Pall Corp.</td>
			<td>4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1820047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA media (pH 8.6) ( quantity / L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watanabe, M. F. &#38; Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)&#183;4H2O, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4, 40 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium glycerophosphate, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3, 20 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine, 500 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES1151B-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P(IV) metal solution, 5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bring the following to 1 L with ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaEDTA&#183;2HO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3 &#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3061-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis

Los productos naturales son a menudo biosintetizados como mezclas de compuestos estructuralmente similares, en lugar de un solo compuesto. Debido a sus características estructurales comunes, muchos compuestos dentro de la misma clase se someten a una fragmentación MS/MS similar y tienen varios iones de producto idénticos y/o pérdidas neutrales. El propósito del filtrado de fragmentación de diagnóstico (DFF) es detectar eficientemente todos los compuestos de una clase dada en un extracto complejo mediante el cribado de datasets LC-MS/MS no dirigidos para espectros MS/MS que contengan iones de productos específicos de la clase y/o pérdidas neutrales. Este método se basa en un módulo DFF implementado dentro de la plataforma MZmine de código abierto que requiere que los extractos de muestra sean analizados mediante la adquisición dependiente de los datos en un espectrómetro de masas de alta resolución, como Orbitrap cuadrupolo o masa de tiempo de vuelo cuadrupolo Analizadores. La principal limitación de este enfoque es que el analista primero debe definir qué iones de producto y/o pérdidas neutrales son específicos para la clase específica de productos naturales. DFF permite el descubrimiento posterior de todos los productos naturales relacionados dentro de una muestra compleja, incluyendo nuevos compuestos. En este trabajo, demostramos la efectividad de la DFF mediante el cribado de extractos de Microcystis aeruginosa, una prominente floración de algas dañina que causa cianobacterias, para la producción de microcistina.

La gráfica DFF generada tras el análisis de M. aeruginosa CPCC300 se muestra en la figura 4. El eje xde esta gráfica es el m/z de los iones precursores que satisfacen los criterios definidos de DFF, mientras que el eje ymuestra el m/z de todos los iones de producto dentro de los espectros de MCS MS/MS. Para este análisis, los criterios para la detección de MC incluyeron iones precursores dentro del rango m...

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Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

El filtrado de fragmentación de diagnóstico, implementado en MZmine, es un enfoque elegante de postadquisición para la pantalla de datasets LC-MS/MS para clases enteras de productos naturales conocidos y desconocidos. Esta herramienta busca espectros MS/MS para los iones de producto y/o pérdidas neutrales que el analista ha definido como diagnóstico para toda la clase de compuestos.

Descubrimiento de producto natural con filtrado de fragmentación de diagnóstico LC-MS/MS: aplicación para análisis de Microcystin

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

Los productos naturales a menudo se biosintetizan como una clase de compuestos, y no como un solo producto. El filtrado de fragmentación de diagnóstico es un enfoque sencillo para detectar todos los compuestos relacionados estructuralmente dentro de una mezcla compleja. El filtrado de fragmentación de diagnóstico, implementado en el software MZmine, permite al analista explorar conjuntos de datos de espectrometría de masas para nuevos productos naturales que de otro modo se perderían.Esto incluye nuevos bioproductos, y también nuevas toxinas. El filtrado de fragmentación diagnóstica, aplicado a las clases de toxinas que contaminan los alimentos y el agua, puede informar las evaluaciones de la exposición. Cuando se aplica a extractos microbianos y vegetales, puede resultar en el descubrimiento de nuevos compuestos.El uso del filtrado de fragmentación de diagnóstico requiere una comprensión de las características clave de espectrometría de masas en tándem que definen una clase química. Esto significa que compuestos estructuralmente similares generarán iones característicos. Mi nombre es Shawn Hoogstra.Soy técnico de investigación y desarrollador de software en nuestro centro, y voy a demostrar el procedimiento. Para preparar una muestra para el análisis de microcistina, inocular 30 mililitros de medio de crecimiento de cianobacterias estériles a aproximadamente cinco veces-10 a la quinta célula por mililitro, en condiciones asépticas, en frascos Erlenmeyer de 250 mililitros, monitoreando la densidad celular con un hemocitometro. Después de 26 días de cultivo fotoautotrófico, iluminado con luz fluorescente blanca fría utilizando un régimen de 12 horas de luz oscura a 27 grados Centígrados, con remolino una vez al día, utilice papeles de filtro de microfibra de vidrio GF/C de 47 mililitros de diámetro para separar las células del medio de cultivo por filtración al vacío.Añadir tres mililitros de 80%metanol a las células cosechadas en tubos de ensayo de 14 mililitros, y vórtice y posteriormente sonicar cada tubo durante 30 segundos. Después de la sonicación, lise las muestras con tres ciclos consecutivos de una hora, menos 20 grados-Celsius y descongelación de temperatura ambiente de 15 minutos, y filtre cada extracto de célula de cianobacteria resultante a través de filtros individuales de jeringa de politetrafluoroetileno de 0,22 micrómetros. Usando una corriente suave de gas nitrógeno, seque los extractos con un evaporador a 30 grados Celsius, y almacene los extractos secos a menos 20 grados Celsius.Para el análisis de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida, reconstituya el residuo seco que se analizará con 500 microlitros de 90% metanol y vórtice las muestras durante 30 segundos. Transfiera a un vial de cromatografía líquida de alta presión ámbar. A continuación, analice el extracto de cianobacterias utilizando un método de adquisición dependiente de datos en un espectrómetro de masas de alta resolución de acuerdo con los protocolos estándar.La mayoría de las microcistinas contienen un residuo ATA que produce dos iones de producto de diagnóstico en espectrometría de masas en tándem, M a Z 135.0803 y 163.1114. Para la preparación de conjuntos de datos de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida no dirigida, abra MZmine 2 y seleccione Importación de datos sin procesar"en El menú desplegable Métodos de datos sin procesar". A continuación, seleccione los archivos de datos del análisis de microcistina y seleccione el filtro de selección de picos para aplicar un algoritmo de centroide proporcionado por el proveedor.Para el filtrado de fragmentación de diagnóstico, o DFF, de los archivos de adquisición dependientes de datos importados, utilice el cursor para resaltar los archivos de datos y abra el menú desplegable Visualización"para seleccionar la opción DFF. En el cuadro de diálogo DFF que aparece, introduzca el intervalo de tiempos y minutos de retención cuando la clase de analitos objetivo elurácea y para encontrar el rango de relación masa-carga de la clase de analitos objetivo, incluida la posibilidad de múltiples compuestos cargados cuando corresponda. Introduzca la precisión de masa de espectrometría de masas en tándem alcanzable del instrumento de espectrometría de masas e introduzca los iones de producto específicos de la clase de la relación masa-carga.Introduzca las pérdidas neutrales específicas de la clase y defina la intensidad mínima para los iones de productos de diagnóstico y/o las pérdidas neutrales que se considerarán como un porcentaje del pico base de los espectros de espectrometría de espectrometría de masas en tándem. A continuación, seleccione una ruta de acceso y un nombre de archivo para generar los resultados y haga clic en Aceptar"para iniciar el DFF. Una gráfica DFF aparecerá una vez completada correctamente la configuración.El analista debe interpretar espectros de masa en tándem de compuestos conocidos dentro de una clase compuesta para identificar los iones de producto y/o pérdidas neutrales que son diagnósticos para toda la clase de compuestos. Esta gráfica DFF se generó tras el análisis de M.aeruginosa CPCC 300. El eje X representa esta relación masa-carga de los iones precursores que satisfacían los criterios de DFF definidos, mientras que el eje Y muestra la relación masa-carga de todos los iones de producto dentro de los espectrometrías de espectrometría de masas en tándem de microcistinas.Para este análisis, los criterios para la detección de microcistina incluyeron iones precursores dentro de la relación masa-carga de 400 a 1.200, y tiempos de retención entre dos y seis minutos. Lo más importante es que estos espectros de espectrometría de masas en tándem contenían ambas relaciones masa-carga por encima del umbral de intensidad pico de base definido del 15%. De los 4, 116 espectros de espectrometría de masas en tándem adquiridos durante el análisis, 26 cumplieron con los criterios DFF y se detectaron en el extracto de M.aeruginosa CPCC 300.Las principales microcistinas detectadas podrían asignarse con confianza como microcistina leucina arginina y ácido aspartato desmetado microcistina leucina arginina. A medida que se descubren nuevos compuestos utilizando filtrado de fragmentación diagnóstica, los organismos pueden ser cultivados a gran escala para el aislamiento y caracterización de los compuestos por RMN. Cuando se aplica a las microcistinas, el filtrado de fragmentación de diagnóstico nos permite determinar si los métodos tradicionales de cribado dirigidos detectan las principales toxinas presentes en una muestra.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

Espectroscopía de RMN como una herramienta robusta para la Evaluación Rápida del perfil lipídico de los suplementos de aceite de pescado

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Investigación

Química

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Integración de la Extracción de Fase Sólida Miniaturizada y la Detección de LC-MS / MS de 3-Nitrotirosina en Orina Humana para Aplicaciones Clínicas

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

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Mínimo ardor presiones de explosivos de emulsión a base de agua

This manuscript describes a protocol to measure the minimum pressure required for sustained burning of water-based emulsion explosives. Pumping ...

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