Name: natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Författarna tackar Heather Roshon (kanadensiska Phycological Culture Centre, University of Waterloo för att ge cyanobakterier kulturen studerade och sawsan Abusharkh (Carleton University) för tekniskt bistånd.

1. beredning av icke-riktad vätskekromatografi (LC)-MS/MS DataSet
Obs: DFF kan utföras med en hög upplöst masspektrometer och analytisk metod optimerad för en målklass av analyter. MC optimerade LC-MS/MS-förhållanden på Orbitrap masspektrometer listas i material tabellen.
<ol><li>
Ladda ner MZmine 2 (http://mzmine.github.io/) Obs: exempel data CPCC300. RAW finns på https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.<ol>
<li>Vä...

<ol>
	<li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry.">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li><li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS&#8211;NRPS.">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS&#8211;NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li><li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering.">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins.">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides.">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li><li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins.">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).</li><li>Bart&#243;k, T., Sz&#233;csi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterh&#225;zy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bart&#243;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li><li>Bart&#243;k, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+(FB1)+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).</li><li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3:+tables+of+microcystins+and+nodularins.">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li><li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blooming+algae:+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria.">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li><li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms:+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes.">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li><li>Mayumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+microcystins+by+LC/MS/MS+under+ion+trap+conditions.">Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions.</a> The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).</li><li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event.">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+(Microcystis+aeruginosa)+under+culture+conditions.">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li><li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins.">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li><li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions:+differences+of+electrospray+ionization/collision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda.">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li><li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science &#38; technology. 48 (4), 2097 (2014).</li></ol>

DFF är en rak-framåt och snabb strategi för att upptäcka hela klasser av föreningar, särskilt relevant för naturlig produkt sammansatta upptäckt. Den viktigaste aspekten av DFF är att definiera de specifika MS/MS-fragmenteringskriterierna för den aktuella klassen av föreningar. I detta representativa exempel användes DFF för att upptäcka alla adda rester som innehåller MCs som finns i ett M. aeruginosa Cellular-extrakt. Även om de allra flesta MCs innehåller en adda rester, har andra rester i de...

Tandem masspektrometri (MS/MS) är en allmänt använd masspektrometri metod som innebär att isolera en föregångare Jon och inducera fragmentering via tillämpning av aktiverings energi såsom kollisionsinducerad DISSOCIATION (CID)1. Det sätt på vilket ett jonfragment är intimt knutet till dess molekyl ära struktur. Naturliga produkter är ofta biosyntetiseras som blandningar av strukturellt likartade föreningar snarare än som en enda unik kemisk2. Strukturellt besläktade föreningar som ingår i samma bio syntetiska klass delar ofta viktiga MS/MS-fragmenteringsegenskaper, inklusive delade produkt joner och/eller neutrala förluster. Möjligheten att skärmen komplexa prover för föreningar som besitter klass-specifika produkt joner och/eller neutrala förluster är en kraftfull strategi för att upptäcka hela klasser av föreningar, vilket kan leda till upptäckten av nya naturliga produkter3, 4 för att , 5 den femte , 6. i årtionden har masspektrometri metoder såsom neutral förlust skanning och föregångare Jon skanning utförs på lågupplösta instrument har tillåtit joner med samma neutral förlust eller produkt joner att upptäckas. Men de specifika joner eller över gångar som måste definieras innan du utför experimenten. Som hög upplöst masspektrometrar har blivit mer populärt i forsknings laboratorier, är komplexa prover nu ofta screenas med icke-riktade, data-beroende förvärv (DDA) metoder. I motsats till traditionell neutral förlust och föregångare Jon skanning, kan strukturellt besläktade föreningar identifieras genom analys efter förvärvet7. I detta arbete visar vi en strategi som vi har utvecklat kallas diagnostiska fragmentering filtrering (DFF)5,6, en rak-forward och användarvänlig metod för att upptäcka hela klasser av föreningar inom komplexa matriser. Den här DFF modul er blitt genomfört in i öppen-källa, MZmine 2 plattform och tillgänglig vid data överföring MZmine 2,38 eller nye befriar. DFF tillåter användare att effektivt skärm DDA dataset för MS/MS Spectra som innehåller produkt Jon (s) och/eller neutral förlust (er) som är diagnostiska för hela klasser av föreningar. En begränsning av DFF är karakteristiska produkt joner och/eller neutrala förluster för en klass av föreningar måste definieras av analytikern.
Till exempel, var och en av de mer än 60 olika fumonisin mykotoxiner identifierade8,9 besitter en tricarballylic sido kedja, som genererar en m/z 157,0142 (C6H5O5-) produkt Jon på fragmenteringen av [M-H]- Ion4. Därför kan alla förmodade fumonisiner i ett prov detekteras med hjälp av DFF genom att screening alla MS/MS-spektra i en dda dataset som innehåller den framstående m/z 157,0142 produkt Ion. Likaså kan sulferade föreningar detekteras genom screening DDA dataset för MS/MS Spectra som innehåller en diagnostisk neutral förlust av 79,9574 da (SO3)3. Detta tillvägagångs sätt har också framgångs rikt tillämpats för att upptäcka nya cykliska peptider5 och naturliga produkter som innehåller tryptofan eller fenylalaninrester6.
För att demonstrera effektiviteten av DFF och dess användar vänlighet inom MZmine-plattformen10, har vi tillämpat denna metod för analys av microcystiner (MCS); en klass på över 240 strukturellt besläktade gifter producerade av sötvatten cyanobakterier11,12,13.
De vanligaste rapporterade cyanotoxiner är mcs, med MC-LR (leucin [L]/arginin [R]) kongen mest studerade (figur 1). MCS är monocykliska icke-ribosomala heptapeptides, biosyntetiseras av flera cyanobakterier släkten inklusive Microcystis, Anabaena, nostoc, och Planktothrix12,13. MCs består av fem gemensamma rester och två rörliga positioner upptas av L-amino syror. Nästan alla MCs besitter en karakteristisk β-amino syra 3-amino-9-metoxi-2, 6, 8-Trimetyl-10-fenyldeca-4, 6-dienoic Acid (adda) rester vid position 511.  MS/MS-fragmenteringsvägarna för MCS är väl beskrivna14,15. Adda rester är ansvarig för den framstående MS/MS produkt Jon, m/z 135,0803+ (C9H11O+) samt andra produkt joner inklusive m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (bild 2). Icke-riktade dda dataset av Microcystis aeruginosa cellulära extrakt kan screenas för alla microcystiner närvarande med hjälp av dessa diagnostiska joner, beviljas att mikrocystins har en adda rester.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td>
			<td>CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE</td>
			<td>CPCC300</td>
			<td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteowizard (software)</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mzmine 2</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://mzmine.github.io/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipped with HESI ionization source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1290 UHPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with binary pump, autosampler, column compartment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959757-902</td>
			<td>Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 &#215; 100 mm, 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LC-MS grade Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Water</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade Formic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-772-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber HPLC vials 2 mL/caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716/5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m PTFE syringe filters</td>
			<td>Pall Corp.</td>
			<td>4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1820047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA media (pH 8.6) ( quantity / L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watanabe, M. F. &#38; Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)&#183;4H2O, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4, 40 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium glycerophosphate, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3, 20 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine, 500 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES1151B-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P(IV) metal solution, 5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bring the following to 1 L with ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaEDTA&#183;2HO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3 &#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3061-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis

Naturliga produkter är ofta biosyntetiseras som blandningar av strukturellt likartade föreningar, snarare än en enda förening. På grund av deras gemensamma strukturella egenskaper genomgår många föreningar inom samma klass liknande MS/MS-fragmentering och har flera identiska produkt joner och/eller neutrala förluster. Syftet med diagnostiska fragmentering filtrering (DFF) är att effektivt upptäcka alla föreningar av en viss klass i ett komplext extrakt genom screening icke-riktade LC-MS/MS dataset för MS/MS-spektra som innehåller klass specifika produkt joner och/eller neutrala förluster. Denna metod är baserad på en DFF modul som genomförs inom öppen källkod MZmine plattform som kräver prov extrakt analyseras av data beroende förvärv på en hög upplöst masspektrometer som fyrpolig Orbitrap eller fyrpolig tid-of-Flight Mass Analysatorer. Den huvudsakliga begränsningen av denna metod är att analytikern först måste definiera vilka produkt joner och/eller neutrala förluster som är specifika för mål klassen av natur produkter. DFF möjliggör efterföljande upptäckt av alla relaterade natur produkter inom ett komplext prov, inklusive nya föreningar. I detta arbete, vi visar effektiviteten av DFF genom screening extrakt av Microcystis aeruginosa, en framträdande skadlig alg blomning orsakar cyanobakterier, för produktion av mikrocystins.

DFF-handlingen som genererats efter analysen av M. aeruginosa CPCC300 visas i figur 4. X-axeln i denna tomt är m/z av prekursorer joner som uppfyllde de definierade DFF kriterier medan y-axeln visar m/z av alla produkt joner inom mcs MS/MS Spectra. För denna analys omfattade kriterierna för MC-detektion prekursor joner inom m/z -området 440-1200, retentions tider mellan 2,00 – 6.00 min. Viktigast av ...

Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

Diagnostiska fragmentering filtrering, implementeras i MZmine, är en elegant, efter förvärvet strategi för att skärmen LC-MS/MS dataset för hela klasser av både kända och okända natur produkter. Detta verktyg söker MS/MS-spektra för produkt joner och/eller neutrala förluster som analytikern har definierat som diagnostiskt för hela klassen av föreningar.

Naturliga produkt Discovery med LC-MS/MS diagnostiska fragmentering filtrering: ansökan om Microcystin analys

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

Naturliga produkter är ofta biosyntetiseras som en klass av föreningar, och inte som en enda produkt. Diagnostisk fragmentering filtrering är en enkel metod för att upptäcka alla strukturellt relaterade föreningar inom en komplex blandning. Diagnostisk fragmentering filtrering, genomförs inom MZmine programvara, gör det möjligt för analytikern att utforska masspektrometri datamängder för nya naturliga produkter som annars skulle missas.Detta inkluderar nya bioprodukter, och även nya gifter. Diagnostisk fragmenteringsfiltrering, som tillämpas på toxinklasser som förorenar mat och vatten, kan informera exponeringsbedömningar. När den appliceras på mikrobiella och växtextrakt, Det kan resultera i upptäckten av nya föreningar.Med hjälp av diagnostiska fragmentering filtrering kräver en förståelse av de viktigaste tandem masspektrometri funktioner som definierar en kemisk klass. Detta innebär att strukturellt liknande föreningar kommer att generera karakteristiska joner. Jag heter Shawn Hoogstra.Jag är forskningstekniker och mjukvaruutvecklare på vårt center, och jag kommer att demonstrera proceduren. För att förbereda ett prov för mikrocystinanalys, inokulera 30 milliliter av sterilt cyanobakterier tillväxtmedium till ungefär fem gånger-10-till-den-femte celler per milliliter, under aseptiska förhållanden, i 250-milliliter Erlenmeyer kolvar, övervakning av celltätheten med en hemocytometer. Efter 26 dagar av fotoautotrofa kultur, upplyst med coolt vitt fluorescerande ljus med hjälp av en 12-timmars ljus-mörk regim vid 27 grader Celsius, med virvlande en gång dagligen, använd 47-milliliter diameter GF / C glas mikrofiber filter papper för att skilja cellerna från odlingsmediet genom vakuumfiltrering.Tillsätt tre milliliter av 80%metanol till de skördade cellerna i 14-milliliter provrör, och virvel och därefter sonikera varje rör i 30 sekunder. Efter ultraljudsbehandling, lysa proverna med tre på varandra följande en timme, minus-20-graders-Celsius frysa, och 15-minuters rumstemperatur töcykler, och filtrera varje resulterande cyanobakterier cell extrakt genom enskilda 0,22-mikrometer polytetrafluoreten spruta filter. Med hjälp av en mild ström av kvävegas, torka extrakten med en förångare vid 30 grader Celsius, och lagra extrakten torra vid minus-20 grader Celsius.För vätskekromatografi tandem masspektrometri analys, rekonstituera de torkade rester som skall analyseras med 500 mikroliter av 90%metanol, och virvel proverna i 30 sekunder. Överför till en bärnstensfärgad högtrycksvätskorkromatografi injektionsflaska. Analysera sedan cyanobakterierextraktet med hjälp av en databeroende förvärvsmetod på en högupplöst masspektrometer enligt standardprotokoll.De flesta mikrocystiner innehåller en ATA-rester som producerar två diagnostiska produktjoner i tandemmassapektrometri, M till och med Z 135.0803, och 163.1114. För icke-riktade flytande kromatografi tandem masspektrometri datauppsättningen förberedelse, öppna MZmine 2, och välj Raw data import "under Raw data methods"rullgardinsmenyn. Välj sedan datafilerna från microcystin-analysen och välj toppplockfiltret för att tillämpa en algoritm med leverantörslevererad centroiding.För filtrering av diagnostisk fragmentering, eller DFF, av de importerade databeroende förvärvsfilerna, använd markören för att markera datafilerna och öppna rullgardinsmenyn Visualisering"för att välja alternativet DFF. I DFF dialog rutan som visas, mata in intervallet för lagringstider och minuter när den riktade klassen av analyter kommer att elute, och att hitta massa-till-laddning förhållandet intervallet för den riktade klassen av analyter, inklusive möjligheten för flera laddade föreningar när det är lämpligt. Mata in den uppnåeliga tandemmasspektrometrimassnoggrannheten hos masspektrometriinstrumentet, och mata in de klassspecifika produktjonerna för mass-laddningsförhållandet.Ange de klassspecifika neutrala förlusterna, och definiera minimiintensiteten för diagnostiska produktjoner och/eller neutrala förluster som ska anses vara en procentandel av bastoppen för tandemmasspektrometrispektra. Välj sedan en sökväg och filnamn för att mata ut resultaten och klicka på OK"för att starta DFF. En DFF tomt kommer att visas vid ett framgångsrikt slutförande av installationen.Analytikern måste tolka tandemmassa spektra av kända föreningar inom en sammansatt klass för att identifiera produkten joner och / eller neutrala förluster som är diagnostiska för hela klassen av föreningar. Denna DFF tomt genererades efter analysen av M.aeruginosa CPCC 300. X-axeln representerar detta mass-till-laddningsförhållande av prekursorjonerna som uppfyllde de definierade DFF-kriterierna, medan y-axeln visar mass-till-laddning-förhållandet för alla produktjoner inom mikrocystinerna tandem masspektrometrispektra.För denna analys omfattade kriterierna för mikrocystindetektion prekursorjoner inom mass-till-laddning-förhållandet 400 till 1, 200 och retentionstider mellan två till sex minuter. Viktigast av allt, dessa tandem masspektrometri spektra innehöll både massa-till-laddning nyckeltal över den definierade 15% bas topp intensitet tröskel. Av de 4, 116 tandem massa spektrometri spektra förvärvats under analysen, 26 uppfyllt DFF kriterier och upptäcktes i M.aeruginosa CPCC 300 extrakt.De stora microcystins upptäckts kunde tryggt tilldelas som microcystin leucin arginin och demethyllated apartic syra microcystin leucin arginin. Som nya föreningar upptäcks med hjälp av diagnostiska fragmentering filtrering, organismerna kan odlas i stor skala för isolering och karakterisering av föreningarna av NMR. När den tillämpas på mikrocystiner, diagnostiska fragmentering filtrering tillåter oss att avgöra om traditionella riktade screeningmetoder är att upptäcka de stora toxiner som finns i ett prov.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR-spektroskopi som ett kraftfullt verktyg för snabb utvärdering av lipidprofilen av fiskolja kosttillskott

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Integration av miniatyriserad fast fas extraktion och LC-MS / MS-detektion av 3-nitrotyrosin i human urin för kliniska tillämpningar

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Minimum Burning Pressures of Water-based Emulsion Explosives

Minst Burning pressar av vattenbaserad Emulsion sprängämnen

This manuscript describes a protocol to measure the minimum pressure required for sustained burning of water-based emulsion explosives. Pumping ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Andedräkt samling från barn för sjukdom biomarkör identifiering

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

En två-stegs pyrolys-gaskromatografi metod med masspektrometrisk detektion för identifiering av Tattoo Ink ingredienser och förfalskade produkter

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Tillämpning av spänning i dynamisk ljusspridning Partikel storleksanalys

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Syntes av Aptamer-PEI-g-PEG modifierade guldnanopartiklar laddade med Doxorubicin för riktad läkemedelsleverans

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomic Force mikroskopi kombinerat med infraröd spektroskopi som verktyg för att sondera en bakteriekemi

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

Nanopartikelspårningsanalys av guldnanopartiklar i vattenhaltiga medier genom en jämförelse mellan laboratorier

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Preparation of Nanoparticles for ToF-SIMS and XPS Analysis

Förberedelse av nanopartiklar för ToF-SIMS och XPS-analys

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, ...