Name: natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Yazarlar, Heather Roshon (Kanadalı Phycological Kültür Merkezi, Waterloo Üniversitesi ve teknik yardım için Sawsan Abusharkh (Carleton Üniversitesi) çalıştı siyanobacteria kültürü sağlamak için teşekkür ederiz.

1. hedeflenen olmayan sıvı kromatografi (LC)-MS/MS veri kümeleri hazırlanması
Not: DFF, bir hedef sınıf analitiği için optimize edilmiş herhangi bir yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ve analitik yöntem kullanılarak gerçekleştirilebilir. Orbitrap kütle spektrometresi üzerinde MC optimize LC-MS/MS koşulları malzeme tablosundalistelenmiştir.
<ol><li>
MZmine 2 indirme (http://mzmine.github.io/) Not: örnek veri CPCC300. RAW...

<ol>
	<li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry.">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li><li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS&#8211;NRPS.">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS&#8211;NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li><li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering.">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins.">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li><li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides.">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li><li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins.">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).</li><li>Bart&#243;k, T., Sz&#233;csi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterh&#225;zy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bart&#243;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li><li>Bart&#243;k, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+(FB1)+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry.">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).</li><li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3:+tables+of+microcystins+and+nodularins.">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li><li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blooming+algae:+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria.">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li><li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms:+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes.">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li><li>Mayumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+microcystins+by+LC/MS/MS+under+ion+trap+conditions.">Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions.</a> The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).</li><li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event.">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+(Microcystis+aeruginosa)+under+culture+conditions.">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li><li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins.">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li><li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions:+differences+of+electrospray+ionization/collision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda.">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li><li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry:+communicating+confidence.">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science &#38; technology. 48 (4), 2097 (2014).</li></ol>

DFF, özellikle doğal ürün bileşik keşfi için ilgili bileşiklerin tüm sınıfları algılamak için bir düz ileri ve hızlı bir stratejidir. DFF en önemli yönü bileşiklerin hedeflenen sınıf için özel MS/MS parçalanma kriterleri tanımlayarak. Bu temsili örnekte, M. aeruginosa hücresel ekstresinin Içinde bulunan MCS Içeren tüm adda kalıntılarını algılamak için dff kullanılmıştır. MCs büyük çoğunluğu bir adda kalıntı içerse de, bu pozisyonda diğer kalıntılar bilinmekted...

Tandem kütle spektrometresi (MS/MS), çatışmaya bağlı ayrışma (CID)1gibi aktivasyon enerjisinin uygulanması yoluyla bir öncülü iyon yalıtmasını ve parçalanma yapılmasını içeren yaygın olarak kullanılan bir kitle spektrometresi yöntemidir. Bir iyon parçalarının moleküler yapısına yakından bağlı olduğu şekilde. Doğal ürünler genellikle tek bir benzersiz kimyasal olarak yerine yapısal benzer bileşiklerin karışımları olarak biyosentezlenmiş2. Aynı biyosentetik sınıfın parçası olan yapısal olarak ilgili bileşikler genellikle paylaşılan ürün iyonları ve/veya nötr kayıplar dahil olmak üzere anahtar MS/MS parçalanma özelliklerini paylaşır. Sınıf özel ürün iyonlarına ve/veya nötr kayıplara sahip bileşikler için karmaşık örnekleri ekran yeteneği, potansiyel olarak yeni doğal ürünlerin keşfi için önde gelen bileşiklerin tüm sınıflarını algılamak için güçlü bir stratejidir3, 4 , 5 , 6. on yıllardır, tarafsız kayıp taraması ve düşük çözünürlüklü enstrümanlara yapılan habercisi iyon taraması gibi kütle spektrometresi yöntemleri, aynı nötr kayıp veya ürün iyonlarına sahip iyonların algılanmasına izin verdi. Ancak, deneyleri gerçekleştirmeden önce tanımlanması gereken belirli iyonlar veya geçişler. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometre araştırma laboratuvarlarında daha popüler hale gelmiştir gibi, karmaşık örnekler artık genellikle hedeflenen olmayan, veriye bağımlı edinme (DDA) yöntemleri kullanılarak ekranlaştırılmış. Geleneksel nötr kayıp ve öncü iyon taramasının aksine, yapısal olarak ilgili bileşikler Post-Acquisition Analizi7ile tespit edilebilir. Bu çalışmanın içinde, karmaşık matrisler içindeki bileşiklerin tüm sınıflarını algılamak için teşhis parçalanma filtreleme (dff)5,6, bir düz ileri ve Kullanıcı dostu bir yaklaşım geliştirdiğimiz bir strateji gösteriyoruz. Bu DFF modülü açık kaynak, MZmine 2 platformu ve MZmine 2,38 veya daha yeni bültenleri indirerek kullanılabilir içine uygulandı. DFF kullanıcıların verimli ürün iyon (lar) ve/veya nötr kaybı (ler) içeren MS/MS Spectra için DDA veri kümeleri ekran sağlar bileşiklerin tüm sınıfları için teşhis. DFF bir sınırlama karakteristik ürün iyonları ve/veya bileşik bir sınıf için nötr kayıplar analist tarafından tanımlanmalıdır.
Örneğin, her biri daha fazla 60 farklı fumonisin Mikotoksinler tanımlanan 8/8bir tricarballylic yan zincir sahip, bir m/z üretir 157,0142 (C6H5O5-) ürün iyon üzerine [M-H]- Ion4' ün parçalanma. Bu nedenle, bir örnekte tüm sözde fumonisinlerden belirgin m/z 157,0142 ürün iyon içeren bir DDA veri kümesi içinde tüm MS/MS Spectra taramasında dff kullanılarak tespit edilebilir. Benzer şekilde, sülflu bileşikler 79,9574 da (SO3)3tanı nötr kaybı içeren MS/MS Spectra için DDA veri kümeleri tarama tarafından tespit edilebilir. Bu yaklaşım, yeni döngüsel peptidler tespit etmek için de başarıyla uygulanmıştır5 ve triptofan veya Fenilalanin kalıntıları içeren doğal ürünler6.
DFF ve MZmine platformu10içinde kullanım kolaylığı etkinliğini göstermek için, biz microcystins (MCS) analizine bu yaklaşımı uyguladıysanız; tatlı su siyanobacteria11,12,13tarafından üretilen üzerinde 240 yapısal olarak ilgili toksinler bir sınıf.
En sık bildirilen cyanotoksinler MCS, MC-LR ile (leucine [L]/argine [R]) türdeş sıkça okudu (Şekil 1). MCS, mikrocystis, anabaena, nostis ve planktothrix12,13gibi multipl siyanobacteria cins ile biyosentezlenmiş monokikrik olmayan ribozomal heptapeptidler. MCs beş ortak kalıntıları ve L-amino asitler tarafından işgal iki değişken pozisyonları oluşur. Neredeyse tüm MCs bir karakteristik β-amino asit 3-amino-9-metoksi-2, 6, 8-trimetil-10-fenildeca-4, 6-dienoik asit (adda) pozisyonunda kalıntı 511.  MCS MS/MS parçalanma yolları iyi açıklanan14,15; Adda kalıntı, önemli MS/MS ürün iyon, m/z 135,0803+ (c9H11O+) ve m/z 163,1114+ (c11h 15 gibi diğer ürün iyonlarından sorumludur. O+) (Şekil 2). Microcystis aeruginosa hücresel özler hedef olmayan DDA veri kümeleri, bu tanı iyonlarının kullanıldığı tüm mikrocystinler için ekranlı olabilir, Microcystins bir adda kalıntı var verilen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td>
			<td>CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE</td>
			<td>CPCC300</td>
			<td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteowizard (software)</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mzmine 2</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
			<td>http://mzmine.github.io/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive Orbitrap</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipped with HESI ionization source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1290 UHPLC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with binary pump, autosampler, column compartment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959757-902</td>
			<td>Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 &#215; 100 mm, 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LC-MS grade Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptimaLC-MS grade Water</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade Formic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall Micro 21</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-772-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber HPLC vials 2 mL/caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716/5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m PTFE syringe filters</td>
			<td>Pall Corp.</td>
			<td>4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1820047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA media (pH 8.6) ( quantity / L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watanabe, M. F. &#38; Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)&#183;4H2O, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4, 40 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20, 50 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium glycerophosphate, 100 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3, 20 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine, 500 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES1151B-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P(IV) metal solution, 5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bring the following to 1 L with ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaEDTA&#183;2HO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3 &#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>2540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3061-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural product discovery with lc-ms/ms diagnostic fragmentation filtering: application for microcystin analysis

Doğal ürünler genellikle tek bir bileşik yerine, yapısal olarak benzer bileşiklerin karışımları olarak biyosentezlenmiş. Ortak yapısal özellikleri nedeniyle, aynı sınıf içinde birçok bileşikler benzer MS/MS parçalanma geçmesi ve birkaç özdeş ürün iyonları ve/veya nötr kayıplar var. Tanılama parçalanma filtreleme (DFF) amacı, belirli bir sınıfın tüm bileşiklerini, sınıf özel ürün iyonlarını ve/veya nötr kayıpları içeren MS/MS spektrumları için hedeflenen olmayan LC-MS/MS veri kümelerini taramadan karmaşık bir ekstrakte verimli bir şekilde algılayabilmelerdir. Bu yöntem, açık kaynak MZmine platformu içinde uygulanan bir DFF modülüne dayanmaktadır, örnek ekstreler, dört ayaklı Orbitrap veya dört ayaklı zaman-uçuş kütlesi gibi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi üzerinde veriye bağımlı edinimi tarafından analiz edilmelidir Analizörleri. Bu yaklaşımın ana sınırlaması, analist ilk olarak hangi ürün iyonlarını ve/veya nötr kayıpların hedeflenen doğal ürünlerin sınıfı için spesifik olduğunu tanımlamalıdır. DFF yeni bileşikler de dahil olmak üzere karmaşık bir örnek içinde tüm ilgili doğal ürünlerin sonraki keşfi için izin verir. Bu çalışma, biz Microcystis aeruginosa, mikrocystins üretimi için siyanobacteria neden belirgin bir zararlı alg çiçek ekstraktlarının taramaları ile dff etkinliğini göstermektedir.

M. aeruginosa CPCC300 analizinin ardından oluşturulan dff Arsa Şekil 4' te gösterilir. Bu grafinin xekseni, yekseni MCS MS/MS spektrumunda bulunan tüm ürün iyonlarının m/z 'yi gösterirken, tanımlanan dff ölçütlerini karşılayan öncü iyonlarının m/z 'dir. Bu analiz için, MC algılama kriterleri, 440-1200 m/z aralığı içinde habercisi iyonlarının dahil, 2.00 – 6.00 dk arasında sak...

Watch this Scientific Journal Video about Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis at JoVE.com

Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

Tanı parçalanma, MZmine uygulanan filtreleme, bilinen ve bilinmeyen doğal ürünlerin tüm sınıflar için LC-MS/MS veri kümeleri ekrana zarif, post-edinme yaklaşımdır. Bu araç, analistin bileşiklerin tüm sınıfı için teşhis olarak tanımladığı ürün iyonlarına ve/veya nötr kayıplara yönelik MS/MS spektrumlarını arar.

LC-MS/MS tanılama parçalanma filtreleme ile doğal ürün keşfi: Microcystin analizi için uygulama

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

Doğal ürünler genellikle bileşiklerin bir sınıf olarak biyosentez, tek bir ürün olarak değil. Tanısal parçalanma filtreleme karmaşık bir karışım içinde tüm yapısal ilişkili bileşikleri tespit etmek için basit bir yaklaşımdır. MZmine yazılımı içinde uygulanan tanısal parçalanma filtreleme, analistaksi takdirde cevapsız olacak yeni doğal ürünler için kütle spektrometresi veri setleri keşfetmek için izin verir.Bu yeni biyoürünler ve aynı zamanda yeni toksinler içerir. Gıda ve suyu kirleten toksin sınıflarına uygulanan tanısal parçalanma filtreleme, maruziyet değerlendirmelerini bilgilendirebilir. Mikrobiyal ve bitki özleri uygulandığında, yeni bileşiklerin keşfi neden olabilir.Tanısal parçalanma filtreleme nin kullanılması, kimyasal sınıfı tanımlayan anahtar tandem kütle spektrometresi özelliklerinin anlaşılmasını gerektirir. Bu yapısal olarak benzer bileşikler karakteristik iyonlar üretecek anlamına gelir. Benim adım Shawn Hoogstra.Merkezimizde araştırma teknisyeni ve yazılım geliştiricisiyim ve prosedürü sergileyecekim. Mikrosistin analizi için bir örnek hazırlamak için, 30 mililitre steril siyanobakteri büyüme ortamını mililitre başına yaklaşık beş kat-10-5 hücrelere, aseptik koşullarda, 250 mililitrelik Erlenmeyer şişelerinde, hücre yoğunluğunu hemositometre ile izleyerek. 26 günlük fotoototrofik kültürden sonra, 27 santigrat derecede 12 saatlik açık-koyu bir rejim kullanarak soğuk beyaz floresan ışıkla aydınlatıldıktan sonra, günde bir kez dönen 47 mililitre lik GF/C cam mikrofiber filtre kağıtları kullanarak hücreleri vakum filtrasyon ile kültür ortamından ayırın.14 mililitrelik test tüplerinde hasat edilen hücrelere üç mililitre %80 metanol ekleyin ve girdap ve daha sonra her tüpü 30 saniye sonicate. Sonication sonra, üç ardışık bir saat, eksi-20 derece-Santigrat dondurma ve 15 dakikalık oda sıcaklığında çözülme döngüleri ile örnekleri lyse ve tek tek 0,22 mikrometre politetrafloroetilen şırınga filtreleri ile ortaya çıkan siyanobakteri hücre ekstresi filtre. Azot gazı nazik bir akım kullanarak, 30 santigrat derece bir buharlaştırıcı ile ayıklar kuru ve eksi-20 santigrat derece kuru özleri saklayın.Sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi analizi için, kurutulmuş kalıntıyı %90 metanol500 mikrolitre ile analiz edilecek şekilde yeniden oluşturur ve numuneleri 30 saniye boyunca girdap. Amber yüksek basınçlı sıvı kromatografi şişesine aktarın. Daha sonra standart protokollere göre yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi üzerinde veriye bağlı bir kazanım yöntemi kullanarak siyanobakteri ekstresini analiz edin.Mikrostinlerin çoğu tandem kütle spektrometresi, M ile Z 135.0803 ve 163.1114 olmak üzere iki tanısal ürün iyonu üreten bir ATA kalıntısı içerir. Hedeflenmemiş sıvı kromatografi spektrografi veri seti hazırlama için MZmine 2'yi açın ve Raw veri alma yöntemleri altında "drop-down menüsü" seçeneğini belirleyin. Ardından mikrosistin çözümlemesi veri dosyalarını seçin ve satıcı tarafından sağlanan santrifüj algoritması uygulamak için tepe çekme filtresini seçin.Alınan veribağımlı edinme dosyalarının tanısal parçalanma filtreleme veya DFF için, veri dosyalarını vurgulamak için imleci kullanın ve DFF seçeneğini seçmek için Visualization"drop-down menüsünü açın. Görünen DFF diyalog kutusunda, hedeflenen analit sınıfının aşılacağı bekletme süreleri ve dakika aralığını girin ve gerektiğinde birden fazla yüklü bileşik olasılığı da dahil olmak üzere hedeflenen analit sınıfının kütle-şarj oranı aralığını bulun. Kütle spektrometresi aletinin ulaşılabilir tandem kütle spektrometresi kütle doğruluğunu ve kütle-şarj oranının sınıfa özgü ürün iyonlarını girdirin.Sınıfa özgü nötr kayıpları girin ve tandem kütle spektrometresi spektrometresinin baz zirvesinin yüzdesi olarak kabul edilecek tanısal ürün iyonları ve/veya nötr kayıpları için minimum yoğunluğu tanımlayın. Ardından sonuçları çıktıalmak için bir yol ve dosya adı seçin ve DFF'yi başlatmak için Tamam"ı tıklatın. Kurulumun başarıyla tamamlanmasından sonra bir DFF çizimi görüntülenir.Analist, bileşik sınıf içindeki bilinen bileşiklerin tandem kütle spektrumlarını, tüm bileşik sınıfı için tanısal olan ürün iyonlarını ve/veya nötr kayıplarını tanımlamak için yorumlamalıdır. Bu DFF arsa M.aeruginosa CPCC 300 analizi sonrasında oluşturuldu. X ekseni, tanımlanan DFF kriterlerini karşılayan öncül iyonların kütle-yük oranını temsil ederken, y ekseni mikrosistinler içindeki tüm ürün iyonlarının kütle-şarj oranını gösterir.Bu analiziçin mikrosistin saptama kriterleri 400-1, 200 kütle-şarj oranı içinde öncül iyonlar ve iki ila altı dakika arasında tutma süreleri dahil. En önemlisi, bu tandem kütle spektrometresi spektrometresi tanımlanan %15 baz pik yoğunluk eşiğinin üzerinde kütle-yük oranları içeriyordu. Analiz sırasında elde edilen 4 tandem kütle spektrometresi spektrometresi'nden 26'sı DFF kriterlerini karşılamış ve M.aeruginosa CPCC 300 ekstresinde tespit edilmistir.Tespit edilen majör mikrosistinler mikrosisin lösin arginin ve demethylated aspartik asit mikrosist inkişaten arginin olarak güvenle atanabilir. Tanısal parçalanma filtreleme kullanılarak yeni bileşikler keşfedildikçe, organizmalar nmr tarafından izolasyon ve karakterizasyonu için büyük ölçekte yetiştirilebilir. Mikrosistinlere uygulandığında, tanısal parçalanma filtreleme, geleneksel hedefli tarama yöntemlerinin numunede bulunan ana toksinleri tespit edip etmediğini belirlememizi sağlar.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

Balık Yağı Takviyeler Lipid Profilinin Rapid Değerlendirilmesi için Sağlam Aracı Olarak NMR Spektroskopisi

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Klinik Uygulamalar İçin İnsan İdrarında 3-Nitrotirosinin Minyatür Katı Faz Çıkarma ve LC-MS / MS Algılamasının Entegrasyonu

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Minimum Burning Pressures of Water-based Emulsion Explosives

Minimum emülsiyon su bazlı patlayıcılar baskısı yazma

This manuscript describes a protocol to measure the minimum pressure required for sustained burning of water-based emulsion explosives. Pumping ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Çocuklar hastalık biyomarker keşif için derlemeden nefes

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Dövme mürekkebi maddeleri ve taklit ürünlerin tanımlanması için kütle spektrometrik tespiti ile Iki adımlı Pyrolysis-Gas Kromatografi yöntemi

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dinamik Işık Saçılma Parçacık Boyut Analizinde Gerilim Uygulaması

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Hedeflenen İlaç Teslimatı için Doxorubicin Yüklü Aptamer-PEI-g-PEG Modifiye Altın Nanopartiküllerinin Sentezi

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomik Kuvvet Mikroskopisi, Tek Bakteri Kimyasını Araştırmak için Bir Araç Olarak Kızılötesi Spektroskopi ile Birleştirildi

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

Laboratuvarlar Arası Karşılaştırma yoluyla Sulu Medyada Altın Nanopartiküllerin Nanopartikül Takip Analizi

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Preparation of Nanoparticles for ToF-SIMS and XPS Analysis

ToF-SIMS ve XPS Analizi için Nanopartiküllerin Hazırlanması

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, ...