Name: assessing cell viability and death in 3d spheroid cultures of cancer cells
Uploaded: 2019-06-16T14:00:00
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हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए कैटरीन फ्रेंकलिन मार्क और एनेट Bartels के लिए आभारी हैं और चित्र 1D में प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए AsbJr-Nielsen के लिए। यह काम Einar Willumsen फाउंडेशन, नोवो Nordisk फाउंडेशन, और Fondation Juchum (सभी SFP के लिए) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

1. स्फीरॉइड्स का उत्पादन
<ol><li>अफ़ीम गठन के लिए सेल निलंबन की तैयारी नोट: विभिन्न सेल लाइनों बहुत अलग आसंजन गुण है और सबसे उपयुक्त गोलभड़ गठन प्रोटोकॉल प्रत्येक मामले में स्थापित किया जाना चाहिए। ...

3 डी कैंसर सेल गोलाभ का उपयोग न केवल कैंसर विरोधी दवा स्क्रीनिंग के लिए एक मूल्यवान और बहुमुखी उपकरण साबित हो गया है, लेकिन यह भी ट्यूमर में उन नकल शर्तों के तहत कैंसर सेल मौत और व्यवहार्यता के विनियमन मे...

कैंसर जीव विज्ञान में बहुकोशिकीय गोलभक्ते मॉडल का प्रयोग कई दशकों पुराना 1,2है , लेकिन हाल के वर्षों में काफी गति प्राप्त की है. बड़े हिस्से में, यह कैसे दृढ़ता से कैंसर कोशिकाओं के phenotype उनके microenvironment और विशिष्ट विकास की स्थिति पर निर्भर है की वृद्धि हुई जागरूकता को दर्शाता है. ठोस ट्यूमर में microenvironment मूल रूप से इसी सामान्य ऊतकों में से अलग है. इसमें भौतिक-रासायनिक स्थितियां जैसे पीएच, ऑक्सीजन तनाव, साथ ही अंतरालीय दबाव, घुलनशील पदार्थों जैसे घुलनशील कारकों की सांद्रता प्रवणता, अपशिष्ट उत्पाद, और स्रावित संकेतन यौगिक (वृद्धि कारक, साइटोकिन्स)। इसके अलावा, इसमें अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम), सेल-सेल इंटरकोशिकीय संकेतन, और ट्यूमर3,4के विशेष तीन आयामी (3 डी) वास्तुकला के अन्य पहलुओं के संगठन शामिल हैं। 5,6. विशिष्ट सूक्ष्म पर्यावरण की स्थिति जिसमें कैंसर की कोशिकाओं मौजूद हैं, गहराई से उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल और कार्यात्मक गुणों को प्रभावित, और यह स्पष्ट है कि, 2 डी में विकसित कोशिकाओं की तुलना में, 3 डी गोलोइड के phenotype और अधिक बारीकी से नकल करता है कि विवो ट्यूमर7,8,9,10,11में से . 2 डी मॉडल, भले ही वे hypoxia, अम्लीय पीएच, और उच्च लैक्टेट सांद्रता ट्यूमर microenvironment के ज्ञात पहलुओं की नकल करने के लिए रोजगार, अभी भी ट्यूमर के भीतर उत्पन्न होने वाले physico-रासायनिक मापदंडों की ढाल पर कब्जा करने में विफल, साथ ही उनके 3 डी ट्यूमर वास्तुकला. दूसरी ओर, पशु मॉडल महंगे हैं, धीमी गति से, और नैतिक रूप से समस्याग्रस्त, और आम तौर पर, भी मानव ट्यूमर की स्थिति recapitulate करने की क्षमता में कमियां हैं. नतीजतन, 3 डी अफ़ीरॉइड सबसे ठोस कैंसर9,11,12,13के गुणों की एक विस्तृत श्रृंखला के अध्ययन में एक मध्यवर्ती जटिलता मॉडल के रूप में लागू किया गया है, 14,15,16,17.
3 डी स्फीरोइड का व्यापक रूप से नियोजित उपयोग कैंसर रोधी चिकित्सा प्रभावकारिता9,18,19,20की जांच में है . उपचार प्रतिक्रियाओं ट्यूमर microenvironment के लिए विशेष रूप से संवेदनशील हैं, tortuosity के दोनों प्रभाव को दर्शाती है, प्रतिबंधित प्रसार, उच्च अंतरालीय दबाव, और दवा वितरण पर अम्लीय पर्यावरण पीएच, और hypoxia और अन्य के प्रभाव कोशिका मृत्यु अनुक्रिया पर सूक्ष्म पर्यावरण के पहलुओं9,17. क्योंकि 3 डी अफ़ीरों के भीतर का वातावरण स्वाभाविक रूप से इन सभी गुणोंकाविकास करता है 7,8,9,10,11, 3 डी सेल संस्कृतियों को रोजगार कर सकते हैं काफी हद तक vivo स्थितियों में करने के लिए परिणामों के अनुवाद में सुधार, अभी तक कुशल और सस्ती शुद्ध विकास के उच्च throughput स्क्रीनिंग की अनुमति देते हैं. हालांकि, कैंसर कोशिकाओं की दवा प्रतिक्रिया पर अध्ययन के महान बहुमत अभी भी 2 डी शर्तों के तहत किया जाता है. यह संभावना को दर्शाता है कि, जबकि कुछ परख अपेक्षाकृत आसानी से 3 डी सेल संस्कृतियों के लिए लागू किया जा सकता है, कई, जैसे व्यवहार्यता assays, पश्चिमी blotting, और इम्यूनोफ्लोरेसींस विश्लेषण, बहुत अधिक आसानी से 3 डी में से 2 डी में किया जाता है.
वर्तमान कार्य का उद्देश्य एक 3 डी ट्यूमर नकल सेटिंग में कैंसर सेल व्यवहार्यता और अस्तित्व पर विरोधी कैंसर दवाओं के साथ उपचार के प्रभाव के विश्लेषण के लिए आसानी से सक्षम परख और सटीक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। विशेष रूप से, हम गोलाभकेदार गठन के लिए तीन अलग-अलग विधियों को प्रदान करते हैं और तुलना करते हैं, इसके बाद वृद्धि, व्यवहार्यता और औषध अनुक्रिया के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विधियाँ होती हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:408px;">2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:264px;"># C10595&#160;</td>
			<td style="width:336px;">For staining nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">5-Fluorouracil (5-FU)</td>
			<td style="width:284px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:264px;">#F6627</td>
			<td style="width:336px;">Component in chemotherapeutic treatment</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td style="width:284px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:264px;">#E3111</td>
			<td style="width:336px;">Inhibitor of NHE1</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Antibody against PARP and cPARP</td>
			<td style="width:284px;">Cell signaling</td>
			<td>#9542</td>
			<td style="width:336px;">Used in western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Antibody against Ki-67</td>
			<td style="width:284px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:264px;">#9449</td>
			<td style="width:336px;">Used for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Antibody against p53</td>
			<td style="width:284px;">Cell Signaling&#160;</td>
			<td style="width:264px;">#2524&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Used for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Antibody against &#946;-actin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:264px;">A5441</td>
			<td style="width:336px;">Used in western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Bactoagar</td>
			<td style="width:284px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:264px;">#214010</td>
			<td style="width:336px;">Used for agarose gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Benchmark protein ladder</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td>#10747-012</td>
			<td style="width:336px;">Used for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bio-Rad DC Protein Assay kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>#500-0113, #500-0114, #500-0115&#160;&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Used for protein determination from lysates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td style="width:284px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:264px;">610311</td>
			<td style="width:336px;">For cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">BX63 epifluoresence microscope</td>
			<td style="width:284px;">Olympus</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Used for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:284px;">Promega</td>
			<td style="width:264px;">#G9681</td>
			<td style="width:336px;">Used for the cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Cisplatin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:264px;">#P4394&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Component in chemotherapeutic treatment</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:408px;">Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,&#160; Ultra-low attachment, With lid, Sterile</td>
			<td style="width:284px;">Corning</td>
			<td style="width:264px;">#4520</td>
			<td style="width:336px;">Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:408px;">Corning 96 well, clear round bottom,&#160; Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile</td>
			<td style="width:284px;">Corning</td>
			<td style="width:264px;">#7007</td>
			<td style="width:336px;">Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Criterion TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:284px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:264px;">5671025</td>
			<td style="width:336px;">Used for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:408px;">Doxorubicin</td>
			<td style="width:284px;">Abcam</td>
			<td style="width:264px;">#120629</td>
			<td style="width:336px;">Component in chemotherapeutic treatment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:408px;">FLUOStar Optima Microplate reader</td>
			<td style="width:284px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Used for recording luminescence&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:408px;">Formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:284px;">VWR Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:264px;">#9713.1000&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Used for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:408px;">Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:284px;">Gibco</td>
			<td style="width:264px;">#A1413202</td>
			<td style="width:336px;">Keep at 4 &#176;C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Heat-inactivated FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:264px;">#F9665</td>
			<td style="width:336px;">Serum for growth media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:408px;">ImageJ</td>
			<td style="width:284px;">NIH</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Scientific Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Medim Uni-safe casette</td>
			<td>Medim Histotechnologie</td>
			<td>10-0114</td>
			<td style="width:336px;">Used for storage of embedded spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Mini protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:284px;">Roche Diagnostics GmBH&#160;</td>
			<td style="width:264px;"># 11836153001</td>
			<td style="width:336px;">Used for lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">MZ16 microscope</td>
			<td style="width:284px;">Leica</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Used for light microscopic images</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NuPAGE LDS 4x Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#NP0007</td>
			<td style="width:336px;">Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pierce ECL Western blotting substrate</td>
			<td style="width:284px;">Thermo scientific</td>
			<td>#32106</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ponceau S</td>
			<td style="width:284px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P7170-1L</td>
			<td style="width:336px;">Used for protein band staining</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Prism 6.0</td>
			<td style="width:284px;">Graphpad</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Propidium iodide (1mg/ml solution in water)</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td>Light sensitive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Sterile reservoirs, multichannel</td>
			<td style="width:284px;">SPL lifesciences</td>
			<td style="width:264px;">21002</td>
			<td style="width:336px;">Used for seeding cells for spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide&#160;</td>
			<td style="width:284px;">Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td style="width:264px;">#J3800AMNZ</td>
			<td style="width:336px;">Microscope glass slide used for embedding</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Tamoxifen</td>
			<td style="width:284px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:264px;">#T5648</td>
			<td style="width:336px;">Used as chemotherapeutic treatment</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Trans-blot Turbo 0.2 &#181;m nitrocellulose membranes</td>
			<td style="width:284px;">Bio-Rad</td>
			<td>#170-4159</td>
			<td style="width:336px;">Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Tris/Glycine/SDS running buffer&#160;</td>
			<td style="width:284px;">Bio-Rad&#160;</td>
			<td>#161 0732</td>
			<td style="width:336px;">Used for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:284px;">Sigma</td>
			<td>#T4174&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cell viability and death in 3d spheroid cultures of cancer cells

कैंसर कोशिकाओं के तीन आयामी गोलभॉइड दोनों कैंसर दवा स्क्रीन के लिए और कैंसर सेल जीव विज्ञान में मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं. इस तैयारी की शक्ति ट्यूमर के vivo शर्तों में कई पहलुओं की नकल करने की क्षमता में निहित है, जबकि तेजी से किया जा रहा है, सस्ते, और काफी बहुमुखी अपेक्षाकृत उच्च throughput स्क्रीनिंग की अनुमति देने के लिए. अराउंडॉइड संस्कृति की स्थिति एक ट्यूमर में भौतिक-रासायनिक ढालों को फिर से दोहरा सकती है, जिसमें बढ़ती extracellular अम्लता, लैक्टेट में वृद्धि, और ग्लूकोज और ऑक्सीजन की उपलब्धता कम करना शामिल है, जो कि अराउंडॉइड परिधि से इसके कोर तक है। इसके अलावा, यांत्रिक गुण और विवो ट्यूमर में की सेल सेल बातचीत भाग में इस मॉडल द्वारा नकल कर रहे हैं. विशिष्ट गुण और फलस्वरूप इष्टतम विकास की स्थिति, 3 डी अफ़ीरॉइड की, कैंसर कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के बीच व्यापक रूप से अलग. इसके अलावा, 3 डी स्फीरॉइड में सेल व्यवहार्यता और मृत्यु के मूल्यांकन के लिए उन तरीकों की आवश्यकता होती है जो 2 डी संस्कृतियों के लिए नियोजित लोगों से अलग होते हैं। यहाँ हम कैंसर कोशिकाओं के 3 डी गोलभों की तैयारी के लिए कई प्रोटोकॉल का वर्णन, और ऐसी संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए सेल व्यवहार्यता और कैंसर विरोधी दवाओं की प्रभावकारिता के मूल्यांकन के संदर्भ में मौत का आकलन.

स्फीरॉइड विकास परख, चित्र 1ए और चित्रा 1बीमें योजनाबद्ध रूप से सचित्र, एक 3 डी ट्यूमर में विरोधी कैंसर दवा उपचार के प्रभाव के विश्लेषण के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप ?...

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Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

यहाँ, हम 3 डी कैंसर सेल स्फीरोइड में व्यवहार्यता और मौत का मूल्यांकन करने के लिए कई सरल तरीके पेश करते हैं, जो विवो ट्यूमर में भौतिक-रासायनिक ढालों की नकल करते हैं जो 2 डी संस्कृति की तुलना में बेहतर है। इसलिए, गोलोइड मॉडल, विवो स्थितियों में बेहतर अनुवाद के साथ कैंसर दवा प्रभावकारिता के मूल्यांकन की अनुमति देता है।

कैंसर कोशिकाओं के 3 डी स्फीरॉइड संस्कृति में सेल व्यवहार्यता और मौत का आकलन

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

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तंत्रिकाबंधार्बुद में Immunohistochemistry द्वारा आयल-एंबेडेड 3d तंत्रिकाबंधार्बुद Neurosphere संस्कृतियों का मूल्यांकन

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

सह-संस्कृतियों में एम 1 मैक्रोफेज-4T1 माउस मैमेरी कार्सिनोमा कोशिकाओं में फागोसाइटिक गतिविधि की समय-चूक 2डी इमेजिंग

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

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3-आयामी स्फेरॉइड संस्कृतियों से स्टेम जैसी कोशिकाओं का अलगाव

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

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एक Perfused Microfluidic मंच में रोगी-व्युत्पन्न Xenografts के पूर्व वीवो 3 डी हाइड्रोजेल संस्कृतियों के लिए बढ़ी हुई व्यवहार्यता

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...