Name: assessing cell viability and death in 3d spheroid cultures of cancer cells
Uploaded: 2019-06-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells at JoVE.com

Vi är tacksamma mot Katrine Franklin mark och Annette Bartels för utmärkt teknisk assistans och Asbjørn Nøhr-Nielsen för att ha utfört experimenten i figur 1D. Detta arbete finansierades av Einar Willumsen Foundation, Novo Nordisk Foundation, och Fondation Juchum (alla till SFP).

1. generering av Sfäroider
<ol><li>Förbereda cell SUS pensioner för sfäroid formation Obs: olika cellinjer har mycket olika vidhäftnings egenskaper och det lämpligaste sfäroid bildnings protokollet måste fastställas i varje enskilt fall. Vi har funnit att MCF-7 och BxPC-3 celler är lämpliga för spontan sfäroid formation, medan MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 och MiaPaCa kräver tillsats av rekonstituerad källare membran för att framgångs rikt bilda sfäroider. Endast MDA-MB-231 och BxPC-3...

Användningen av 3D cancer cell sfäroider har visat sig vara en värdefull och mångsidig verktyg inte bara för cancer läkemedel screening, men också för att få mekanistiska insikt i regleringen av cancer celldöd och livs kraft under förhållanden imitera dem i tumören mikromiljö. Detta är särskilt viktigt eftersom tillgängligheten, cellulära upptag, och intracellulära effekter av kemoterapeutiska läkemedel är djupt påverkad av de fysikalisk-kemiska förhållandena i tumören, inklusive pH, syre spänni...

Användningen av multicellulära sfäroiderna modeller i cancer bio Logi är flera decennier gammal1,2, men har fått betydande driv kraft under de senaste åren. Till stor del återspeglar detta ökad medvetenhet om hur starkt fenotyp av cancer celler är beroende av deras mikromiljö och specifika tillväxt förhållanden. Mikromiljön i solida tumörer skiljer sig fundamentalt från den i motsvarande normala vävnader. Detta inkluderar fysikalisk-kemiska förhållanden såsom pH, syre spänning, samt interstitiell tryck, koncentrations gradienter av lösliga faktorer såsom näringsämnen, avfalls produkter, och utsöndras signalering föreningar (tillväxtfaktorer, cytokiner). Dessutom omfattar det organisationen av extracellulär matrix (ECM), cell-cell interaktioner och intercellulära signalering, och andra aspekter av den särskilda tredimensionella (3D) arkitektur av tumören3,4, 5,6. De specifika mikromiljömässiga förhållanden i vilka cancer celler existerar, djupt påverka deras gen uttrycks profil och funktionella egenskaper, och det är tydligt att, jämfört med den hos celler som odlas i 2D, den fenotyp av 3D sfäroider mycket mer imiterar det av in vivo-tumörer7,8,9,10,11. 2D-modeller, även om de använder hypoxi, sura pH, och höga laktat koncentrationer att efterlikna kända aspekter av tumörens mikromiljö, fortfarande inte fånga gradienter av fysikalisk-kemiska parametrar som uppstår inom tumörer, liksom deras 3D-tumör Arkitekturen. Å andra sidan, djur modeller är dyra, långsamma och etiskt problematiska, och i allmänhet, har också brister i deras förmåga att upprepa mänskliga tumör förhållanden. Följaktligen har 3D-sfäroider tillämpats som en intermediär komplexitets modell i studier av ett brett spektrum av egenskaper hos de flesta solida cancer former9,11,12,13, 14,15,16,17.
En allmänt anställd användning av 3D sfäroider är i screening analyser av cancer terapi effekt9,18,19,20. Behandlings svar är särskilt känsliga för tumörmikromiljö, vilket återspeglar både effekten av tortuositet, begränsad diffusion, hög interstitiell tryck, och sura miljömässiga pH på läkemedelstillförsel, och effekterna av hypoxi och andra aspekter av mikromiljö på celldöd svar9,17. Eftersom miljön inom 3D sfäroider naturligt utvecklar alla dessa egenskaper7,8,9,10,11, anställa 3D cell kulturer kan avsevärt förbättra översättningen av resultaten till in vivo-förhållanden, men samtidigt möjliggöra en effektiv och prisvärd screening av netto tillväxten. Emellertid, den stora majoriteten av studier på drogen svar av cancer celler är fortfarande utförs under 2D villkor. Detta återspeglar sannolikt att, medan vissa analyser relativt enkelt kan genomföras för 3D cell kulturer, många, såsom genomförbarhet analyser, Western blotting, och immunofluorescens analys, är mycket mer bekvämt gjort i 2D än i 3D.
Syftet med det nuvarande arbetet är att ge lätt mottaglig analyser och precisa protokoll för analyser av effekten av behandling med anti-cancer läkemedel på cancer cellernas livs kraft och överlevnad i en 3D-tumör härma inställning. Specifikt, vi tillhandahåller och jämför tre olika metoder för sfäroiden bildas, följt av metoder för kvalitativa och kvantitativa analyser av tillväxt, lönsamhet och drog svar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:408px;">2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:264px;"># C10595&#160;</td>
			<td style="width:336px;">For staining nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">5-Fluorouracil (5-FU)</td>
			<td style="width:284px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:264px;">#F6627</td>
			<td style="width:336px;">Component in chemotherapeutic treatment</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td style="width:284px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:264px;">#E3111</td>
			<td style="width:336px;">Inhibitor of NHE1</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Antibody against PARP and cPARP</td>
			<td style="width:284px;">Cell signaling</td>
			<td>#9542</td>
			<td style="width:336px;">Used in western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Antibody against Ki-67</td>
			<td style="width:284px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:264px;">#9449</td>
			<td style="width:336px;">Used for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Antibody against p53</td>
			<td style="width:284px;">Cell Signaling&#160;</td>
			<td style="width:264px;">#2524&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Used for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Antibody against &#946;-actin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:264px;">A5441</td>
			<td style="width:336px;">Used in western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Bactoagar</td>
			<td style="width:284px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:264px;">#214010</td>
			<td style="width:336px;">Used for agarose gel preparation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Benchmark protein ladder</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td>#10747-012</td>
			<td style="width:336px;">Used for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bio-Rad DC Protein Assay kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>#500-0113, #500-0114, #500-0115&#160;&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Used for protein determination from lysates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td style="width:284px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:264px;">610311</td>
			<td style="width:336px;">For cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">BX63 epifluoresence microscope</td>
			<td style="width:284px;">Olympus</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Used for fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:284px;">Promega</td>
			<td style="width:264px;">#G9681</td>
			<td style="width:336px;">Used for the cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Cisplatin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:264px;">#P4394&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Component in chemotherapeutic treatment</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:408px;">Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,&#160; Ultra-low attachment, With lid, Sterile</td>
			<td style="width:284px;">Corning</td>
			<td style="width:264px;">#4520</td>
			<td style="width:336px;">Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:408px;">Corning 96 well, clear round bottom,&#160; Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile</td>
			<td style="width:284px;">Corning</td>
			<td style="width:264px;">#7007</td>
			<td style="width:336px;">Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Criterion TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:284px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:264px;">5671025</td>
			<td style="width:336px;">Used for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:408px;">Doxorubicin</td>
			<td style="width:284px;">Abcam</td>
			<td style="width:264px;">#120629</td>
			<td style="width:336px;">Component in chemotherapeutic treatment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:408px;">FLUOStar Optima Microplate reader</td>
			<td style="width:284px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Used for recording luminescence&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:408px;">Formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:284px;">VWR Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:264px;">#9713.1000&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Used for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:408px;">Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:284px;">Gibco</td>
			<td style="width:264px;">#A1413202</td>
			<td style="width:336px;">Keep at 4 &#176;C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Heat-inactivated FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:264px;">#F9665</td>
			<td style="width:336px;">Serum for growth media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:408px;">ImageJ</td>
			<td style="width:284px;">NIH</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Scientific Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Medim Uni-safe casette</td>
			<td>Medim Histotechnologie</td>
			<td>10-0114</td>
			<td style="width:336px;">Used for storage of embedded spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Mini protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:284px;">Roche Diagnostics GmBH&#160;</td>
			<td style="width:264px;"># 11836153001</td>
			<td style="width:336px;">Used for lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">MZ16 microscope</td>
			<td style="width:284px;">Leica</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Used for light microscopic images</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NuPAGE LDS 4x Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#NP0007</td>
			<td style="width:336px;">Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pierce ECL Western blotting substrate</td>
			<td style="width:284px;">Thermo scientific</td>
			<td>#32106</td>
			<td>Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ponceau S</td>
			<td style="width:284px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P7170-1L</td>
			<td style="width:336px;">Used for protein band staining</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Prism 6.0</td>
			<td style="width:284px;">Graphpad</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:336px;">Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Propidium iodide (1mg/ml solution in water)</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td>Light sensitive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:408px;">Sterile reservoirs, multichannel</td>
			<td style="width:284px;">SPL lifesciences</td>
			<td style="width:264px;">21002</td>
			<td style="width:336px;">Used for seeding cells for spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide&#160;</td>
			<td style="width:284px;">Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td style="width:264px;">#J3800AMNZ</td>
			<td style="width:336px;">Microscope glass slide used for embedding</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Tamoxifen</td>
			<td style="width:284px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:264px;">#T5648</td>
			<td style="width:336px;">Used as chemotherapeutic treatment</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Trans-blot Turbo 0.2 &#181;m nitrocellulose membranes</td>
			<td style="width:284px;">Bio-Rad</td>
			<td>#170-4159</td>
			<td style="width:336px;">Used for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Tris/Glycine/SDS running buffer&#160;</td>
			<td style="width:284px;">Bio-Rad&#160;</td>
			<td>#161 0732</td>
			<td style="width:336px;">Used for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:408px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:284px;">Sigma</td>
			<td>#T4174&#160;</td>
			<td style="width:336px;">Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cell viability and death in 3d spheroid cultures of cancer cells

Tredimensionella sfäroider av cancer celler är viktiga verktyg för både cancer drog skärmar och för att få mekanistisk insikt i cancer cell bio Logi. Kraften i denna beredning ligger i dess förmåga att efterlikna många aspekter av in vivo förhållanden av tumörer samtidigt som snabb, billig och mångsidig nog att tillåta relativt hög genom strömning screening. Den sfäroiden kultur förhållanden kan upprepa de fysikalisk-kemiska gradienter i en tumör, inklusive den ökande extracellulär syra, ökad laktat, och minskar glukos och syre tillgänglighet, från sfäroid periferi till sin kärna. Också, de mekaniska egenskaperna och cell-cell interaktioner av in vivo tumörer är delvis härmade av denna modell. De specifika egenskaper och därmed den optimala odlings förhållanden, av 3D sfäroider, skiljer sig mycket mellan olika typer av cancer celler. Dessutom kräver bedömningen av cellernas livs kraft och död i 3D-sfäroider metoder som skiljer sig delvis från dem som används för 2D-kulturer. Här beskriver vi flera protokoll för att förbereda 3D sfäroider av cancer celler, och för att använda sådana kulturer för att bedöma cellernas livs kraft och död i samband med utvärdering av effekten av läkemedel mot cancer.

Sfäroid tillväxt analyser baserade på sfäroid formation protokoll schematiskt illustreras i figur 1A och figur 1B, användes som utgångs punkt för analys av effekterna av anti-cancer läkemedel behandlingar i en 3D-tumör inställning av härma. Den lätthet med vilken sfäroider bildas är cellinjen specifika, och vissa cellinjer kräver tillskott med rBM för att bilda sammanhängande sfäroiderna22</su...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells at JoVE.com

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Här presenterar vi flera enkla metoder för att utvärdera lönsamhet och död i 3D-cancer cell sfäroider, som efterliknar fysikalisk-kemiska gradienter av in vivo tumörer mycket bättre än 2D-kulturen. Den sfäroiden modell, därför, tillåter utvärdering av cancer drogen effekt med förbättrad översättning till in vivo villkor.

Bedömning cell livs kraft och död i 3D Sfäroiden kulturer av cancer celler

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

De protokoll som presenteras här har optimerats för 3D-kultur och möjliggör effektiv och prisvärd undersökning av processer i samband med cancer celltillväxt, spridning och död i en 3D-miljö. De främsta fördelarna med att använda 3D-kultur är att de är en unik möjlighet för rekapitulering viktiga aspekter av tumören mikromiljö in vitro. 3D sfäroid är ett viktigt verktyg för cancer läkemedelsscreening, som alltmer används för att förbättra översättningen mellan in vitro och in vivo villkor i cancerterapi forskning.Vissa av protokollen kräver en viss övning och skicklighet. Detta gäller särskilt för att producera sfäroider genom handdroppmetoden, och för inbäddning av sfäroider för immunohistokemi. Eftersom viktiga delar av dessa förfaranden är svåra att beskriva skriftligen, till exempel hur man sätter in sfäroider i en droppe agaros, visuell demonstration kommer att hjälpa forskare att utföra dessa förfaranden.Späd den beredda cellupphängningen i ett 15 milliliterrör för att få den optimala celltätheten. Överför den utspädda cellupphängningen till en steril reservoar, och använd en flerkanalig pipett för att dosera ut 200 mikroliter i den tidigare preparerade plattan. Inkubera vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid och 95%luftfuktighet.Varannan till var tredje dag, förvärva lätta mikroskopiska bilder av sfäroiderna. Efter att ha förvärvat bilderna, ta bort 100 mikroliter av det förbrukade mediet från varje brunn, och ersätta den med 100 mikroliter av färskt medium. Först tina rekonstituerade källaren membran på is.Förvara alla individuellt inslagna plattor och reservoarer på is före användning. Därefter späd den beredda cellupphängningen i ett 15-milliliterrör för att erhålla den optimala celltätheten. Placera röret som innehåller den utspädda cellupphängningen på is.Fyll plastbehållarna med is och för över dem i huven. Överför de kylda plattorna och reservoarerna till en cellkulturhuva. Placera tillbaka plattorna och reservoarerna på is.Resuspend rBM försiktigt för att säkerställa en homogen gel. Tillsätt den optimala koncentrationen av rBM till de kylda cell suspensionerna. Invertera röret för att säkerställa att rBM och cellupphängningen blandas ordentligt.Sedan överföra denna blandning till en steril reservoar, och använd en flerkanalig pipett för att fördela 200 mikroliter till varje brunn av en kyld, ultra-låg-fastsättning, 96-brunnsplatta. Centrifugera plattan vid 750 gånger g i 15 minuter för att säkerställa att cellerna är klustrade tillsammans när rBM härdar. Använd centrifugen mjuk nedstigning eller minimal bromsfunktion.Först lägger du till sex milliliter PBS till en cellodlingsrätt. Späd den beredda cellupphängningen för att få en lämplig utspädning. En praktisk utspädning är 50, 000 celler per milliliter.Häll cellupphängningen i en steril reservoar och använd en flerkanalig pipett för att noggrant placera upp till 30 droppar suspension i locket på cellodlingsfatet, vilket resulterar i en koncentration på 2000 celler per droppe. I en snabb men kontrollerad rörelse, invertera locket och placera den ovanpå cellodlingsskålen som innehåller PBS. Inkubera vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid och 95%luftfuktighet i fyra till sex dagar.Om sfäroiderna ska användas för protein lysater eller inbäddning, dra dem genom att ta bort locket, luta den, och sedan tvätta ner dropparna med en milliliter uppvärmda medier. Överför det resulterande sfäroidinnehållande mediet till ett 1,5 milliliterrör. Låt sfäroiden lägga sig till botten av röret innan du fortsätter med protein lysates eller inbäddning.Klipp slutet av en P200-pipettspets för att lättare fånga sfäroiderna utan att störa deras struktur. För varje villkor, dra minst 12 men helst mellan 18 och 24 sfäroider i en 1,5 milliliter rör. Placera rören på is och låt sfäroiderna lägga sig nedtill.Därefter flyttar du från det sterila celllaboratoriet till det vanliga laboratoriet. Tvätta sfäroiderna två gånger i en milliliter iskall en X PBS, se till att låta sfäroiderna bosätta sig innan du tar bort PBS mellan varje tvättsteg. Därefter aspirera så mycket PBS som möjligt utan att störa eller ta bort sfäroiderna.Tillsätt fem mikroliter av uppvärmd lysbuffert med fosfatas- och proteashämmare per sfäroid. Vortexa sfäroiderna i 30 sekunder och utför sedan en snabbcentrifugering i 10 sekunder. Upprepa dessa intervall av virvel- och centrifugering i fem till 10 minuter, eller tills sfäroiderna är upplösta.Efter att du har förberett PI-lösningen ska du ta bort 100 mikroliter medium från varje brunn i 96-brunnsplattan, och se till att inte ta bort sfäroiderna. Tillsätt 100 mikroliter uppvärmt en X PBS till varje brunn, följt av att ta bort 100 mikroliter vätska från brunnarna. Upprepa detta tvättsteg tre gånger för att tvätta bort eventuellt kvarvarande medium.Därefter lägger du till 100 mikroliter av PI-lösningen till varje brunn. Täck plattan i aluminiumfolie och inkubera för 37 grader Celsius med 5%koldioxid och 95%luftfuktighet i 10 till 15 minuter. Efter detta upprepa tvättprocessen med uppvärmd en X PBS tre gånger, som tidigare beskrivits, för att tvätta ut PI-lösningen och minska bakgrundssignalen vid bildbehandling.Med hjälp av ett epifluorescensmikroskop, avbilda sfäroiderna. Öppna flerkanalsmenyn inom bildhanteringsprogrammet. Ställ in exponeringstiden för de relevanta kanalerna och tryck på Läs inställningar efter justering av varje kanal.Öppna Z-stack-menyn och definiera start och genom att justera bildfokus. Initialt har sfäroiden ur fokus, sedan flytta brännpunkten genom hela sfäroid tills bilden blir suddig igen. Justera sedan stegstorleken så att den blir mellan 18 till 35 mikrometer, och tryck på Start.Till att börja med fixa sfäroiderna i en rökhuva på dag ett som beskrivs i textprotokollet. På dag två, placera agarosgeln i en vattenfylld bägare i en mikrovågsugn för att värma den och hålla gelen varm på en bänkskiva värmeplatta inställd på 60 grader Celsius, tills det behövs. Tvätta sfäroiderna två gånger i rökhuven med en milliliter iskall en X PBS per tvätt.Sedan aspirera de flesta av PBS. Förbered en 20 mikroliterpipett genom att skära den i en lutning för att få en spetsigare spets med ett större hål. Efter detta, gör en agarosgel droppe på ett mikroskop slide.Placera objektglaset på ett varmt värmeblock för att förhindra att agarosen stelnar. Med hjälp av den modifierade pipettspetsen fångar du så många sfäroider som möjligt i en volym på 15 till 20 mikroliter. Injicera försiktigt sfäroiderna i mitten av agarosgeldroppen, se till att inte röra mikroskopets glidning.Inkubera i rumstemperatur eller vid fyra grader i fem till 10 minuter för att låta agarosgeln sjunka härda. När geldroppen har stelnat något, men är fortfarande ganska mjuk, använd en skalpell för att försiktigt driva den från mikroskopet glida in i en plastvävnadskassett. Överför vävnadskassetten till en bägare fylld med etanol och förvara i rumstemperatur.I denna studie presenteras en rad metoder för analys av anti-cancer behandling-inducerad förändringar i cancer cell livskraft och död i 3D-kultur. Koncentrationen av rBM tillsatta kan djupt påverka morfologi av sfäroiderna. Tillsats av upp till 2,5%rBM möjliggör sfäroidbildning i SKBr- 3 bröstcancerceller, utan ytterligare effekt vid högre koncentrationer.Däremot, BxPC-3 pankreascancer celler spontant bildar små kompakta sfäroider. I denna celltyp, öka rBM till 1,5%eller över framkallar en distinkt morfologisk förändring från sfäroid till mer invecklade strukturer med utsprång och invaginations. Ett exempel på användning av sfäroidkulturer för screening av kemoterapieffekt visas här.Ljus mikroskop bilder förvärvas varannan till tre dagar under en dos respons experiment utförs för att bestämma den dos som är nödvändig för 50%minskad livskraft i MDA-MB-231 bröstcancerceller. Den rumsliga arrangemang av döda celler på en ökande koncentration av en hämmare kan visualiseras med hjälp av PI färgning. Som sett visar kontrollsfäroider en begränsad nekrotisk, sen apoptotisk kärna, medan de döda cellerna fördelas över hela sfäroiden när koncentrationen av hämmare ökas.Den sfäroidteknik som visas här kan tillämpas på många andra analyser, såsom 3D-invasion, migration eller mikroforetisk analys. Det är också tillämpligt för samkulturer med fibroblast, adipocyter, eller immunceller, som kan ge viktig information om cellulära interaktioner i tumören mikromiljö. Utvecklingen av denna teknik har varit mycket viktigt för att belysa rollen av tumören mikromiljö i ett flertal aspekter av cancer utveckling, inklusive genuttryck, invasion, och behandling bistånd.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Med hjälp av funktionsgenomik screening för att identifiera potentiellt ny läkemedelsmål för cancercellernas Spheroid Kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Avdunstning minskande Culture skick Ökar Reproducerbarhet av flercelliga Sfäroid Bildning i mikrotiterplattor

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Förberedelse och metabola haltbestämning av 3-dimensionell sfäroid samtidig kulturer av pankreascancer celler och fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapi testning i sfäroid-baserat 3D Cell kultur modell för huvud och hals skivepitelcancer

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

En 3D Organotypic melanom sfäroid hud modell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identifiering, histologiska karakteriseringen och dissektion av mus prostata lober för i Vitro 3D sfäroid kultur modeller

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Utvärdering av biomarkörer i gliom av immunohistokemi på Paraffin-inbäddat 3D gliom Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Time-lapse 2D-avbildning av fagocytos aktivitet i M1 Makrofage-4T1 mus bröstcancerceller i Co-kulturer

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering av Stem-liknande celler från 3-dimensionella sfäroid kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Förbättrad livskraft för Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer av patient-derived Xenografts i en Perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...