توفر هذه الطريقة نهجًا مجانيًا قبل السريرية لدراسة الاستجابة الخلوية المباشرة للدم في الدماغ بعد السكتة الدماغية النزفية ، وهي حالة خطيرة للغاية لا تتوفر لدينا أدوية محددة للمرضى. على عكس نماذج القوارض ، تسمح لنا شفافية يرقات أسماك الحمار الوحشي بمراقبة الاستجابات الخلوية داخل أدمغة الحيوانات الحية السليمة في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الفلوري. للبدء، استخدم مصفاة الشاي لجمع جميع الأجنة المخصبة من التفريخ الطبيعي في صناديق التربية المنتجة من ذكر واحد وواحد إلى اثنين من الحمار الوحشي البالغ الإناث.
نقل 100 جنين إلى كل طبق بيتري يحتوي على متوسط جنين E3 القياسي. احتضان في 28 درجة مئوية والمرحلة وفقا للمبادئ التوجيهية القياسية. في ست ساعات بعد الإخصاب، وإزالة الأجنة الميتة وغير المخصبة من الطبق باستخدام ماصة باستور ووضع الأطباق مرة أخرى في الحاضنة.
في 24 ساعة بعد الإخصاب، تحت مجهر ستيريو مشرق المجال، واستخدام ملقط تشريح رقيقة جدا حادة للياقة الأجنة لعلاج أتورفاستاتين. ثم إضافة 30 ملليلتر من الجنين E3 المتوسطة إلى اثنين من الأطباق بيتري نظيفة, واحد للعلاج والآخر للسيطرة. إزالة 60 ميكرولترات من ماء الجنين من طبق المعالجة وإضافة 60 ميكرولترات من 0.5 ملليمولار أتورفاستاتين لتحقيق 80٪ من اليرقات النزف.
باستخدام ماصة باستور، قم بنقل 100 جنين في أقل قدر ممكن من الماء إلى كل طبق. احتضان الأطباق اثنين في 28 درجة مئوية. في أي وقت بعد 50 ساعة بعد الإخصاب ، تحت المجهر استخدام ماصة باستور لفصل الأسماك النزفية بعناية من السكان غير النزف ونقل اليرقات إلى أطباق جديدة تحتوي على وسائل الإعلام E3 الطازجة.
لتسهيل فصل اليرقات الإيجابية النزفية ، يمكنك استخدام الأسماك بدون صبغة أو أسماك تعبر عن البروتين الفلوري في خلايا الدم الحمراء. في اليوم الثالث ، تحت مجهر الفلورسنت فحص اليرقات لضمان التعبير عن البروتين الفلورسنت. ثم تعبئة ورقة ضوء تصاعد الغرفة مع E3 وسائل الاعلام التي تحتوي على 0.2٪ MS-222 ل التخدير.
باستخدام ماصة باستور، نقل قطرة واحدة تحتوي على يرقات واحدة إلى ست يرقات إلى سطح طبق بيتري جاف لتركيبها. استخدام ماصة لإزالة السائل قدر الإمكان. أضف قطرة 1.5٪ تذوب منخفضة agarose من كتلة الحرارة 45 درجة مئوية إلى اليرقات واستخدام 800 ميكرومتر تصاعد الشعيرية لرسم اليرقات حتى الرأس أولا.
إذا لم يكن تحديد المواقع دقيقًا ، فطرد اليرقات من الأغاروز وقذفها مرة أخرى. اترك الشعيرات الدموية لتبرد ثم أدخلها في غرفة ورق الضوء. على برنامج التصوير ZEN، اضغط باستمرار لتوجيه اليرقات والصحافة الحصول على الحصول على صور z-المكدس من الرأس بين العدسات العين.
في علامة التبويب المعالجة، قم بإنشاء صورة إسقاط أقصى كثافة من كل مكدس z. لاختيار عشوائيًا لم مقايسة الحركة ، قم بنقل 24 يرقات بعد التخدير إلى وسائط E3 الطازجة والسماح للحيوانات بالتعافي من التخدير. بعد أن تعافت اليرقات بالكامل من التخدير ، باستخدام ماصة مع نهاية نقل القطع استعادت اليرقات إلى E3 المتوسطة بدون أزرق الميثيلين.
لوحة يرقة واحدة في ملليلتر واحد في بئر من 24 لوحة جيدا. قم بتحميل اللوحة في غرفة الكاميرا. في برنامج تتبع EthoVision XT، اضبط إعدادات التجربة لإعداد روتين الإشعال بالضوء الأبيض لزيادة السباحة التلقائية والحركة الاختبارية لمدة 10 دقائق.
كرر المعاملة الحركة في 96 و 120 ساعة بعد الزهازة. تقييم موت خلايا الدماغ باستخدام في كل مكان مُغَرَّفٍ مُجَرَّدًا Annexin V M الوريدي للمراسلين النتائج في مجموعات واضحة محددة من الخلايا المحتضرة في اليرقات النزفية التي لا توجد في جميع اليرقات غير النزفية التي تشير إليها صور الحقل الفلوري الساطع الأخضر التي تظهر وجود نزيف في الدماغ. وقد لوحظت الخلايا المحتضرة في كل من Atorvastatin وفقاعات نماذج الرأس ليرقات النزف.
يتغير شكل التشكل في الضامة الإيجابية MPEG1 في اليرقات الإيجابية في الدماغ أثناء حدوثها مع اعتماد الخلايا في شكل الأموبيويد الدائري النشط. تم رصد هذه الخلايا المستديرة المنشطة بمرور الوقت لإظهار استجابة بلعوية متزايدة من ubiquitin يفرز الملحق الخامس M الوريدي التعبير عن الخلايا الميتة في نزيف الأنف الوحشية الإيجابية. ويرتبط نزيف الدماغ مع انخفاض كبير في الحركة في 72 و 96 ساعة بعد الإخصاب بالمقارنة مع الضوابط السلبية النزفية داخل المخ.
حركية في 120 ساعة بعد الإخصاب يتعافى إلى مستويات خط الأساس القريبة. الجانب الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو التأكد من فحص اليرقات بدقة لوجود أو عدم وجود نزيف في الدماغ قبل الانتقال إلى فحص الظاهري. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النموذج لفحص المخدرات لتحديد ما إذا كان يمكن تحسين شدة النمط الظاهري على بعد نزيف, وهو النهج الذي قد يؤدي بنا إلى تحديد المرشحين المخدرات الجديدة في المستقبل.
هذه التقنية تسمح لنا لاستكشاف الاستجابات الخلوية مباشرة بعد نزيف في الدماغ خلال نقطة زمنية التي كان من الصعب جدا دراسة قبل الآن. على الرغم من أن أيا من الكواشف أو الصكوك المذكورة في هذا البروتوكول هي خطرة على وجه التحديد، يجب اتخاذ الرعاية والاحتياطات القياسية في جميع أنحاء كلما باستخدام المواد الكيميائية، الحادة، أو الليزر.
