Denne metode giver en gratis præklinisk tilgang til at studere den umiddelbare cellulære reaktion på blod i hjernen efter en hæmoragisk slagtilfælde, en meget alvorlig tilstand, som vi ikke har nogen specifik medicin til rådighed for patienter. I modsætning til gnaver modeller, gennemsigtighed zebrafisk larver giver os mulighed for at observere cellulære reaktioner i hjernen på levende intakte dyr i realtid ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Til at begynde, bruge en te si til at indsamle alle befrugtede embryoner fra naturlige gydning i avl kasser fremstillet af en han og en til to kvindelige voksne zebrafisk.
Overfør 100 embryoner til hver petriskål, der indeholder standard E3 embryo medium. Inkubere ved 28 grader Celsius og fase i henhold til standard retningslinjer. På seks timer efter befrugtning, fjerne døde og ubefrugtede embryoner fra fadet ved hjælp af en Pasteur pipette og sætte retterne tilbage i rugemaskinen.
På 24 timer efter befrugtning, under en lyse-felt stereomikroskop, bruge skarpe ultra tynd dissektion snørebånd til at decorionate embryoner til Atorvastatin behandling. Derefter tilsættes 30 milliliter E3 embryo medium til to rene petriskåle, en til behandling og den anden til kontrol. Fjern 60 mikroliter embryovand fra behandlingsskålen, og tilsæt 60 mikroliter 0,5 millimolar Atorvastatin for at opnå 80% larverblødt.
Ved hjælp af en Pasteur pipette, overføre 100 embryoner i så lidt vand som muligt til hver skål. Inkuber de to retter ved 28 grader Celsius. På ethvert tidspunkt efter 50 timer efter befrugtningen, under mikroskopet bruge en Pasteur pipette til omhyggeligt at adskille hemorrhaged fisk fra ikke-hemorrhaged populationer og overføre larver til nye retter, der indeholder friske E3 medier.
For at gøre det lettere at adskille blødning positive larver, kan du bruge fisk uden pigment eller fisk, der udtrykker fluorescerende protein i røde blodlegemer. På den tredje dag, under en fluorescerende mikroskop skærmen larverne for at sikre udtryk for fluorescerende protein. Fyld derefter lysarkets monteringskammer med E3-medier, der indeholder 0,2%MS-222 for bedøvelse.
Ved hjælp af en Pasteur pipette, overføre en enkelt dråbe, der indeholder en til seks larver til en tør petriskål overflade til montering. Brug en pipette til at fjerne så meget væske som muligt. Tilsæt et fald på 1,5% lav smelte agarose fra 45 grader Celsius varmeblok til larverne og bruge en 800 mikrometer montering kapillær til at trække larverne op hovedet først.
Hvis positionering ikke er nøjagtig, udvises larverne fra agarose og monteres igen. Lad kapillæren køle af, og indsæt det derefter i det lyse arkkammer. På ZEN imaging software, skal du trykke kontinuerligt at orientere larver og tryk erhverve at erhverve z-stack billeder af hovedet mellem øjet linser.
Opret et billede med maksimal intensitetsprojektion fra hver z-stak under fanen behandling. For tilfældigt at vælge for motilitetsanalyse overføres 24 larver efter anæstesi til friske E3-medier og gør det muligt for dyrene at komme sig efter anæstesi. Efter larver er fuldt tilbagebetalt fra anæstesi, ved hjælp af en pipette med endesnittet overførsel genvundet larver i E3 medium uden methylenblåt.
Plade en larver i en milliliter pr. brønd af en 24 brøndplade. Læg pladen ind i kamerakammeret. I EthoVision XT tracking software, justere eksperimentet indstillinger til at oprette en hvid lys startle rutine for at øge spontan svømning og analyse bevægelse i 10 minutter.
Gentag bevægelsesanalysen ved 96 og 120 timer efter befrugtningen. Vurdering af hjernecelledød ved hjælp af en transgen ubiquitin udskilles Annexin V M venous reporter linje resulterer i klare konkrete klynger af døende celler i hemorrhaged larver, der er fraværende i alle ikke-hemorrhaged larver angivet ved grøn fluorescens Bright-field billeder viser tilstedeværelsen af hjerneblødninger. Døende celler blev observeret i både Atorvastatin og boble hoved modeller for hemorrhaged larver.
Morfologien af MPEG1 positive makrofager ændringer i intracerebral blødning positiv larver som cellerne vedtage i aktiv afrundet amoeboid form. Disse aktiverede afrundede celler blev overvåget over tid for at vise en øget fagocytisk respons af ubiquitin udskilles Annexin V M venøse udtrykke døende celler i intracerebral blødning positive larver. Hjerneblødning er forbundet med et betydeligt fald i motilitet på 72 og 96 timer efter befrugtning i forhold til intracerebral blødning negative søskende kontrol.
Motilitet på 120 timer efter befrugtningen genopretter til nær baseline niveauer. Det vigtigste aspekt af denne procedure er at være sikker på at grundigt undersøge larverne for tilstedeværelsen eller fraværet af hjerneblødninger, før du går videre til fænotypebestemmelse assays. Denne model kan også bruges til narkotika screening for at afgøre, om fænotype sværhedsgrad kan forbedres efter en blødning, en tilgang, som kan føre os til at identificere nye narkotika kandidater i fremtiden.
Denne teknik giver os mulighed for at udforske de cellulære reaktioner umiddelbart efter en blødning i hjernen i løbet af et tidspunkt, som har været så notorisk svært at studere før nu. Selv om ingen af de reagenser eller instrumenter, der er beskrevet i denne protokol, er særligt farlige, skal der tages standardpleje og -forholdsregler overalt, når der anvendes kemikalier, skarpe eller lasere.