Denna metod ger en gratis pre-kliniska metoden för att studera den omedelbara cellulära svar på blod i hjärnan efter en hemorragisk stroke, ett mycket allvarligt tillstånd som vi inte har några specifika mediciner tillgängliga för patienter. Till skillnad från gnagare modeller, öppenhet zebrafish larver tillåter oss att observera cellulära svar i hjärnan hos levande intakta djur i realtid med hjälp av fluorescerande mikroskopi. Till att börja med, använd en tesil för att samla alla befruktade embryon från naturlig lek i avelslådor som produceras av en hane och en till två kvinnliga vuxna zebrafiskar.
Överför 100 embryon till varje petriskål som innehåller standard E3 embryo medium. Inkubera i 28 grader Celsius och steg enligt standardriktlinjer. Vid sex timmar efter befruktning, ta bort döda och obefruktade embryon från skålen med hjälp av en Pasteur pipett och sätta disken tillbaka i inkubatorn.
Vid 24 timmar efter befruktning, under ett ljust fält stereomikroskop, använda skarpa ultratunna dissekeringsångsånger för att dekorera embryon för Atorvastatin behandling. Tillsätt sedan 30 milliliter E3 embryo medium till två rena Petri-rätter, en för behandling och den andra för kontroll. Ta bort 60 mikroliter av embryovatten från behandlingsskålen och tillsätt 60 mikroliter på 0,5 millimolar Atorvastatin för att uppnå 80%av larver blödning.
Med hjälp av en Pasteur pipetter, överföra 100 embryon i så lite vatten som möjligt till varje maträtt. Inkubera de två rätterna vid 28 grader Celsius. När som helst efter 50 timmar efter befruktningen, under mikroskopet använda en Pasteur pipett för att noggrant separera hemorrhaged fisk från icke-hemorrhaged populationer och överföra larverna till nya rätter som innehåller färska E3 media.
För att göra det lättare att separera blödningsavskildhetsstål kan du använda fisk utan pigment eller fisk som uttrycker fluorescerande protein i röda blodkroppar. På den tredje dagen, under ett fluorescerande mikroskop skärm larverna för att säkerställa uttrycket av fluorescerande protein. Fyll sedan ljusplåtsmonteringskammaren med E3-media som innehåller 0,2%MS-222 för anesthetisering.
Med hjälp av en Pasteur pipetter, överför en enda droppe som innehåller en till sex larver till en torr Petriskålsyta för montering. Använd en pipett för att avlägsna så mycket vätska som möjligt. Tillsätt en droppe på 1,5% låg smälta uppstod från 45 grader Celsius värmeblock till larverna och använd en 800 mikrometer montering kapillär för att dra larverna upp huvudet först.
Om positionering inte är korrekt, utvisa larverna från agarose och montera igen. Låt kapillären svalna och sätt sedan in i ljusplåtskammaren. På ZEN imaging programvara, tryck kontinuerlig att orientera larverna och tryck förvärva att förvärva z-stack bilder av huvudet mellan ögat linser.
Generera en maximal intensitetsprojektionsbild från varje z-stack i bearbetningsfliken. För att slumpmässigt välja för motility assay, överför 24 larver efter anestesi till färskt E3-media och låta djuren återhämta sig från anestesi. Efter larver har helt återhämtat sig från anestesi, med hjälp av en pipett med slutet skära överföringen återvunna larver till E3 medium utan metylenblått.
Plate en larv i en milliliter per brunn av en 24 brunnsplatta. Ladda plattan i kamerans kammare. I EthoVision XT spårningsprogram, justera experimentinställningarna för att ställa in ett vitt ljus startle rutin för att öka spontan simning och analys rörelse i 10 minuter.
Upprepa förflyttningsanalysen vid 96 och 120 timmar efter fertilizatin. Bedömning av hjärnan celldöd med hjälp av en transgenic ubiquitin utsöndras Annexin V M venous reporter linje resulterar i tydliga bestämda kluster av döende celler i hemorrhaged larver som är frånvarande i alla icke-hemorrhaged larver anges av gröna fluorescens Bright-field bilder visar förekomsten av hjärnan blöder. Döende celler observerades i både Atorvastatin och bubblan huvudet modeller för hemorrhaged larver.
Morfologi mpeg1 positiva makrofager förändringar i intracerebrala blödning positiva larver som cellerna antar i aktiv rundade amönsida formen. Dessa aktiverade rundade celler övervakades över tiden för att visa en ökad phagocytic svar av ubiquitin utsöndras Annexin V M venous uttrycker döende celler i intrakraniell blödning positiva larver. Hjärnan blödning är associerad med en betydande minskning av motility på 72 och 96 timmar efter befruktning i jämförelse med intrakransarebral blödning negativa syskon kontroller.
Motility vid 120 timmar efter befruktning återhämtar sig till nära baslinjenivåer. Den viktigaste aspekten av detta förfarande är att vara säker på att grundligt undersöka larverna för närvaro eller frånvaro av hjärnblödningar innan du fortsätter till fenotypningsanalyserna. Denna modell kan också användas för läkemedelsscreening för att avgöra om fenotyp svårighetsgrad kan förbättras efter en blödning, ett tillvägagångssätt som kan leda oss att identifiera nya läkemedelskandidater i framtiden.
Denna teknik gör det möjligt för oss att utforska de cellulära svaren omedelbart efter en blödning i hjärnan under en tidspunkt som har varit så notoriskt svårt att studera innan nu. Även om ingen av de reagenser eller instrument som beskrivs inom detta protokoll är specifikt farliga, måste standardvård och försiktighetsåtgärder vidtas genomgående närhelst kemikalier, vassa föremål eller laser.