Name: in vivo forward genetic screen to identify novel neuroprotective genes in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-07-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster at JoVE.com

우리는 특히 배리 가네츠키 박사에게 감사드리며, 실험실에서 유전 스크린이 수행되어 신경 보호 유전자로서 brat의 식별 및 특성을 허용합니다. 우리는 친절이 문서에 제시된 유전 스크린에 사용된 ENU 돌연변이 파리의 컬렉션을 제공하는 스티븐 로비도우 박사에게 감사드립니다. 우리는 이 프로젝트의 기간 동안 도움이 토론에 대한 Ganetzky 연구소의 구성원, 박사 그레이스 보호프 - 포크와 데이비드 Wassarman, 링 링 호와 밥 크레버 기술 지원에 대한, 박사 아키 이케다에서 자신의 마이크로 토메 시설의 사용에 대한 감사 위스콘신 대학교와 킴 래키 박사, 앨라배마 대학교 광학 분석 시설.

1. 파리의 준비와 노화
<ol><li>유전 스크린을 위해 사용될 초파리 돌연변이체의 6체를 얻거나 생성한다. 여기서, 제2 염색체에 매핑되고 CyO를 통해 균형잡힌 ENU 돌연변이 선이 사용된다.</li>
	<li>옥수수 밀밀 배지에 25 °C, 12 시간 빛 / 어두운 주기로 설정 인큐베이터에서 실험 유전자 형 라인을 증폭.</li>
	<li>각 실험 유전자형에서 성인 외화의 0-2 일 사이에 약 20 동형 ?...

<ol>
	<li>Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+cycle:+the+neuron+itself+and+its+circumstances.">Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances.</a> Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).</li><li>Aranda-Anzaldo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+post-mitotic+state+in+neurons+correlates+with+a+stable+nuclear+higher-order+structure.">The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).</li><li>Haelterman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+of+chemically+induced+mutations+in+Drosophila+melanogaster.">Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).</li><li>Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+forward+with+genetics:+recent+technological+advances+and+forward+genetics+in+mice.">Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice.</a> The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).</li><li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+Drosophila+melanogaster.">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster.">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+eukaryotes.">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li><li>Nichols, C. 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L., Zimm, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).</li><li>Cook, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+chromosomal+deletions+to+provide+extensive+coverage+and+subdivision+of+the+Drosophila+melanogaster+genome.">The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome.</a> Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).</li><li>Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Mutation+in+Brain+Tumor+Causes+Both+Neural+Over-Proliferation+and+Neurodegeneration+in+Adult+Drosophila.">A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila.</a> Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).</li><li>Gloor, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+repressors+of+P+element+mobility.">Type I repressors of P element mobility.</a> Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).</li><li>Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+specifies+intermediate+progenitor+cell+identity+by+attenuating+beta-catenin/Armadillo+activity.">Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity.</a> Development. 141 (1), 51-62 (2014).</li><li>Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+swiss+cheese+mutant+causes+glial+hyperwrapping+and+brain+degeneration+in+Drosophila.">The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).</li><li>Kang, K. H., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neural+stem+cell+self-renewal+and+differentiation+in+Drosophila.">Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila.</a> Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene-Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes.">Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Loewen, C. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mito-Nuclear+Interactions+Affecting+Lifespan+and+Neurodegeneration+in+a+Drosophila+Model+of+Leigh+Syndrome.">Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome.</a> Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).</li><li>Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnr1+mutations+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+by+activating+the+innate+immune+response+in+the+brain.">Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).</li><li>Lessing, D., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+the+brain:+insight+into+human+neurodegeneration+from+Drosophila+melanogaster+mutants.">Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).</li><li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Polo+ameliorates+APP-induced+Alzheimer's+disease-like+symptoms+in+Drosophila.">Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 16816 (2015).</li><li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+mutagens,+transposons,+and+transgenes+to+interrogate+gene+function+in+Drosophila+melanogaster.">Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 15-28 (2014).</li><li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Genome+Sequencing+and+a+New+Bioinformatics+Platform+Allow+for+Rapid+Gene+Identification+in+D.+melanogaster+EMS+Screens.">Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens.</a> Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).</li><li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+drosophila.">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila.</a> Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).</li></ol>

Drosophila에 있는 전방 유전 스크린은 나이 의존적인 신경 보호를 포함하여 다른생물학 프로세스에서 관련시킨 유전자를 확인하는 효과적인 접근이었습니다 5,23,24, 25. 이 전략을 사용하여, 우리는 새로운 신경 보호 유전자17로 brat를 확인하는 데 성공했습니다.
<p class=...

뉴런은 대부분 유사분열 후이며1,2를나눌 수 없습니다. 대부분의 동물에서, 신경 보호 메커니즘 유기 체의 수명 내내 이러한 세포를 유지 하기 위해 존재, 특히 노년 기에 뉴런은 손상에 가장 취약. 이러한 메커니즘의 근간이 되는 유전자는 전방 유전 프로토콜을 사용하여 신경 변성을 나타내는 돌연변이체에서 확인할 수 있습니다. 에틸 메탄설포네이트(EMS) 또는 N-에틸-N-니드로소레아(ENU)와 같은 화학적 돌연변이원을 이용한 전방 유전적 스크린은 유도하는 무작위 점 돌연변이로 인해 특히 유용하며, 이로 인해 본질적으로 편견없는 접근법이 빛을 발하고 있습니다. 진핵 모델 유기체3,4,5의 수많은 유전자 기능 (대조적으로, X선 돌연변이발생은 DNA 나누기를 생성하고 포인트 돌연변이가 아닌 재배열을 초래할 수 있다 6).
일반적인 과일 파리 Drosophila melanogaster는 그것의 높은 품질, 잘 달린 게놈 순서, 고도로 발달된 유전 공구를 가진 모형 유기체로 그것의 긴 역사 때문에 이 스크린을 위한 이상적인 주제이고, 가장 중요한 것은, 그것의 공유 인간과 진화역사7,8. 이 프로토콜의 적용가능성에 있는 제한 요인은 9세에 시험을 방지할 돌연변이된 유전자에 기인한초기 치사입니다. 그러나, 비 치명적인 돌연변이의 경우, 부정적인 지질 학적 을 활용하는 등반 분석법은 10 기능하는 손상된 모터를정량화하는 광범위한 방법이지만 간단합니다. 충분한 운동 반응성을 나타내기 위해 파리는 방향을 결정하고 위치를 감지하며 움직임을 조정하기 위해 신경 기능에 의존합니다. 파리가 자극에 반응하여 충분히 올라갈 수 없다는 것은 따라서 신경학적 결함11을나타낼 수 있다. 특정 결함이 있는 등반 표현형이 확인되면, 뇌 조직의 조직학적 분석과 같은 보조 스크린을 이용한 추가 테스트는 등반 결함이 있는 파리의 신경 변성을 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 후속 유전자 매핑은 관심 있는 결함있는 신경 보호 유전자를 운반하는 염색체상에 게놈 영역을 밝히기 위하여 그 때 이용될 수 있습니다. 관심 있는 염색체 영역을 좁히기 위해, 염색체상에 공지된 위치를 가진 지배적인 마커 유전자를 운반하는 돌연변이 플라이 라인을 이용한 meiotic 매핑이 수행될 수 있다. 마커 유전자는 2개의 좌위 사이 재결합의 주파수가 유전자의 대략적인 위치를 지도로 하기 위하여 이용될 수 있는 측정 가능한 거리를 제공하기 때문에 돌연변이를 위한 기준점역할을 한다. 마지막으로, 관심 있는 중증 염색체 영역에 균형 잡힌 결핍을 운반하는 선으로 돌연변이 선을 교차하는 것은 그것의 알려진 표현형이 표현되는 경우에 관심있는유전자가 확인될 수 있는 보완 시험을 만듭니다 5. 확인된 유전자에서 다형성 뉴클레오티드 서열은, 아마도 변경된 아미노산 서열의 결과로, 유전자를 시퀀싱하고 이를 Drosophila 게놈 서열과 비교하여 평가될 수 있다. 관심 있는 유전자의 후속 특성화는 추가 돌연변이 대문자의 검사, 돌연변이 구조 실험 및 추가 표현형의 검사를 포함할 수 있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:743px;" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:743px;">Major equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fume hood for histology</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Light Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">Eclipe E100</td>
			<td style="width:171px;">Preferred objective for imaging is X20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Imaging software</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope Camera</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Thermal cycler</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:743px;">Fly pushing and climbing assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">VWR&#174; Drosophila Vial, Narrow</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">75813-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">VWR&#174; General-Purpose Laboratory Labeling Tape</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89097-912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Standard mouse pad</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:195px;">Motic</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Model SMZ-168</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad)</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">54-104, 59-121, 59-172</td>
			<td>Doesn&#8217;t iinclude CO2 tank</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fine-Tip Brushes</td>
			<td style="width:195px;">SOLO HORTON BRUSHES, INC.</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Drosophila Incubator</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89510-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:743px;">Gene mapping</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">CantonS</td>
			<td style="width:195px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>9517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">w1118</td>
			<td style="width:195px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">yw&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td align="right">6599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:255px;">Drosophila line used for recombination mapping</td>
			<td style="width:195px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:123px;">3227</td>
			<td style="width:171px;">Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:255px;">CyO/sno[Sco]&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:123px;">2555</td>
			<td style="width:171px;">Drosophila balancer line used for recombination mapping</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Deficiency Kit for chromosome 2L</td>
			<td style="width:195px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:123px;">DK2L</td>
			<td>Cook et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:255px;">Histology analysis</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ethanol, (100%)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Chloroform</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:123px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histochoice clearing agent 1X</td>
			<td style="width:195px;">VWR Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">97060-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Harris Hematoxylin</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">95057-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Eosin</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">95057-848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Thermo Scientific&#8482;&#160;Richard-Allan Scientific&#8482; Mounting Medium</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific&#8482; 4112</td>
			<td style="width:123px;">22-110-610</td>
			<td>CyO/sna[Sco]</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:255px;">Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus</td>
			<td style="width:195px;">Azer Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fisherbrand&#8482;&#160;Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td style="width:195px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">12-545M</td>
			<td>Dimensions: 24x60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Traceable timer</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Slide Warmer</td>
			<td style="width:195px;">Barnstead International</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>model no. 26025</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Slide tray and racks</td>
			<td style="width:195px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Rack to hold 20 slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fisherbrand&#8482;&#160;General-Purpose Extra-Long Forceps</td>
			<td style="width:195px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">10-316A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Kimwipes&#8482;</td>
			<td style="width:195px;">Kimberly-Clark&#8482; Professional&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">6 inch Puritan applicators</td>
			<td style="width:195px;">Hardwood Products Company, Guilford, Maine</td>
			<td style="width:123px;">807-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">VWR&#174; Razor Blades</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tupperware or glass containers for histology liquids</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>16 + 1 for running water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High Profile Coated Microtome Blades</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">95057-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Corning&#8482;&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4L</td>
			<td style="width:195px;">Corning&#8482;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Beaker</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Or other container for ice water and cassettes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tissue Bath</td>
			<td style="width:195px;">Precision Scientific Company</td>
			<td style="width:123px;">66630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microtome</td>
			<td style="width:195px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:255px;">Molecular analysis</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Wizard&#174; SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td style="width:195px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ex Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:195px;">TaKaRa</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>5 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Invitrogen&#8482;&#160;SYBR&#8482; Safe&#8482; DNA Gel Stain&#160;</td>
			<td style="width:195px;">&#160;Invitrogen&#8482;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">UltraPure&#8482; Agarose</td>
			<td style="width:195px;">&#160;Invitrogen&#8482;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:195px;">&#160;Invitrogen&#8482;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">ApE-A plasmid Editor software</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;">Available for free download</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:255px;">Statistical analysis</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">R software package</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:255px;">Further analysis</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]</td>
			<td style="width:195px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:123px;">59967</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo forward genetic screen to identify novel neuroprotective genes in drosophila melanogaster

신경 퇴행성 질환의 발병과 진행에 대해 이해해야 할 것이 많이 있습니다. 화학 돌연변이원을 이용한 전방 유전자 스크리닝은 인간과 보존된 세포 경로를 공유하는 Drosophila 및 그밖 모형 유기체 중 유전자에 돌연변이 표현형을 매핑하기 위한 유용한 전략입니다. 관심의 돌연변이 유전자가 파리의 초기 발달 단계에서 치명적이지 않은 경우, 등반 분석은 낮은 등반 속도와 같은 감소 뇌 기능의 현상형 지표를 위해 스크리닝을 실시 할 수있다. 이어서, 뇌 조직의 이차 조직학적 분석은 신경변성 표현형을 채점함으로써 유전자의 신경보호 기능을 검증하기 위해 수행될 수 있다. 유전자 매핑 전략은 이러한 동일한 분석에 의존하는 meiotic 및 결핍 매핑을 포함하며, 관심 있는 유전자에서 가능한 뉴클레오티드 변화를 식별하기 위해 DNA 염기서열 분석이 뒤따를 수 있다.

이러한 간질에서, 우리는 성인 파리에서 신경 무결성(예를 들어, 신경보호)의 유지에 역할을 하는 유전자 뇌종양(brat)을 식별하는 데 사용되는 단계를 제시한다(17; 신경 보호에 관여하는 유전자를 식별하는 데 사용할 수있는 방법론. 우리는 등반 분석법을 사용하여 화학적으로 돌연변이 된 파리의 컬렉션을 통해 스크리밍하는 전방 유전 접?...

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In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

소독멜라노가스터에서 새로운 신경보호 유전자를 식별하기 위한 생체 전방 유전자 스크린

우리는 Drosophila melanogaster에있는 신경 변성을 전시하는 돌연변이를 위한 스크린에 전방 유전 접근을 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 그것은 궁극적으로 신경 보호의 프로세스와 관련있는 새로운 유전자를 확인하기 위하여 등반 분석, 기관학 분석, 유전자 매핑 및 DNA 순서를 통합합니다.

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

이 프로토콜의 주요 목표는 소화 조절시 신경 변성으로 이끌어 내는 유전자를 확인하기 위하여 전진 유전학의 힘을 이용하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 포유류 모델에서 수행하기가 더 어려울 수 있는 신경 보호 유전자의 식별을 위한 편견없고 간단한 접근을 제공한다는 것입니다. 이 기술은 알츠하이머병과 파킨슨 병과 같은 많은 질병 조건과 관련된 신경 변성 과정에 연루 된 새로운 유전자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.신경 보호 유전자를 식별하는 것 외에도, 앞으로 유전적 접근법은 신경 기능 및 전염과 같은 다른 생물학적 과정에 관련된 유전자를 발견하는 데 사용될 수 있습니다. 시작하려면, 두 번째 염색체에 매핑 드로소필라 돌연변이의 ENU 돌연변이 컬렉션에 속하는 라인에서 동질 화 파리를 수집합니다. 10~12일 의 파리를 한 번에 한 줄에 마취하지 않고 시험실로 뒤집어 5분 동안 회복할 수 있도록 합니다.5센티미터 선 마크 면을 아래로 향하게 하면 단단한 표면에 놓인 마우스 패드에서 챔버를 세 번 탭하여 모든 파리가 아래쪽의 분석서를 시작합니다. 10초 동안 비행 운동을 관찰합니다. 이 시간 내에 5센티미터 라인에 도달하거나 통과하는 파리 의 수와 테스트된 총 비행 수를 기록합니다.두 번째 시험을 시작하기 전에 1분 동안 기다립니다. 줄당 최소 세 개의 평가판 복제를 반복합니다. 이산화탄소 패드에서 파리를 마취한 후 수술용 블레이드로 머리를 자르고 페인트 브러시를 사용하여 1.5 밀리리터 마이크로센티리후지 튜브에 카르노이의 고정1밀리리터에 부드럽게 넣습니다.그런 다음 튜브를 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 다음 날, 머리가 고정 솔루션에 침몰되어 있는지 확인합니다. 연기 후드 아래에서 P1000 파이펫을 사용하여 고정 용액을 70%에탄올의 1밀리리터로 대체하고 향후 분석을 위해 샘플을 섭씨 4도에서 유지합니다.파스퇴르 파이펫을 사용하여 고정 된 머리를 미생물 카세트로 옮기고 카세트를 닫습니다. 카세트를 처리하기 위해 조직학 시설로 보내거나 현장에서 사용할 수 있는 경우 자동화된 조직 처리 기계에 넣습니다. 프로그램을 실행하여 파라핀으로 머리를 탈수하고 명확하고 침투합니다.그런 다음 카세트를 파라핀 포함 스테이션으로 옮기고 파라핀이 섭씨 60도에서 가열되어 가열된 스테이션의 카세트에 맞는 금속 베이스 몰트를 배치합니다. 미세한 집게를 사용하여 헤드를 방향을 지정하여 기본 금형의 상단을 향하도록 합니다. 적절한 헤드 방향은 히스토로지 분석에 매우 중요합니다.경화 후 각 파라핀 블록을 트리밍하여 단면화되는 표면을 최소화합니다. 마이크로톤에 각 블록의 5 마이크로미터 섹션을 잘라. 다음으로 단면파라핀 리본을 섭씨 35도의 온수 욕조에 최대 5분간 놓습니다.가열 된 수조에 폴리 리신 코팅 슬라이드를 침지하고 나무 어플리케이터를 사용하여 섹션 리본을 슬라이드에 놓습니다. 실온에서 밤새 공기를 건조하게 하십시오. 다음 날, 슬라이드 워머를 사용하여 섭씨 63도에서 15 분 동안 슬라이드를 가열하십시오.연기 후드 아래에 슬라이드를 슬라이드 염색 선반에 놓고 5 분 동안 HistoChoice에 랙을 두 번 놓고 원고에 따라 여러 에탄올과 증류 수조 트리트먼트를 제공합니다. 랙을 해리스 헤마톡슬린이 가득 찬 용기에 넣고 2~5분 간 얼룩지게 합니다. 그런 다음 Hematoxylin 용액에서 랙을 꺼내 다음 염색 단계 전에 10 분 동안 흐르는 수돗물 아래에 놓습니다.염색 후, 집게를 사용하여, 히스토초이스 또는 자일렌 용액에서 슬라이드를 꺼내. 시료에 영구 장착 매체의 얇은 층을 드립하 고 부드럽게 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 거품의 형성을 피하십시오.장착 매체가 경화된 후, 슬라이드를 가벼운 현미경 아래에 놓고 약 중뇌에서 대표적인 뇌 섹션의 이미지를 얻습니다. 첫째, 이종화구균 암컷 파리를 생성하기 위해 유리알이 함유된 음식을 준비한다. 이산화탄소 마취 후, 페인트 브러시를 사용하여 돌연변이 라인의 수컷 5마리와 스테르흉 막힌 엽의 처녀 암컷 10마리를 유리알에 고정하여 십자가를 만듭니다.바이알을 섭씨 25도에 놓습니다. 10 일에서 12 일 후에, 돌연변이된 염색체 및 마커 염색체를 들고 적어도 15개의 처녀 암컷 자손을 수집합니다. 스커로이드 또는 동등한 위에 또 다른 눈에 띄는 지배적 인 마커 컬리 O를 운반 균형 잡힌 라인에서 다섯 남성으로 교차.10~12일 후에, 스큐로이드 또는 컬리 O를 운반하는 이종수 수컷 자손과 십자가에서 잠재적으로 재결합된 염색체를 수집하십시오. 개별적으로 돌연변이 염색체를 들고 주식에서 처녀 여성에 그들을 짝짓기. 10일에서 12일 후, 마지막 십자가에서 바이알을 함유한 새로운 음식으로 자손과 10~14일 의 섭씨 29도에서 10~14일간 날아간다.플라이 헤드에 히스토로지를 수행하고 각 개별 십자가의 자손을 위해 반복합니다. 이 정보를 사용하여, 열성 돌연변이의 위치를 정제하기 위하여 염색체의 좁은 지역에 결핍 매핑을 능력을 발휘합니다. 각 결핍 라인은 보완 테스트에 사용할 수 있도록 염색체의 다른 영역의 삭제가 있습니다.다음으로, 두 번째 염색체에 대한 Drosophila 결핍 키트에서 크로스 라인과 관심의 표현형의 비 보완을 찾습니다. DNA 서열 분석에 대한 참조를 얻으려면, FlyBase로부터 BRAT 유전자의 게놈 합의 서열을 포함하는 FASTA 포맷 파일을 다운로드하거나 유전 적 배경 제어의 BRAT 서열에 대한 결과를 포함하는 파일을 사용, 예를 들어 원래 돌연변이 드로소필라 라인. Plasmid 편집기에서 시퀀싱 파일을 엽니다.편집으로 이동하여 정렬 시퀀스를 클릭합니다. 컴퓨터의 마우스를 사용하여 비교할 모든 시퀀스를 선택합니다. 드롭 메뉴에서 이 정렬에 대한 참조 순서를 나타냅니다.기준 서열과 비교하여 뉴클레오티드 변화를 위해 서열된 영역을 검사한다. 원하는 경우 텍스트를 클릭하여 RTF 형식으로 컴퓨터에 정렬을 저장한 다음 저장합니다. 각 십자가에서 F1 자손을 수집하여 구조 실험을 수행합니다.표시된 밸러운더를 신중하게 선택합니다. 나이 Drosophila 음식 매체에 파리 29 섭씨 및 이전과 같은 신경 변성을 찾기 위해 뇌에 대한 히스토로지 분석을 수행. 867 돌연변이체에서 신경 변성의 연령 의존분석을 수행하기 위해, 5, 15 및 25 일까지 비행하고 후속 히스토로지 분석을 수행합니다.이 프로토콜은 등반 분석을 사용하여 화학적으로 돌연변이 된 파리의 컬렉션을 통해 화면하는 앞으로 유전적 접근법을 제시합니다. 235개의 호모자구선 중, 테스트된 라인의 약 37%가 10~12일의 나이에 테스트할 때 50% 미만의 등반 패스 율을 보였습니다. 51개의 후속 조직학적 화면에서 가장 낮은 등반 패스 속도를 나타내는 29개의 대사가 경증에서 중증 신경변성까지 뇌 신경필에 구멍이 눈에 띄는 모습을 보였다는 사실이 밝혀졌습니다.867 파리의 신경 변성 표현형은 야생 형 균주에 교차 된 이종구스 867 파리의 뇌가 대조군과 비교할 수 있었기 때문에 열성입니다. 결핍 라인 Df24116은 등반 분석에 기초한 867 돌연변이 표현형을 보완하지 않습니다. 조직학적 검증은 Df24116이 867신경변성 표현형을 보완하지 않는 반면 Df9296은 결핍라인을 나타낸다.867 돌연변이체의 뇌 표현형을 살펴보면 추가 결핍 선으로 넘어갔으며, 이는 돌연변이가 유전자 BRAT를 포함하는 게놈 의 영역에 포함되어 있음을 확인하였다. 이 프로토콜이 부적절하게 실행되면 후보 유전자의 신경 변성과 돌연변이의 식별에 영향을 미칠 수있는 몇 가지 단계를 결합으로이 절차 동안 엄격하고 정확하게 작동하는 것이 중요합니다. 확인된 유전자에 따라, 후속 분석은 신경 변성의 알려진 통로에서 역할을 하는 유전자와의 관심 또는 상호 작용의 유전자의 추가 난소 시험을 포함할 수 있습니다.공장 학적 절차 동안, 그것은 클로로폼을 포함 하기 때문에 주의 하 여 Carnoy의 고정 솔루션을 처리 하는 것을 기억 하십시오. 장갑을 착용하고 연기 후드 아래에 이상적인 적절한 환기와 함께 사용하십시오. 마찬가지로, 연기 후드 아래에 얼룩진 모든 히스토로지를 수행합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

연구

유전학

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

마우스 마음에서 과발현하는 rAAV9의 제조 또는 최저 유전자

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

복부 색소 침착 정량화<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

높은 지방 다이어트 먹이 초파리 Melanogaster 의 높은 처리량 Triacylglyceride 분석 결과

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 Hepatocytes의 유전 Vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

초파리 melanogaster 회전 운동 정량화 시스템 (REQS)를 사용 하 여 운동 수준 측정

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

초파리 melanogaster 운동을 부드럽게 유도 위한 TreadWheel: 간격 훈련 프로토콜

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

세균성 윌트 질병의 간단한 유전 분석을 위한 랄스토니아 솔라나세아룸에 의한 접종에 이어 토마토 뿌리 변환

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...