Denne protokol gør det muligt at detektion af tumor associerede mutationer og i øjeblikket komplimenterer invasive kirurgiske procedurer. En anden styrke er evnen til at bruge denne protokol til at overvåge tumor mutation belastning overarbejde. Teknikken gør det muligt tumor genotyping uden at kræve faktiske kirurgiske væv biopsi, som er særligt nyttigt for tumorer i udfordrende steder, ligesom hjernestammen med begrænset væv adgang.
I mangel af gentagen biopsi, langsgående molekylære data er ikke tilgængelige til at komplimentere MR. Digital PCR-monitorering letter et molekylært baseret supplement til diagnosen, hvilket muliggør en mere informeret behandlingsbeslutningsproces. Lignende metoder kan anvendes til at påvise ekspressionen af gener i et bestemt system med konventionelle Fluo-4- og quencher-forbundne sonder, men med en højere følsomhed end med den kvantitative PCR.
Før du begynder dråben digital PCR procedure, rense bænken plads og udstyr med 10% blegemiddel og 70% ethanol og forsigtigt vortex og kort centrifuge alle reagenser, undtagen dråbe stabiliserende olie. Bekræft, at den komprimerede nitrogengasflaske er fastgjort til dråbegeneratoren, og at cylindertanken er indstillet til 90 pund pr. kvadrattomme. Og 38 mikroliter af digital PCR reaktion blanding direkte ind i bunden af hver brønd af en otte godt PCR tube strip, fjerne eventuelle bobler med en ren pipette spids.
Der tilsættes 12 mikroliter forstærke DNA-prøve i tre eksemplarer til de relevante brønde i rørstriben. Pipetter forsigtigt hele volumen 10 gange for at blande reaktionsblandingen med DNA-prøven og pipette det fulde volumen fra hver brønd ind i de tilsvarende A gennem H-kanaler af en dråbegenererende instrumentchip. Sæt en ny PCR-rørstrimmel i dråbegenereringsinstrumentet, og scan dråbegenererende instrumentchip-id i softwaren på instrumentcomputeren.
Klik derefter på Start af kørsel for at begynde at droppe eksempler. Når dråben er færdig, skal du fjerne PCR-rørstrimlen og anvende rørstrimler. Overfør rørstrimlen til en termisk cykelr og afbalancer røret med en anden rørstrimmel, der indeholder 80 mikroliter vand pr. brønd.
Kør derefter den termiske cycler under passende termiske cykelforhold. Udskift strimlen med høj hastighed hætter. Når den termiske cykling er færdig, skal du overføre rørstriben til kvantificeringsinstrumentet, klikke på Sæt en løbetur på instrumentsoftwaren op og placere rørstriben i kvantificeringsinstrumentet.
Anskaf metalskjoldet oven på en ny kvantificeringsinstrumentchip, scan chip-id'et ind i instrumentet, og sæt chippen ind i maskinen. Luk låget på instrumentet. I computersoftwaren skal du angive et navn til den digitale PCR-kørsel og for hver af de otte kanaler, og vælg derefter Hurtig tilstand, og klik på Start for at starte kvantificeringen.
For at analysere de rå spektrale data, lancere analytikersoftware og åbne fcs filer. Vælg intakt under analysevisning. Klik på felterne ud for hvert af de otte eksempler under eksempelvisning.
Softwaren vil plotte signalerne for de mutante og vilde type alleler langs henholdsvis x og y-aksen. Brug den beregnede matrixfunktion til at ansøge om spektralkompensationen på de intakte dråber i henhold til producentens instruktører og juster akseindstillingerne under akseindstillinger. Indstil x-aksen til et minimum på nul og højst 30.000 og y-aksen til mindst minus 5, 000 og højst 10.000.
Når der er identificeret dråbeklynger, skal du justere aksen for at reducere den tomme plads i grafen. Vælg den prøve, der svarer til den positive kontrol tumorvæv genomisk DNA til at indstille den negative mutant og vilde type porte, sikre, at klyngerne er forskellige og let identificeres. Højreklik derefter, og vælg Anvend alle indstillinger på udvalgte eksempler for at anvende portindstillingerne for det positive kontrolelement på alle eksemplerne.
Klik på flere eksempler under den grafiske visning for at få vist plots for alle de markerede prøver og eksportere billedet som en tif-fil. Vælg derefter Eksportér analyse under Arbejdsområde, og gem den analyserede datafil som en csv-fil. Her vises repræsentative resultater for en vellykket påvisning af en mutation i et forforstærket plasma og cerebrospinalvæskecellefri DNA fra to børn med diffuse midline gliomer.
I dette eksperiment kan der observeres en klar adskillelse mellem henholdsvis mutant- og vildtypeklynger langs henholdsvis x- og y-aksen. Robuste vildtypeklynger indikerer, at cellefri DNA-ekstraktion var vellykket, fordi skabelon-DNA er til stede. For disse patienter, de mutante klynger viser en mutation allel frekvens på 1,6 og 39,32 procent for plasma og cerebrospinalvæske prøver henholdsvis i overensstemmelse med tumor mutation status som bekræftet ved genomisk analyse af biopsi tumorvæv.
Den negative kontrol viser derimod nul mutant og nul wild type dråber, der indikerer, at der ikke var nogen kontaminering af PCR-reaktionsblandingen. Den positive kontrol tumorvæv genomisk DNA viser mutationen bliver opdaget på den forventede allel frekvens for den særlige tumor prøve udvalgt. Fraværet af mutationsdetektion i plasmaet er måske ikke nødvendig, at en patient er vild type for den mutation af interesse, som falske negativer opstår.
For eksempel, i denne patient, selv om mutation af interesse ikke blev opdaget, mutationen status blev bekræftet ved genomisk analyse af tumorvæv. PCR er en meget følsom teknik, der kræver hyppig dekontaminering af arbejdsområdet og udstyr for at undgå indsamling af falske positive data.