यह प्रोटोकॉल ट्यूमर से जुड़े म्यूटेशन का पता लगाने में सक्षम बनाता है और वर्तमान में आक्रामक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की तारीफ करता है। एक और ताकत ट्यूमर उत्परिवर्तन लोड ओवरटाइम की निगरानी करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने की क्षमता है। यह तकनीक वास्तविक सर्जिकल ऊतक बायोप्सी की आवश्यकता के बिना ट्यूमर जीनोटाइपिंग को सक्षम बनाती है जो चुनौतीपूर्ण स्थानों में ट्यूमर के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जैसे प्रतिबंधित ऊतक पहुंच के साथ मस्तिष्क स्टेम।
दोहराने बायोप्सी के अभाव में, अनुदैर्ध्य आणविक डेटा एमआरआई की तारीफ करने के लिए उपलब्ध नहीं है । डिजिटल पीसीआर निगरानी निदान के लिए आणविक आधारित पूरक की सुविधा प्रदान करती है, जिससे अधिक सूचित उपचार निर्णय लेने की प्रक्रिया सक्षम होती है। इसी तरह के तरीकों का उपयोग पारंपरिक फ्लू-4 और क्वेंचर से जुड़ी जांच के साथ, विशेष प्रणाली में जीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, लेकिन मात्रात्मक पीसीआर की तुलना में उच्च संवेदनशीलता के साथ।
बूंद डिजिटल पीसीआर प्रक्रिया शुरू करने से पहले, बेंच स्पेस और उपकरणों को 10% ब्लीच और 70% इथेनॉल और धीरे-धीरे भंवर के साथ साफ करें और बूंद स्थिर तेल को छोड़कर सभी अभिकर् तादारों को संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें। पुष्टि करें कि संकुचित नाइट्रोजन गैस सिलेंडर बूंद पैदा करने वाले उपकरण से जुड़ा हुआ है और सिलेंडर टैंक 90 पाउंड प्रति वर्ग इंच पर सेट किया गया है। और डिजिटल पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के 38 माइक्रोलीटर सीधे एक आठ अच्छी तरह से पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप के प्रत्येक कुएं के नीचे में, एक साफ पिपेट टिप के साथ किसी भी बुलबुले को हटा।
ट्यूब स्ट्रिप के उपयुक्त कुओं में ट्रिपलिटेट में पूर्व-प्रवर्धित डीएनए नमूने के 12 माइक्रोलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे पूर्ण मात्रा 10 बार डीएनए नमूने के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण मिश्रण और एक बूंद पैदा करने उपकरण चिप के एच चैनलों के माध्यम से इसी एक में प्रत्येक अच्छी तरह से पूरी मात्रा पिपेट । बूंद पैदा करने वाले यंत्र में एक नई पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप डालें और इंस्ट्रूमेंट कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर में बूंद पैदा करने वाले इंस्ट्रूमेंट चिप आईडी को स्कैन करें।
फिर नमूनों को ड्रॉपलेट करना शुरू करने के लिए रन शुरू करने पर क्लिक करें। बूंदें पूरी होने पर पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप निकालकर ट्यूब स्ट्रिप कैप लगाएं। ट्यूब स्ट्रिप को थर्मल साइकिलर में स्थानांतरित करें और ट्यूब को एक अन्य ट्यूब स्ट्रिप के साथ संतुलित करें जिसमें प्रति अच्छी तरह से 80 माइक्रोलीटर पानी होता है।
फिर उपयुक्त थर्मल साइकिलिंग स्थितियों के तहत थर्मल साइकिल चलाने के लिए। स्ट्रिप कैप्स को हाई स्पीड कैप से बदलें। जब थर्मल साइकिलिंग पूरी हो जाती है, तो ट्यूब स्ट्रिप को क्वांटिफिकेशन इंस्ट्रूमेंट में स्थानांतरित करें, क्लिक करें इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर पर एक रन सेट अप करें और ट्यूब स्ट्रिप को क्वांटिफिकेशन इंस्ट्रूमेंट में रखें ।
एक नए क्वांटिफिकेशन इंस्ट्रूमेंट चिप के ऊपर मेटल शील्ड रखें, चिप आईडी को इंस्ट्रूमेंट में स्कैन करें और चिप को मशीन में डालें । यंत्र का ढक्कन बंद कर दें। कंप्यूटर सॉफ्टवेयर में, डिजिटल पीसीआर रन के लिए और आठ चैनलों में से प्रत्येक के लिए एक नाम दर्ज करें, फिर फास्ट मोड का चयन करें और मात्राकरण शुरू करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें।
कच्चे स्पेक्ट्रल डेटा का विश्लेषण करने के लिए, विश्लेषक सॉफ्टवेयर लॉन्च करें और एफसीएस फाइलों को खोलें। विश्लेषण दृश्य के तहत, बरकरार चयन करें। नमूना दृश्य के तहत, आठ नमूनों में से प्रत्येक के बगल में बक्से पर क्लिक करें ।
सॉफ्टवेयर क्रमशः एक्स और वाई एक्सिस के साथ उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के एलील्स के लिए संकेतों की साजिश करेगा। निर्माताओं प्रशिक्षकों के अनुसार, बरकरार बूंदों पर स्पेक्ट्रल मुआवजे के लिए आवेदन करने के लिए गणना मैट्रिक्स फ़ंक्शन का उपयोग करें और अक्ष विकल्पों के तहत धुरी सेटिंग्स को समायोजित करें। एक्स एक्सिस को न्यूनतम शून्य और अधिकतम 30, 000 और वाई एक्सिस को न्यूनतम माइनस 5, 000 और अधिकतम 10, 000 तक सेट करें।
जब बूंद समूहों की पहचान की गई है, तो ग्राफ में खाली जगह को कम करने के लिए धुरी को समायोजित करें। नकारात्मक उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के फाटकों को सेट करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण ट्यूमर ऊतक जीनोमिक डीएनए के अनुरूप नमूने का चयन करें, यह सुनिश्चित करना है कि समूहों अलग और आसानी से पहचाने जाते हैं। फिर सही क्लिक करें और सभी नमूनों पर सकारात्मक नियंत्रण के लिए गेट सेटिंग्स लागू करने के लिए चयनित नमूनों के लिए सभी सेटिंग्स लागू करें।
ग्राफिकल व्यू के तहत, सभी चयनित नमूनों के लिए भूखंडों को देखने और छवि को टीएफ फाइल के रूप में निर्यात करने के लिए कई नमूनों पर क्लिक करें। फिर कार्यक्षेत्र के तहत, निर्यात विश्लेषण का चयन करें और विश्लेषण डेटा फ़ाइल को सीएसवी फ़ाइल के रूप में सहेजें। यहां, डिफ्यूज मिडलाइन ग्लियोमास वाले दो बच्चों से पूर्व-प्रवर्धित प्लाज्मा और सेरेब्रोस्पाइनल फ्लूइड सेल मुक्त डीएनए में उत्परिवर्तन का सफल पता लगाने के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं।
इस प्रयोग में, उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के समूहों के बीच एक स्पष्ट अलगाव क्रमशः एक्स और वाई धुरी के साथ देखा जा सकता है। मजबूत जंगली प्रकार के समूहों से संकेत मिलता है कि सेल मुक्त डीएनए निष्कर्षण सफल रहा क्योंकि टेम्पलेट डीएनए मौजूद है । इन रोगियों के लिए, उत्परिवर्ती समूहों को बायोप्सीड ट्यूमर ऊतक के जीनोमिक विश्लेषण द्वारा पुष्टि के अनुसार ट्यूमर उत्परिवर्तन स्थिति के अनुसार क्रमशः प्लाज्मा और सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ के नमूनों के लिए १.६ और ३९.३२ प्रतिशत की उत्परिवर्तन एलेलिक आवृत्ति दिखाई देती है ।
दूसरी ओर नकारात्मक नियंत्रण शून्य उत्परिवर्ती और शून्य जंगली प्रकार की बूंदों को दर्शाता है कि पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण का कोई संदूषण नहीं था। सकारात्मक नियंत्रण ट्यूमर ऊतक जीनोमिक डीएनए से पता चलता है उत्परिवर्तन विशेष रूप से चयनित ट्यूमर नमूना के लिए अपेक्षित allelic आवृत्ति पर पाया जा रहा है । प्लाज्मा के भीतर उत्परिवर्तन का पता लगाने के अभाव का मतलब यह आवश्यक नहीं हो सकता है कि एक रोगी ब्याज के उत्परिवर्तन के लिए जंगली प्रकार है क्योंकि झूठी नकारात्मक होती है।
उदाहरण के लिए, इस रोगी में, हालांकि ब्याज के उत्परिवर्तन का पता नहीं चला था, ट्यूमर ऊतक के जीनोमिक विश्लेषण द्वारा उत्परिवर्तन की स्थिति की पुष्टि की गई थी। पीसीआर एक बहुत ही संवेदनशील तकनीक है जो झूठे सकारात्मक डेटा के अधिग्रहण से बचने के लिए कार्य क्षेत्र और उपकरणों के लगातार विसंदूषण की मांग करती है।
