Denne protokollen gjør det mulig å oppdage tumorrelaterte mutasjoner og komplimenterer for tiden invasive kirurgiske prosedyrer. En annen styrke er evnen til å bruke denne protokollen til å overvåke tumormutasjonbelastning overtid. Teknikken gjør det mulig å skrive tumorgenomtyping uten å kreve faktisk kirurgisk vevsbiopsi som er spesielt nyttig for svulster på utfordrende steder, som hjernestammen med begrenset vevstilgang.
I fravær av gjentatt biopsi er langsgående molekylære data ikke tilgjengelig for kompliment MR. Digital PCR-overvåking forenkler et molekylært basert supplement til diagnose, noe som muliggjør en mer informert behandlingsprosess. Lignende metoder kan brukes til å oppdage uttrykket av gener i bestemt system, med konvensjonelle Fluo-4 og quencher-koblede sonder, men med en høyere følsomhet enn med kvantitativ PCR.
Før du begynner dråpen digital PCR prosedyre, rengjør benken plass og utstyr med 10% blekemiddel og 70% etanol og forsiktig virvel og kort sentrifugere alle reagenser, bortsett fra dråpestabiliserende olje. Kontroller at den komprimerte nitrogengassflasken er festet til dråpegenererende instrument, og at sylindertanken er satt til 90 pounds per kvadrattomme. Og 38 mikroliter med digital PCR reaksjon blanding direkte inn i bunnen av hver brønn av en åtte brønn PCR rør stripe, fjerne eventuelle bobler med en ren pipette tips.
Tilsett 12 mikroliter med forhåndsforsterkert DNA-prøve i triplikate til de riktige brønnene på rørstripen. Pipette hele volumet forsiktig 10 ganger for å blande reaksjonsblandingen med DNA-prøven og pipetten hele volumet fra hver brønn inn i de tilsvarende A til H-kanalene til en dråpegenererende instrumentbrikke. Sett inn en ny PCR-rørstrimmel i dråpegenererende instrument og skann dråpegenererende instrumentbrikke-ID i programvaren på instrumentdatamaskinen.
Klikk deretter Start Kjør for å begynne å slippe eksemplene. Når dråpeiseringen er fullført, fjerner du PCR-rørstripen og påfør rørstripehetter. Overfør rørstripen til en termisk cycler og balansere røret med en annen rørstripe som inneholder 80 mikroliter vann per brønn.
Kjør deretter den termiske cycleren under de aktuelle termiske sykkelforholdene. Sett på stripen med høy hastighetshetter. Når den termiske syklingen er fullført, overfører du rørstripen til kvantifiseringsinstrumentet, klikker på Sett opp en Kjør på instrumentprogramvaren og plasserer rørstripen i kvantifiseringsinstrumentet.
Plasser metallskjoldet på toppen av en ny kvantifisering instrument chip, skanne chip ID inn i instrumentet og sette brikken inn i maskinen. Lukk lokket på instrumentet. Skriv inn et navn på den digitale PCR-kjøringen i dataprogramvaren, og velg deretter Hurtigmodus og klikk Start for å starte kvantifiseringen.
For å analysere rå spektrale data, start analytikerprogramvaren og åpne fcs-filene. Velg intakt under analysevisning. Klikk boksene ved siden av hvert av de åtte eksemplene under eksempelvisning.
Programvaren vil plotte signalene for mutant og vill type alleler langs x og y aksen henholdsvis. Bruk den beregnede matrisefunksjonen til å søke om spektral kompensasjon på de intakte dråpene, i henhold til produsentens instruktører og justere akseinnstillingene under aksealternativer. Sett x-aksen til minimum null og maksimalt 30 000 og y-aksen til minimum minus 5 000 og maksimalt 10 000.
Når dråpeklynger er identifisert, justerer du aksen for å redusere det tomme rommet i diagrammet. Velg prøven som tilsvarer den positive kontrollen tumorvev genomisk DNA for å sette den negative mutant og vill type porter, slik at klyngene er distinkte og lett identifisert. Høyreklikk deretter og velg Bruk alle innstillinger på valgte eksempler for å bruke portinnstillingene for den positive kontrollen på alle prøvene.
Klikk flere eksempler under grafisk visning for å vise plottene for alle de valgte eksemplene og eksportere bildet som en tif-fil. Velg deretter Eksporter analyse under Arbeidsområde, og lagre den analyserte datafilen som en CSV-fil. Her vises representative resultater for en vellykket påvisning av en mutasjon i et preforsterkert plasma- og cerebrospinalvæskecellefritt DNA fra to barn med diffuse midtlinjegliomer.
I dette eksperimentet kan en klar separasjon mellom muterte og ville typeklynger observeres langs henholdsvis x- og y-aksen. Robuste villtypeklynger indikerer at cellefri DNA-ekstraksjon var vellykket fordi mal-DNA er til stede. For disse pasientene viser muterte klynger en mutasjonsalllfrekvens på henholdsvis 1,6 og 39,32 prosent for plasma- og cerebrospinalvæskeprøvene i samsvar med tumormutasjonsstatusen som bekreftet ved genomisk analyse av det biopsied tumorvevet.
Den negative kontrollen viser derimot null muterte og null ville typedråper som indikerer at det ikke var forurensning av PCR-reaksjonsblandingen. Den positive kontrollen tumorvev genomisk DNA viser mutasjonen som oppdages ved forventet allelfrekvens for den bestemte tumorprøven valgt. Fraværet av mutasjonsdeteksjon i plasmaet kan ikke være nødvendig, noe som betyr at en pasient er vill type for mutasjon av interesse som falske negativer oppstår.
For eksempel, hos denne pasienten, selv om mutasjonen av interesse ikke ble oppdaget, ble mutasjonsstatusen bekreftet ved genomisk analyse av tumorvevet. PCR er en svært følsom teknikk som krever en hyppig dekontaminering av arbeidsområdet og utstyr for å unngå innhenting av falske positive data.
