حقن داخل الصفاق لدراسة القلب البالغ زبرافيش

في أبحاث القلب على حمار وحشي بالغ، وعادة ما تتم العلاجات المخدرات بطريقة نظامية. مع الحقن داخل الصدر، يمكن للمرء أن يسلم المحلّي حلّ إلى القلب دون أن يتسبّب في تلف عضلة القلب. هذه الطريقة تسمح بتسليم كميات صغيرة من الأدوية والبروتينات أو الجزيئات الأخرى في الحل على وجه التحديد حول قلب حمار وحشي بالغ.

لبدء هذا الإجراء، استخدم إبرة سحب لسحب microinjection تكييفها البورسليكات الزجاج الشعرية. تخزين الشعيرات الدموية المسحوبة في طبق بيتري تسعة سنتيمترات مع القضبان من الطين النمذجة أو شريط لاصق. باستخدام مقص مشترك، وقطع قطعة من الإسفنج، ونحت صورة ظلية مثل الأسماك في منتصفها.

المقبل, إعداد aliquots الصغيرة من حلول الحقن مع البروتينات اختبارها أو غيرها من المركبات. ضبط تركيزهم اعتمادا على المقايسة عن طريق تمييع المادة في 1x Hanks'حل الملح المتوازن تكملها 10٪ الفينول الأحمر. للحصول على تركيز العمل من التخدير، إضافة 2-3 ملليلتر من محلول مخزون tricaine إلى منقار يحتوي على 100 ملليلتر من مياه السمك.

أولا، قم بتشغيل المجهر ستيريو مع الضوء من أعلى، وضبط التكبير إلى 16x. نقع الاسفنج مع ماء السمك، ووضعها على طبق بيتري تسعة سنتيمترات على المجهر. ضبط التركيز، وتحت المجهر ستيريو، واستخدام مقص استئصال iriddecty لقطع نهاية 5500000 ميكروميلاري ما يقرب من سبعة ملليمترات من القاعدة، كما هو مفصل في الشكل 1A من بروتوكول النص.

إدراج قطع microcapillary في حامل إبرة الجهاز microinjector. باستخدام نصائح Microloader، تحميل حل التحكم لإعداد ضغط الحقن من أجل الحصول على تدفق المناسبة، ثم إفراغ الإبرة. بعد ذلك، قم بتحميل الحجم المحدد من محلول الحقن في طرف الشعيرات الدموية، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هوائية.

استخدام شبكة لصيد سمكة بالغة، ونقلها إلى محلول التخدير. بعد دقيقة إلى دقيقتين ، عندما تتوقف الأسماك عن السباحة وتنخفض حركة الأوبركولوم ، المس السمك بملعقة بلاستيكية للتأكد من عدم تفاعلها مع أي اتصال. المقبل، بسرعة وبعناية نقل الأسماك في الأخدود من الاسفنج الرطب، مع الجانب البطني.

يجب أن يشير رأس السمك بعيدا عن اليد المهيمنة للمشغل. تحت المجهر ستيريو، ومراقبة حركة القلب النابض بعناية تحت الجلد من الأسماك. بصريا تحديد نقطة الحقن فوق القلب النابض وفي منتصف المثلث، التي تحددها لوحات الكرتلاجين البطني.

إدراج طرف شعري في زاوية بين 30 و 45 درجة نسبة إلى محور الجسم. تخترق بلطف الجلد مع غيض من الكابيلا الدقيقة في المبايض. مرة واحدة في الإبرة داخل الم pericardium، اضغط على دواسة جهاز الحقن المجهري لإكمال الحقن.

بعد الحقن، سحب بلطف الشعرية من الصدر، ونقل الأسماك على الفور إلى خزان مع مياه النظام للانتعاش. مراقبة الأسماك حتى الشفاء التام من التخدير. لتحليل آثار الحقن، وجمع القلب في الوقت المطلوب، وإعداده لمزيد من التحليل.

في هذه الدراسة، يتم تسليم المركبات الخارجية والبروتينات في تجويف pericardial من أجل دراسة آثارها على القلب في حمار وحشي بالغ. للتحقق من صحة هذه الطريقة، يتم إجراء تجربتين اختبار عن طريق حقن اللون والأصباغ الفلورية في الأسماك القتل الرحيم. في كل من المقايسات، ويكشف تحليل كامل جبل وضع العلامات من القلب بأكمله بما في ذلك البطين، والأذين، وبلص الشريان.

تكشف هذه النتائج عن الانتشار الفعال لمحلول الحقن على سطح القلب. لمقارنة مدى ملاءمة الحقن داخل الصدر مقابل الحقن داخل الصفاق لدراسات القلب، يتم حقن كمية مماثلة من DAPI باستخدام كلا الأسلوبين. ثم يتم إصلاح القلوب بعد خمس دقائق أو 120 دقيقة.

لا توجد خلايا إيجابية DAPI لوحظت في القلوب بعد الحقن داخل الصفاق في أي من الاوقات الزمنية. في المقابل، تؤدي الحقن داخل الصدر إلى وجود نوى يحمل علامة DAPI في عضلة القلب. هذه النتائج تثبت أن الحقن داخل الصدر يحسن تسليم المركب إلى القلب، بالمقارنة مع الحقن داخل الصفاق.

لاختبار مدى ملاءمة هذه الطريقة لدراسات تجديد القلب، يتم بكتكات البطينين، ثم يتم إجراء الحقن في ثلاثة وسبعة أيام بعد cryoinjury. يحتوي كل من عضلة القلب والأنسجة المصابة على العديد من الخلايا الإيجابية DAPI ، مما يشير إلى اختراق فعال لهذه الصبغة في القلب السليم والأنسجة الليفية. وعلاوة على ذلك، يتم أيضا إدراج حقن phalloidin AF649 بواسطة cardiomyocytes من منطقة إصابة ما قبلي وبعض الخلايا الليفية المجندة من المنطقة الجرحى.

تكشف هذه التجربة أن الأدوية يمكن أن تعبر البايكوبارديوم وتخترق عضلة القلب الكامنة. بعد اختبار كفاءة الحقن داخل الصدر باستخدام الأصباغ ، يتم تحليل آثار البروتينات المحقونة على القلب. لهذا، يتم التحقيق في آثار السيتوكين الخارجية على عمليات مختلفة.

يتم تنشيط الجوانب البيولوجية لانتشار القلب وترسب المصفوفة خارج الخلية، والتوظيف الخلايا المناعية، والتعبير الجيني القلبي الحماية عن طريق حقن السيتوكين داخل الصدر. هذه النتائج تثبت أن الحقن داخل الصدر يوفر استراتيجية مناسبة للتسليم المستهدف من البروتينات لدراسة آثارها على أنسجة القلب متميزة في مجموعة متنوعة من المقايسات. إدخال الإبرة في الميّور في البريكارديوم هو خطوة أساسية للحقن الناجح.

شكل الإبرة وزاوية الاختراق ومواقع الثقب كلها عوامل تؤثر على إدخال الإبرة. بعد أو قبل الحقن داخل الصدر، يمكن للمرء أن يؤدي cryoinjury من أجل تحليل تأثير الجزيئات حقن على تجديد القلب. تم استخدام الحقن داخل الصدر في سمك الحمار الوحشي لدراسة الشروط المسبقة للقلب.

تم حقن بروتين يسمى CNTF وقد ثبت أنه يعزز البرامج cytoprotective ومناصر للتجديد في القلب.