Intrathoracic injektion til studiet af voksne Zebrafish hjerte

I hjerteforskningen på voksne zebrafisk, er narkotika behandlinger normalt gøres på en systemisk måde. Med intrathoracic injektion, kan man lokalt levere løsning til hjertet uden at forårsage myokardieskader. Denne metode giver mulighed for levering af små mængder af narkotika, proteiner eller andre molekyler i opløsning netop omkring hjertet af en voksen zebrafisk.

For at begynde denne procedure, bruge en nål puller til at trække mikroinjection-tilpasset borosilikat glas kapillærer. Opbevar de trak kapillærer i en ni-centimeter petriskål med skinner af modellering ler eller tape. Brug almindelig saks, skære et stykke svamp, og skære en fisk-lignende silhuet i midten.

Dernæst forberede små aliquots af injektionsopløsninger med de testede proteiner eller andre forbindelser. Koncentrationen justeres afhængigt af analysen ved at fortynde stoffet i 1x Hanks'balanced saltopløsning suppleret med 10% phenolrød. For at opnå arbejdskoncentrationen af bedøvelsesmidler tilsættes to til tre milliliter tricainbestandopløsning til et bægerglas indeholdende 100 milliliter fiskevand.

Tænd først for stereomikroskopet med lyset fra toppen, og juster forstørrelsen til 16x. Soak svampen med fiskevand, og læg den på en ni-centimeter petriskål på mikroskopet. Juster fokus, og under stereomikroskopet skal du bruge en iridektomisaks til at skære enden af et mikrokapillært ca. syv millimeter fra basen, som beskrevet i figur 1A i tekstprotokollen.

Sæt den afskårne mikrokapillary ind i kanyleholderen på mikroinjektorapparatet. Ved hjælp af Microloader-spidserne skal du indlæse en kontrolløsning for at sætte injektionstrykket op for at opnå det rette flow og derefter tømme nålen. Derefter indlæst den valgte volumen af injektionsopløsningen i spidsen af kapillæren, og sørg for, at der ikke er nogen luftbobler.

Brug et net til at fange en voksen fisk, og overføre det til bedøvelsesmiddel opløsning. Efter et til to minutter, når fisken holder op med at svømme, og operculums bevægelse reduceres, skal du røre ved fisken med en plastikske for at sikre, at den ikke reagerer på nogen kontakt. Dernæst hurtigt og forsigtigt overføre fisken i rillen af den våde svamp, med ventrale side op.

Fiskens hoved skal pege væk fra operatørens dominerende hånd. Under stereomikroskopet skal du omhyggeligt observere det bankende hjertes bevægelse under fiskens hud. Visuelt bestemme injektionspunktet over det bankende hjerte og i midten af trekanten, defineret af ventrale bruskilaginøse plader.

Sæt spidsen af kapillæren i en vinkel mellem 30 og 45 grader i forhold til karrosseriaksen. Træd forsigtigt ind i huden med spidsen af mikrokapillæren ind i pericardium. Når nålen er inde i pericardium, skal du trykke på pedalen af mikroinjektor enheden for at fuldføre injektionen.

Efter injektion trækkes kapillæren forsigtigt ud af brystkassen, og fisken overføres straks til en tank med systemvand til genvinding. Overvåge fisken indtil total helbredelse fra anæstesi. At analysere virkningerne af injektion, indsamle hjertet på det ønskede tidspunkt, og forberede det til yderligere analyse.

I denne undersøgelse, eksogene forbindelser og proteiner leveres i perikardiehulen for at studere deres virkninger på hjertet i voksne zebrafisk. For at validere denne metode udføres to testforsøg ved at indsprøjte farve- og fluorescerende farvestoffer i aflivede fisk. I begge analyser, afslører hele mount analyse mærkning af hele hjertet, herunder hjertekammer, atrium, og bulbus arteriosus.

Disse resultater afslører effektiv spredning af injektionsopløsningerne på hjerteoverfladen. For at sammenligne egnetheden af intrathoracic injektion versus intraperitoneal injektion for hjerteundersøgelser, en lignende mængde DAPI injiceres ved hjælp af begge metoder. Hjerterne fastsættes derefter efter enten fem minutter eller 120 minutter.

Der observeres ingen DAPI-positive celler i hjerterne efter intraperitoneal injektion på begge tidspunkt. I modsætning hertil resulterer intrathoracic injektioner i overværelse af DAPI-mærket kerner i myokardiet. Disse resultater viser, at intrathoracic injektion forbedrer leveringen af forbindelsen til hjertet, i forhold til den intraperitoneale injektion.

For at teste egnetheden af denne metode til hjerteregenerering undersøgelser, hjertekamre er kryoskadede, og derefter injektioner udføres på tre og syv dage efter kryopijury. Både myokardiet og det skadede væv indeholder mange DAPI-positive celler, hvilket indikerer en effektiv indtrængen af dette farvestof i det intakte hjerte og fibrotisk væv. Desuden er injiceret phalloidin AF649 også indarbejdet af kardiomyocytter af peri-skade zone og nogle rekrutteret fibroblaster i det sårede område.

Dette eksperiment afslører, at narkotika kan krydse epicardium og trænge ind i den underliggende myokardiet. Efter at have testet effektiviteten af intrathoracic injektioner ved hjælp af farvestoffer, virkningerne af proteiner injiceres på hjertet analyseres. Til dette undersøges virkningerne af det eksogene cytokin på forskellige processer.

De biologiske aspekter af kardiomyocyt spredning, ekstracellulære matrix deposition, immuncelle rekruttering, og kardiobeskyttende genekspression aktiveres ved intrathoracic injektion af cytokin. Disse resultater viser, at intrathoracic injektion giver en passende strategi for målrettet levering af proteiner til at studere deres virkninger på forskellige hjertevæv i en række analyser. Indføring af nålen i pericardium er et vigtigt skridt for en vellykket injektion.

Formen af nålen, vinklen af penetration, og punktering steder er alle faktorer, der påvirker nålen indsættelse. Efter eller forud intrathoracic injektion, kan man udføre kryoskade for at analysere effekten af injicerede molekyler på hjerte regenerering. Intrathoracic injektion blev brugt i zebrafisk til at studere hjertekonditionering.

Et protein kaldet CNTF blev injiceret og har vist sig at forbedre cytoprotective og pro-regenerative programmer i hjertet.