Name: intrathoracic injection for the study of adult zebrafish heart
Uploaded: 2019-05-14T15:00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intrathoracic Injection for the Study of Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Vi takker V. Zimmermann for fremragende teknisk assistance og for fiskepleje, D. König (universitetet i Fribourg) for kritisk læsning af manuskriptet, D. Kressler (universitetet i Fribourg) for hjælp med zCNTF proteinsyntese, F. Ruggiero (Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon) for at give ColXII antistof, og P. Martin (University of Bristol) for L-plastin antistof. Vi takker billedbehandlings kerneanlægget og proteomics platformen ved universitetet i Fribourg. Dette arbejde blev støttet af Swiss National Science Foundation, Grant nummer 310030_179213, og af Schweizerische Herzstiftung (Swiss Heart Foundation).

Dyrepasning og alle dyreforsøg, der er beskrevet i følgende protokol, blev godkendt af det kantonale Veterinærkontor i Fribourg, Schweiz.
1. værktøj og løsninger til injektioner
<ol><li>Tag mikroinjekteret borosilicat glas kapillærer ved hjælp af en nål-aftrækker i henhold til figur 1a. Store trukket kapillærer i en 9 cm Petri skål med skinner af modellering ler eller tape.</li>
	<li>Brug almindelige sakse, skær et stykke svamp (7 cm x 3 cm x 1 cm) og skære en fisk-lignende silhuet i midten.</li>
	<li>Forbered små aliquoter af injektionsvæske med de testede proteiner eller andre forbindelser. Koncentrationen justeres afhængigt af analysen ved fortynding af stoffet i 1x Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) suppleret med 10% phenol rødt. Bemærk: Her var koncentrationen af det testede protein 100 ng/mL.</li>
	<li>For at forberede en stamopløsning af buffer-tricain anæstetika, opløses 4 g tricain i 980 mL destilleret vand. PH justeres til 7,0 − 7.4 med 1 M Tris-HCl pH 9, og der fyldes op med vand til 1.000 mL. Opløsningen opbevares i mørke ved 4 °C.</li>
	<li>For at opnå en koncentration af anæstetika i arbejde tilsættes 1 − 2 mL tricain stamopløsning i 50 mL fiskevand i et bægerglas. Bemærk: Den arbejdende koncentration af tricain anæstetika skal tilberedes frisk før brug.</li>
</ol>2. klargøring af injektions stationen
<ol><li>Tænd for stereomikroskopet med lyset fra toppen, og Juster forstørrelsen til 16x.</li>
	<li>Sug svampen med fiskevand, Anbring den på en 9 cm Petri skål på mikroskopet og justér fokus.</li>
	<li>Under stereomikroskopet, skæres enden af en mikrokapillar på ~ 7 mm fra basis ved hjælp af en iridectomi saks som vist i figur 1a. Den ideelle spids diameter ville være ~ 20 μm. Bemærk: Skæring spidsen af kapillar i en skrå måde er optimal for indsættelser i vævet.</li>
	<li>Mikrokapillar skal indsættes i kanyle holderen på mikroinjektor apparatet.</li>
	<li>Ved hjælp af Micro loader tips, indlæse en kontrol løsning (f. eks 1x HBSS) at indstille trykket af injektion, for at opnå den passende flow mellem 0,3 μL/s og 0,5 μL/s. Tøm nålen.</li>
	<li>Det valgte volumen af injektionsopløsningen (f. eks. den ciliære neurotrofiske faktor [CNTF] fortyndet i 1x HBSS) indlæses i spidsen af kapillar (figur 1b). Der bør ikke være nogen luftboble i kapillar. Bemærk: Den maksimale mængde injektionsvæske afhænger af fiskens størrelse. For en standard længde på 2,5 − 3 cm (afstand fra snuden til hale pedonren) bestemmes den maksimale Injektionsvolumen, der forhindrer exessiv thorax hævelse og blødning, at være 5 μL (figur 1f). Større mængder kan injiceres til større fisk.</li>
</ol>3. tilberedning af fisk til Intrathoracic injektion
<ol><li>Fang en voksen zebrafisk (Danio rerio) med et net, og overfør det til den anæstetiske opløsning.</li>
	<li>Efter 1 − 2 min., når fiskene stopper svømning og bevægelsen af laag er reduceret, røre fiskene med en plastik ske for at sikre, at det ikke reagerer på nogen kontakt.</li>
	<li>Hurtigt og forsigtigt overføre fiskene med skeen i rillen af den våde svamp, med ventrale side op. Lederen af fisken bør pege væk fra operatørens dominerende hånd.</li>
</ol>4. mikroindsprøjtning i pericardium
<ol><li>Under stereomikroskopet, nøje observere bevægelsen af bankende hjerte under huden af fisken. Visuelt bestemme Indsprøjtnings punktet over bankende hjerte og i midten af trekanten defineret af de ventrale brusk plader (figur 1d). Sæt spidsen af kapillar ved 30 − 45 ° graders vinkel i forhold til krops aksen (figur 1E). Trænger forsigtigt ind i huden med spidsen af mikrokapillar ind i hjertesækken (figur 1c). Et optimalt indgangspunkt er tættere på maven end på hovedet. Bemærk: Kapillar må ikke indsættes for dybt i kroppen og hjertet, da dette vil forårsage skade på orglet. I tilfælde af hjerte punktering fyldes nålen normalt med blod. Hvis dette sker, skal du fjerne kapillar og udelukke fiskene fra eksperimentet.</li>
	<li>Når nålen er inde i pericardium, komplet injektion ved at trykke på pedalen af mikroinjektor enhed. Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at injicere luft ind i brysthulen.</li>
	<li>Efter injektion, forsigtigt trække kapillar fra brystkassen og straks overføre fiskene til en tank med system vand til nyttiggørelse.</li>
	<li>Overvåg fiskene indtil total restitution fra anæstesi.</li>
	<li>Saml hjertet på det ønskede tidspunkt og Forbered det til yderligere analyse. Bemærk: Hvis fiskene ikke genoptager driften af laag inden for 30 s, skal du genoplive fiskene ved at klemme vand ind i gællerne med en plastik pipette.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tzahor, E., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+strategies:+Staying+young+at+heart.">Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart.</a> Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).</li><li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues.">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> npj Regenerative Medicine. 3 (1), (2018).</li><li>Xiang, M. S. W., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Mechanisms+of+Cardiac+Regeneration.">Endogenous Mechanisms of Cardiac Regeneration.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 326, 67-131 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+heart+regeneration:+15+years+of+discoveries.">Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries.</a> Regeneration. 4 (3), 105-123 (2017).</li><li>Jazwinska, A., Sallin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+versus+scarring+in+vertebrate+appendages+and+heart.">Regeneration versus scarring in vertebrate appendages and heart.</a> The Journal of Pathology. 238 (2), 233-246 (2016).</li><li>Sehring, I. M., Jahn, C., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+fin+and+heart:+what's+special+about+regeneration?.">Zebrafish fin and heart: what's special about regeneration?.</a> Current Opinion in Genetics &#38; Development. 40, 48-56 (2016).</li><li>Rubin, N., Harrison, M. R., Krainock, M., Kim, R., Lien, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+understanding+endogenous+heart+regeneration-insights+from+adult+zebrafish+and+neonatal+mice.">Recent advancements in understanding endogenous heart regeneration-insights from adult zebrafish and neonatal mice.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 58, 34-40 (2016).</li><li>Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+heart+regenerates+after+cryoinjury-induced+myocardial+infarction.">The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction.</a> BMC Developmental Biology. 11, 21 (2011).</li><li>Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cryoinjury+induced+necrotic+heart+lesions+in+zebrafish+is+associated+with+epicardial+activation+and+cardiomyocyte+proliferation.">Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li><li>Cao, J., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+a+hub+for+heart+regeneration.">The epicardium as a hub for heart regeneration.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (10), 631-647 (2018).</li><li>Andres-Delgado, L., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+cardiac+function+and+heart+development.">Interplay between cardiac function and heart development.</a> Biochim Biophys Acta. 1863, 1707-1716 (2016).</li><li>Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallels+between+vertebrate+cardiac+and+cutaneous+wound+healing+and+regeneration.">Parallels between vertebrate cardiac and cutaneous wound healing and regeneration.</a> npj Regenerative Medicine. 3, 21 (2018).</li><li>Lai, S. -. L., Mar&#237;n-Juez, R., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+in+cardiac+repair+and+regeneration:+a+comparative+point+of+view.">Immune responses in cardiac repair and regeneration: a comparative point of view.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Kikuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+contribution+to+zebrafish+heart+regeneration+by+gata4(+)+cardiomyocytes.">Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes.</a> Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).</li><li>Jopling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+heart+regeneration+occurs+by+cardiomyocyte+dedifferentiation+and+proliferation.">Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation.</a> Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).</li><li>Pfefferli, C., Ja&#378;wi&#324;ska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+careg+element+reveals+a+common+regulation+of+regeneration+in+the+zebrafish+myocardium+and+fin.">The careg element reveals a common regulation of regeneration in the zebrafish myocardium and fin.</a> Nature Communications. 8, 15151 (2017).</li><li>S&#225;nchez-Iranzo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx5a+lineage+tracing+shows+cardiomyocyte+plasticity+during+zebrafish+heart+regeneration.">Tbx5a lineage tracing shows cardiomyocyte plasticity during zebrafish heart regeneration.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Wang, J., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+Inducing+Cardiac+Injury+and+Assaying+Regeneration+in+Adult+Zebrafish.">Methodologies for Inducing Cardiac Injury and Assaying Regeneration in Adult Zebrafish.</a> Methods In Molecular Medicine. 1451, 225-235 (2016).</li><li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+Fish,+Big+Data:+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease.">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).</li><li>de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+inflammation+on+preconditioning+and+regeneration+of+the+adult+zebrafish+heart.">Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart.</a> Open Biology. 6 (7), (2016).</li><li>de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Sallin, P., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconditioning+boosts+regenerative+programmes+in+the+adult+zebrafish+heart.">Preconditioning boosts regenerative programmes in the adult zebrafish heart.</a> Open Biology. 6 (7), (2016).</li><li>Bise, T., de Preux Charles, A. S., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+stimulates+cardioprotection+and+the+proliferative+activity+in+the+zebrafish+adult+heart.">Ciliary neurotrophic factor stimulates cardioprotection and the proliferative activity in the zebrafish adult heart.</a> npj Regenerative Medicine. 4, (2019).</li><li>Thorimbert, V., Konig, D., Marro, J., Ruggiero, F., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein+signaling+promotes+morphogenesis+of+blood+vessels,+wound+epidermis,+and+actinotrichia+during+fin+regeneration+in+zebrafish.">Bone morphogenetic protein signaling promotes morphogenesis of blood vessels, wound epidermis, and actinotrichia during fin regeneration in zebrafish.</a> The FASEB Journal. 29 (10), 4299-4312 (2015).</li><li>K&#246;nig, D., Page, L., Chassot, B., Ja&#378;wi&#324;ska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+actinotrichia+regeneration+in+the+adult+zebrafish+fin.">Dynamics of actinotrichia regeneration in the adult zebrafish fin.</a> Developmental Biology. 433 (2), 416-432 (2018).</li><li>Sallin, P., Ja&#378;wi&#324;ska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+stress+is+detrimental+to+heart+regeneration+in+zebrafish.">Acute stress is detrimental to heart regeneration in zebrafish.</a> Open Biology. 6 (3), 160012 (2016).</li><li>Mokalled, M. H., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Regeneration+Toolkit.">A Regeneration Toolkit.</a> Developmental Cell. 47 (3), 267-280 (2018).</li><li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+Injection+in+Adult+Zebrafish.">Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (34), e1645 (2009).</li><li>Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+Injection+into+Adult+Zebrafish.">Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-mediated+siRNA+Gene-silencing+in+Adult+Zebrafish+Heart.">Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).</li><li>Chablais, F., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarction+in+adult+zebrafish+using+cryoinjury.">Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoinjury+as+a+myocardial+infarction+model+for+the+study+of+cardiac+regeneration+in+the+zebrafish.">Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish.</a> Nature Protocols. 7 (4), 782-788 (2012).</li><li>Marro, J., Pfefferli, C., de Preux Charles, A. S., Bise, T., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+XII+Contributes+to+Epicardial+and+Connective+Tissues+in+the+Zebrafish+Heart+during+Ontogenesis+and+Regeneration.">Collagen XII Contributes to Epicardial and Connective Tissues in the Zebrafish Heart during Ontogenesis and Regeneration.</a> PLoS One. 11 (10), e0165497 (2016).</li><li>Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxorubicin-induced+Cardiomyopathy+Model+in+Adult+Zebrafish.">A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), (2018).</li><li>Diao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-PLA+nanoparticles+facilitate+siRNA+knockdown+in+adult+zebrafish+heart.">PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart.</a> Developmental Biology. 406 (2), 196-202 (2015).</li><li>Lloyd, L. C., Etheridge, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathological+and+serological+response+induced+in+pigs+by+parenteral+inoculation+of+Mycoplasma+hyopneumoniae.">The pathological and serological response induced in pigs by parenteral inoculation of Mycoplasma hyopneumoniae.</a> Journal of Comparative Pathology. 91 (1), 77-83 (1981).</li><li>Zhou, A., Guo, L., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+an+intrathoracic+injection+of+sodium+hyaluronic+acid+on+the+prevention+of+pleural+thickening+in+excess+fluid+of+tuberculous+thoracic+cavity.">Effect of an intrathoracic injection of sodium hyaluronic acid on the prevention of pleural thickening in excess fluid of tuberculous thoracic cavity.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (3), 203-205 (2003).</li><li>Prendiville, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+Transthoracic+Intramyocardial+Injection+in+Mice.">Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Her beskriver vi en metode til at levere eksogene forbindelser og proteiner ind i perikardiel hulen for at studere deres virkninger på hjertet hos voksne zebrafisk. Proceduren er baseret på intrathoraciske injektion, hvilket resulterer i leveringen af en lille mængde opløsning i nærheden af orgel. Denne teknik blev udviklet og beskrevet for at studere hjerte forkonditionering og regenerering.
Det kritiske trin i denne procedure er indtrængning af glas kapillar i brysthulen. Dette trin afhænger af tre parametre, som er: stivhed og skarphed af kapillar spidsen, vinklen af penetration, og punktering stedet. For at optimere penetration gennem huden, den trak del af kapillar bør ikke være for lang, da sådanne nåle er for fleksible og bøje i kontakt med huden. For at undgå dette kan stivheden tilpasses ved at reducere spids størrelsen med iridectomi-Scissor. Selv om vinklen af penetration kan variere mellem 30 ° og 45 °, kan det tilpasses til stivheden af spidsen. Faktisk vil en tynd spids trænge ind i huden bedre med en smallere vinkel.
For at optimere nålen penetration, bør indsættelsen stedet være umiddelbart over bankende hjerte. Risikoen for hjerte punktering er sædvanligvis lav, nemlig mellem 5% og 8%. Indsættelse af nålen posterior til hjertet øger risikoen for hjerte punktering, som ses af øget blødning. I sådanne tilfælde bør dyrene fjernes fra forsøgene.
En anden kilde til problemer under IT-injektion sker på kapillar niveau. Faktisk kapillar kan bryde, når laterale kræfter er udøvet på det. For at undgå dette skal nålen bevæge sig langs Indsprøjtnings aksen på en lige måde. Lejlighedsvis kan kapillar blokeres af vævs rester, der forhindrer væsken i at flyde. Nålen kan ikke blokeres ved forsigtigt at trække spidsen af, mens du injicerer. Hvis dette ikke forbedrer flowet, anbefaler vi, at nålen trækkes helt ud af brystkassen, og nålen udskiftes.
Læsioner kan forårsages af en for dybt indsat nål i pericardium. For at undgå læsioner i perikardiale sækken må nålen ikke indsættes for meget (1 − 2 mm) i brystkassen. Der blev observeret visse lækager, når injektionsvolumenet var større end 8 μL.
I zebrafish er den nøjagtige sammensætning af perikardievæsken ukendt. Mængden af perikardiel hulen anslås dog til ~ 10 μL31. I betragtning af, at mængden af den voksne zebrafiskventrikel er ca. 1 − 2 mm3, antager vi, at perikardiel hulrummet i overensstemmelse hermed har en lille volumen, som skal overvejes før injektioner. Fra vores indledende undersøgelser, vi fastslået, at den optimale rækkevidde af den injicerede volumen er mellem 0,5 og 3 μL for fisk måler 2,5 − 2,8 cm (afstand fra snuden til hale pedonkel). Dette volumen kan tilpasses afhængigt af størrelsen af fisken. Injektion af op til 5 μL inducerede ingen læsion i fisk af denne størrelse. Mængder fra 8 μL var imidlertid tilstrækkelige til at forårsage svulmende og indre blødninger som vist i figur 1f. Baseret på disse data anslår vi, at en mængde opløsning, der er større end 3 μL, kan forårsage fysisk og fysiologisk stress på orglet. Denne begrænsning udleder behovet for at vælge en højere koncentration af molekyler i stedet for at øge mængden af den injicerede opløsning.
En anden vigtig faktor er den osmotiske egenskab af den injicerede opløsning, som bør være i det fysiologiske område. For at undgå en risiko for osmotisk stress, anbefaler vi HBSS som injektions medium.
I zebrafish, de fælles metoder, der anvendes til at levere narkotika er gennem vandbehandling og intraperitoneal injektion30,35. Selv om begge disse teknikker er egnet til mange applikationer, IT-injektioner giver eksperimentelle og økonomiske fordele, ved at mindske risikoen for uønskede systemiske bivirkninger og reducere brugen af dyre molekyler, hhv. Denne metode kan være egnet til levering af tamoxifen til at aktivere CRE-ERT2 transgene system, der anvendes til celle Lineage sporing analyse, og guide modificerede RNAs for funktionelle undersøgelser i regenerering forskning.
IT-injektion metode i: zebrafisk er tidligere blevet beskrevet31,36. I disse rapporter, intrathoraciske injektioner blev udført med insulin nål, punktering fra den forreste side. I modsætning hertil præsenterer vores protokol en alternativ strategi med den trukket glas kapillar indsat fra den bageste retning. Specifikt, vores tilgang tager hensyn til anatomien af fiskene hjertesækken at optimere injektion med en reduceret risiko for hjerte punktering. Under proceduren holdes fisken desuden ikke af metalliske pincet, men af en fugtig og blød svamp, som er en mere velegnet metode til at undgå ydre skader på fiskene. Således kan den præsenterede metode være bedre egnet til studier af kardiel homøostase, forkonditionering og regenerering i voksne zebrafisk.
Der er allerede etableret IT-injektioner i pattedyrs modelorganismer. Faktisk er denne metode også blevet anvendt i eksperimenter med svin og kliniske undersøgelser hos mennesker37,38. I mus, transthoracic intramyokardielle injektioner guidet af ultralyd er blevet brugt til at udfordre deres hjerte39. I denne artikel foreslår vi en detaljeret protokol til at lette brugen af IT-injektion for zebrafish. Dette vil være særlig værdifuldt for området, for at supplere genetiske tilgange i hjerte homøostase, forkonditionering og regenerering forskning.

Blandt vertebrater besidder: zebrafisk en bemærkelsesværdig evne til at regenerere deres hjerter1,2. Denne evne er blevet rapporteret i flere skade modeller, nemlig ventrikulær Apex resection, kryoskade (CI) og genetisk kardiomyocyte ablation3,4,5,6,7. Efter invasive skader, den beskadigede væg af ventrikel bliver transitidigt helbredt af fibrotisk væv, som gradvist erstattes af en ny myokardiet8,9,10,11. Den tidlige sårheling respons involverer epicardium aktivering og rekruttering af immunceller12,13,14,15. Samtidig bliver kardiomyocytter i nærheden af det skadede myokardiet aktiveret, dedifferentierer, formere sig og erstatter gradvist det sårede område inden for 30 − 90 dage16,17,18, 19. der er opnået betydelige fremskridt med hensyn til at dechifrere de molekylære og cellulære mekanismer i hjerte regenerering takket være tilgængeligheden af genetiske værktøjer, såsom celle-Lineage sporings analyse, inducerbar gen overekspression, fluorescerende vævs reporter og crispr/Cas9 genmutagenese20,21.
Vi har for nylig etableret en model af hjerte forkonditionering i den voksne: zebrafisk af torakotomi22,23. Forkonditionering øger ekspressionen af cardioprotective gener og hæver genindgangen i cellecyklussen i det intakte og regenererende hjerte. Disse processer er forbundet med rekruttering af immunceller og matrix remodeling22,24. Mekanismerne til forkonditionering er dårligt forstået, og det er nødvendigt at indføre nye teknikker for at fremme dette forskningsområde. Især er optimeret administration af udskillede signalering proteiner eller andre kemiske forbindelser er afgørende for yderligere at undersøge dette emne.
At være akvatiske dyr, kan: zebrafisk naturligt absorbere forskellige stoffer opløst i vand gennem deres gyller og hud. Dette giver mulighed for ikke-invasiv medicin levering gennem nedsænkning af fisk i løsninger med forskellige kemikalier, såsom farmakologiske hæmmere, steroid hormoner, Tamoxifen, BrdU og antibiotika. Faktisk har talrige undersøgelser fra forskellige laboratorier, herunder vores25,26,27, benyttet sig af denne metode, som er særlig værdifuld inden for regenerativ biologi6, 28. denne fremgangsmåde er dog ikke egnet til levering af PEPTIDER, DNA, RNA, morpholinoer eller molekyler med begrænset vævs gennemtrængelighed. I disse tilfælde opnås en mere effektiv levering ved mikroindsprøjtning i kroppen, for eksempel ved at indsætte kapillar i den retroorbitale venøs sinus, ind i intraperitoneal eller intraperikardiel hulrum29,30, af 31. Her beskriver vi en procedure for intrathoraciske injektion af en lille mængde opløsning, som en passende metode til at studere hjerte regenerering og forkonditionering i voksne zebrafisk.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco by Life technology</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macroscope (binocular)</td>
			<td>M400</td>
			<td></td>
			<td>with Apozoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injector femtojet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247 0034 77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloaders femtotips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242 956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette glass needles type C</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-6</td>
			<td>thin-wall capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller model P-87</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>20081016</td>
			<td>filament box 2.5 x 4.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td>any</td>
			<td>any</td>
			<td>dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Anestethic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes and Antibodies</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Chicken Cy5</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Guinea pig Cy5</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit Cy5</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken l-plastin</td>
			<td>gift from P. Martin, Bristol</td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1 / 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Concentration: 1 / 2000 (1&#181;g/ml); 1/100 IT injected</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-ColXII</td>
			<td>gift from Florence Ruggerio, Lyon</td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Atto-565 (F-actin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94072</td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Atto-647 (F-actin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95906</td>
			<td>Concentration: 1 / 50 IT injected</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-MCM5</td>
			<td>gift from Soojin Ryu, Heidelberg</td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stamping Ink 4K</td>
			<td>Pelikan</td>
			<td>1 4k 351 197</td>
			<td>Concentration: 1 / 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISH probe primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystatin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gene number: ENSDARG00000074425 
			&#8203;fw primer: GATTCACTGTCGGGTTTGGG 
			Rev primer: ATTGGGTCCATGGTGACCTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intrathoracic injection for the study of adult zebrafish heart

Den voksne: zebrafisk hjerte giver en kraftfuld model i hjerte regenerering forskning. Selv om styrken af dette system er baseret på transgene tilgange, en hurtig levering af eksogene faktorer giver en supplerende teknik i funktionelle undersøgelser. Her præsenterer vi en metode, der er afhængig af administration af et par mikroliter af opløsningen i perikardiel hulen uden at forårsage Myokardie skader. Intrathoracic (IT) injektioner kan effektivt levere proteiner og kemiske forbindelser direkte på hjerte overfladen. De injicerede stoffer spredes gennem epicardiet til det underliggende kardiale væv. Sammenlignet med intraperitoneale (IP) injektioner er den største fordel ved intrathoraciske injektioner den fokale administration af de testede faktorer på målorganet. Leveringen af molekyler direkte ind i hjertesækken er en passende strategi for studier af hjerte forkonditionering og regenerering hos voksne zebrafisk.

Efter intrathoraciske (IT) injektioner, kan virkningerne af eksogene opløsning analyseres. Til dette formål, fiskene skal aflives og hjerter indsamlet, faste og histologisk behandlet, ifølge tidligere offentliggjorte protokoller32,33.
For at validere metoden udførte vi først to test eksperimenter ved at injicere farve og fluorescerende farver. For det første har vi euthaniserede fisk og post mortem injiceret 3 μL blæk ind i brystkassen. Hjerterne blev indsamlet efter 5 min, vasket i fosfat-Buffered saltvand (PBS), fast i 2% formalin, vasket i PBS og fotograferet under mikroskop. For det andet injicerede vi 3 μL 1 μg/mL 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) in vivo og Fiksede hjertet efter 2 timer. I begge assays, hele-Mount analyse afslørede mærkning af hele hjertet, herunder ventrikel, atrium og bulbus arteriosus (figur 2a, B). Disse resultater afslører effektiv spredning af den injicerede opløsning på hjerte overfladen.
En fælles protokol for levering af eksogene stoffer til voksne fisk er intraperitoneal (IP) injektion. For at sammenligne egnetheden af IT versus IP injektioner for hjerteundersøgelser, injicerede vi en lignende mængde DAPI ved hjælp af begge metoder og faste hjerter efter 5 min og 120 min (figur 3a). Hjerterne blev sekeret og farves med phalloidin Alexa fluor (AF) 568, der mærker F-actin i hjertemusklen. Der blev ikke observeret DAPI-positive celler i hjerterne efter IP-injektion på begge tidspunkter (figur 3b). Derimod resulterede IT-injektion i tilstedeværelsen af DAPI-mærkede kerner i myokardiet (figur 3b). Disse resultater viser, at IT-injektion forbedret levering af stoffet til hjertet, sammenlignet med IP injektion.
For at teste egnetheden af denne metode til hjerte regenerering undersøgelser, vi kryoskadede ventrikler8, og udførte it injektioner af 3 μl af 1 μg/ml dapi og 1 μg/ml phalloidin AF649 ved 3 og 7 dage efter kryoskade (dpci) (figur 4a). Ved 1 h efter injektion blev hjerterne samlet, fikseret, sekeret og farves med phalloidin AF568 for at visualisere det intakte myokardiet. Vi konstaterede, at både myokardiet og det skadede væv indeholdt talrige DAPI-positive celler, hvilket indikerer en effektiv penetration af dette farvestof i intakt hjerte og fibrotisk væv (figur 4b). Desuden blev injiceret phalloidin AF649 også indarbejdet ved kardiomyocytter af den peri-skade zone og nogle rekrutterede fibroblaster af det sårede område. Dette eksperiment afslører, at stofferne kan krydse epikardiet og trænge ind i det underliggende myokardiet.
Efter at have testet effektiviteten af IT-injektioner ved hjælp af farvestoffer, vi analyserede virkningerne af injicerede proteiner på hjertet. Vi syntetiserede en Cytokine, kaldet CNTF, som er upreguleret efter torakotomi24. Vi undersøgte virkningerne af den eksogene CNTF på forskellige processer, nemlig kardiomyocyte proliferation, ekstracellulære matrix deposition, immuncelle rekruttering og cardioprotective genekspression. Vi konstaterede, at alle disse biologiske aspekter blev aktiveret ved IT-injektion af CNTF, sammenlignet med kontrol af immunglobuliner (figur 5)24. Disse resultater viser, at metoden til intrathoraciske injektion giver en passende strategi for målrettet levering af proteiner til at studere deres virkninger på særskilt hjerte væv i en række assays.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59724/59724fig1.jpg"> Figur 1: Intrathorascic (IT) injektion i voksne zebrafisk. A) fotografi af et trukket mikroinjektionskapillar med glødetråd (6 ", 1,0 mm i diameter) og værdier af det anvendte nåle pullerprogram. B) fotografi af et trukket mikroinjektionskapillar med glødetråd (6 ", 1,0 mm i diameter) fyldt op med 2,5 μl opløsning indeholdende 10% phenol rødt. Den trak spidsen af nålen er maksimalt 7 mm lang. C) skematisk gengivelse af it-Injektionsproceduren. D) fotografier af it-Injektionsproceduren. Dette tal er blevet ændret fra Bise et al.24. Tallene i panelerne C og D svarer til de samme trin i proceduren: (1) fiskene anbringes ventrale side op på en furet svamp. Punkterings stedet (rød prik i trekanten) er placeret i midten af brystet nær gællerne. (2) indtrængen af nålen ind i pericardium. Rød prik indikerer punkterings sted. (3) injektionen overvåges ved at observere spredningen af den røde opløsning i perikardiel hulen. (E) ordning af det injektion. Vinklen mellem injektions kapillar og krops aksen skal være mellem 30 ° og 45 ° for at undgå hjerte punktering. F) fotografier af fiske thorax 1 time efter injektion af indikerede volumener. Hvide pile peger på redish-vævet, hvilket kan indikere indre blødning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59724/59724fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59724/59724fig2.jpg"> Figur 2: IT-indsprøjtede opløsninger spredes næsten ensartet på hjerte overfladen. (A) stereomicroskop-billeder af hele hjerter af fisk, der er underkastet post mortem-it-injektion med 2,5 ΜL hbss eller 2,5 μl blæk. Blækket farvede overfladen af ventrikel (V), atrium (a) og bulbus arteriosus (BA). Skaleringsbar = 300 μm. (B) lyse felter og fluorescerende stereomikroskop billeder af hele hjerter af fisk, der udsættes for it-injektion med HBSS og 3 μl 1 μg/ml dapi. DAPI-fluorescens påvises på hjerte delene kort efter injektion. Skaleringsbar = 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59724/59724fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59724/59724fig3.jpg"> Figur 3: sammenligning af to injektions metoder til levering af DAPI til hjertet. A) forsøgs ordningens udformning. Intraperitoneal (IP) og Intrathorascic (IT) injektioner blev udført med samme mængde 1 μg/mL DAPI (3 μL). Hjerter blev indsamlet ved 5 og 120 min. efter injektion. (B) konfokale mikroskopi billeder af hjerte sektioner bejdset med fluorescerende phalloidin (rød), der rigeligt etiketter muskelfibre. Injiceret DAPI blev visualiseret i den relevante kanal vist med grønt. Efter IP injektion, DAPI er ikke påvist i hjertet på noget tidspunkt. Efter injektion er DAPI positive celler til stede i ventriklen efter begge tidspunkter. Skaleringsbar = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59724/59724fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59724/59724fig4.jpg"> Figur 4: IT-injektion til at studere hjerte regenerering. A) forsøgs ordningens udformning. Ved 3 og 7 dage efter kryoskade blev der indsprøjtet en blanding af DAPI og phalloidin AF649 (3 μL 1 μg/mL). Hjerter blev indsamlet 1 time efter IT injektion, fast, sekeret og farves med phalloidin AF568 (rød). (B) konfokale mikroskopi billeder af langsgående hjerte sektioner ved 3 og 7 dpci. Injicerede DAPI (grøn) og phalloidin AF649 (blå) etiket celler i det skadede område (afgrænset af hvid stiplet linje) og det intakte myokardium (rødt farvning). Hvide pile peger på DAPI (grøn) distribution gennem intakt kompakt og trabeculated myokardi og epicardium. Skaleringsbar = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59724/59724fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59724/59724fig5.jpg"> Figur 5: eksogene it-injiceret CNTF stimulerer flere biologiske processer i hjertet. A) forsøgs ordningens udformning. For det første blev 2,5 μl af en opløsning indeholdende 250 ng af: zebrafisk CNTF eller kontrol immunglobuliner (Higg) injiceret i hjertesækken af transgene fisk, der udtrykte nuklear DsRed2 i kardiomyocytter. Hjerter blev indsamlet på 7 og 1 dage efter injektion (dpi) og analyseret ved immunofluorescens og in situ hybridisering, hhv. (B-D) Konfokale mikroskopi billeder af ventrikulære sektioner af kontrol og CNTF-injicerede hjerter. (B) immunofarvning mod en celle cyklus markør, minichromosome vedligeholdelses kompleks komponent 5 (MCM5; grøn), afslører et højere antal prolifererende kardiomyocytter som respons på eksogene CNTF. Skaleringsbar = 500 μm. (C) immun farvning mod kollagen XII viser øget aflejring af kollagen XII i myokardiet efter injektion af CNTF. I kontrol hjerte, kollagen XII er begrænset til epicardium34. Skaleringsbar = 500 μm. (D) immun farvning mod en immuncelle markør, L-plastin, registrerer en øget rekruttering af immunceller i den injicerede CNTF-fisk. Skaleringsbar = 500 μm. (E) Bright-felt mikroskop billeder af ventrikulære tværsnit efter in situ-hybridisering ved hjælp af en antisense mRNA-sonde mod cystatin, en cardioprotective faktor, viser transkriptional opregulering af dette gen i hjertet af CNTF-injicerede fisk. Skaleringsbar = 500 μm. Dette tal er blevet ændret fra Bise et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59724/59724fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intrathoracic Injection for the Study of Adult Zebrafish Heart at JoVE.com

Intrathoracic Injection for the Study of Adult Zebrafish Heart

Intrathoracic injektion til studiet af voksne Zebrafish hjerte

Denne metode er afhængig af injektion af 0,5 − 3 μL opløsning i thorax af voksne zebrafisk. Proceduren effektivt leverer proteiner og kemiske forbindelser i nærheden af zebrafiskhjertet uden at beskadige orgel. Fremgangsmåden er velegnet til afprøvning af udefrakommende faktorers virkninger på forskellige væv i hjertet.

The adult zebrafish heart provides a powerful model in cardiac regeneration research. Although the strength of this system is based on transgenic ...

I hjerteforskningen på voksne zebrafisk, er narkotika behandlinger normalt gøres på en systemisk måde. Med intrathoracic injektion, kan man lokalt levere løsning til hjertet uden at forårsage myokardieskader. Denne metode giver mulighed for levering af små mængder af narkotika, proteiner eller andre molekyler i opløsning netop omkring hjertet af en voksen zebrafisk.For at begynde denne procedure, bruge en nål puller til at trække mikroinjection-tilpasset borosilikat glas kapillærer. Opbevar de trak kapillærer i en ni-centimeter petriskål med skinner af modellering ler eller tape. Brug almindelig saks, skære et stykke svamp, og skære en fisk-lignende silhuet i midten.Dernæst forberede små aliquots af injektionsopløsninger med de testede proteiner eller andre forbindelser. Koncentrationen justeres afhængigt af analysen ved at fortynde stoffet i 1x Hanks'balanced saltopløsning suppleret med 10% phenolrød. For at opnå arbejdskoncentrationen af bedøvelsesmidler tilsættes to til tre milliliter tricainbestandopløsning til et bægerglas indeholdende 100 milliliter fiskevand.Tænd først for stereomikroskopet med lyset fra toppen, og juster forstørrelsen til 16x. Soak svampen med fiskevand, og læg den på en ni-centimeter petriskål på mikroskopet. Juster fokus, og under stereomikroskopet skal du bruge en iridektomisaks til at skære enden af et mikrokapillært ca. syv millimeter fra basen, som beskrevet i figur 1A i tekstprotokollen.Sæt den afskårne mikrokapillary ind i kanyleholderen på mikroinjektorapparatet. Ved hjælp af Microloader-spidserne skal du indlæse en kontrolløsning for at sætte injektionstrykket op for at opnå det rette flow og derefter tømme nålen. Derefter indlæst den valgte volumen af injektionsopløsningen i spidsen af kapillæren, og sørg for, at der ikke er nogen luftbobler.Brug et net til at fange en voksen fisk, og overføre det til bedøvelsesmiddel opløsning. Efter et til to minutter, når fisken holder op med at svømme, og operculums bevægelse reduceres, skal du røre ved fisken med en plastikske for at sikre, at den ikke reagerer på nogen kontakt. Dernæst hurtigt og forsigtigt overføre fisken i rillen af den våde svamp, med ventrale side op.Fiskens hoved skal pege væk fra operatørens dominerende hånd. Under stereomikroskopet skal du omhyggeligt observere det bankende hjertes bevægelse under fiskens hud. Visuelt bestemme injektionspunktet over det bankende hjerte og i midten af trekanten, defineret af ventrale bruskilaginøse plader.Sæt spidsen af kapillæren i en vinkel mellem 30 og 45 grader i forhold til karrosseriaksen. Træd forsigtigt ind i huden med spidsen af mikrokapillæren ind i pericardium. Når nålen er inde i pericardium, skal du trykke på pedalen af mikroinjektor enheden for at fuldføre injektionen.Efter injektion trækkes kapillæren forsigtigt ud af brystkassen, og fisken overføres straks til en tank med systemvand til genvinding. Overvåge fisken indtil total helbredelse fra anæstesi. At analysere virkningerne af injektion, indsamle hjertet på det ønskede tidspunkt, og forberede det til yderligere analyse.I denne undersøgelse, eksogene forbindelser og proteiner leveres i perikardiehulen for at studere deres virkninger på hjertet i voksne zebrafisk. For at validere denne metode udføres to testforsøg ved at indsprøjte farve- og fluorescerende farvestoffer i aflivede fisk. I begge analyser, afslører hele mount analyse mærkning af hele hjertet, herunder hjertekammer, atrium, og bulbus arteriosus.Disse resultater afslører effektiv spredning af injektionsopløsningerne på hjerteoverfladen. For at sammenligne egnetheden af intrathoracic injektion versus intraperitoneal injektion for hjerteundersøgelser, en lignende mængde DAPI injiceres ved hjælp af begge metoder. Hjerterne fastsættes derefter efter enten fem minutter eller 120 minutter.Der observeres ingen DAPI-positive celler i hjerterne efter intraperitoneal injektion på begge tidspunkt. I modsætning hertil resulterer intrathoracic injektioner i overværelse af DAPI-mærket kerner i myokardiet. Disse resultater viser, at intrathoracic injektion forbedrer leveringen af forbindelsen til hjertet, i forhold til den intraperitoneale injektion.For at teste egnetheden af denne metode til hjerteregenerering undersøgelser, hjertekamre er kryoskadede, og derefter injektioner udføres på tre og syv dage efter kryopijury. Både myokardiet og det skadede væv indeholder mange DAPI-positive celler, hvilket indikerer en effektiv indtrængen af dette farvestof i det intakte hjerte og fibrotisk væv. Desuden er injiceret phalloidin AF649 også indarbejdet af kardiomyocytter af peri-skade zone og nogle rekrutteret fibroblaster i det sårede område.Dette eksperiment afslører, at narkotika kan krydse epicardium og trænge ind i den underliggende myokardiet. Efter at have testet effektiviteten af intrathoracic injektioner ved hjælp af farvestoffer, virkningerne af proteiner injiceres på hjertet analyseres. Til dette undersøges virkningerne af det eksogene cytokin på forskellige processer.De biologiske aspekter af kardiomyocyt spredning, ekstracellulære matrix deposition, immuncelle rekruttering, og kardiobeskyttende genekspression aktiveres ved intrathoracic injektion af cytokin. Disse resultater viser, at intrathoracic injektion giver en passende strategi for målrettet levering af proteiner til at studere deres virkninger på forskellige hjertevæv i en række analyser. Indføring af nålen i pericardium er et vigtigt skridt for en vellykket injektion.Formen af nålen, vinklen af penetration, og punktering steder er alle faktorer, der påvirker nålen indsættelse. Efter eller forud intrathoracic injektion, kan man udføre kryoskade for at analysere effekten af injicerede molekyler på hjerte regenerering. Intrathoracic injektion blev brugt i zebrafisk til at studere hjertekonditionering.Et protein kaldet CNTF blev injiceret og har vist sig at forbedre cytoprotective og pro-regenerative programmer i hjertet.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...