Intrathoracale injectie voor de studie van volwassen zebravis hart

In het hartonderzoek naar volwassen zebravissen worden medicamenteuze behandelingen meestal systemisch uitgevoerd. Met intrathoracische injectie kan men lokaal oplossing leveren aan het hart zonder myocardiale schade te veroorzaken. Deze methode maakt de levering van kleine hoeveelheden drugs, eiwitten, of andere moleculen in oplossing precies rond het hart van een volwassen zebravis.

Gebruik om met deze procedure te beginnen een naaldtrekker om met microinjectie aangepaste borosilicaatglas haarvaten te trekken. Bewaar de getrokken haarvaten in een petrischaaltje van negen centimeter met rails van het modelleren van klei of plakband. Met behulp van gemeenschappelijke schaar, snijd een stuk spons, en snijd een vis-achtige silhouet in het midden.

Bereid vervolgens kleine aliquots van de injectieoplossingen met de geteste eiwitten of andere verbindingen. Pas hun concentratie aan afhankelijk van de test door de stof te verdunnen in de evenwichtige zoutoplossing van 1x Hanks, aangevuld met 10% fenolrood. Om de werkconcentratie van verdoving te verkrijgen, voegt u twee tot drie milliliter tricainebestandoplossing toe aan een beker met 100 milliliter viswater.

Zet eerst de stereomicroscoop aan met het licht van de bovenkant en pas de vergroting aan op 16x. Week de spons met viswater, en leg het op een negen centimeter petrischaal op de microscoop. Pas de focus aan en onder de stereomicroscoop gebruik een iridectomieschaar om het uiteinde van een microcapillaire ongeveer zeven millimeter van de basis te snijden, zoals beschreven in figuur 1A van het tekstprotocol.

Plaats de gesneden microcapillaire in de naaldhouder van het microinjectorapparaat. Met behulp van de Microloader tips, laad een controle-oplossing om de druk van de injectie in te stellen om de juiste stroom te verkrijgen, dan leeg de naald. Laad hierna het geselecteerde volume van de injectieoplossing in de punt van de capillaire, zodat er geen luchtbellen zijn.

Gebruik een net om een volwassen vis te vangen, en breng het in de verdovingsoplossing. Na een tot twee minuten, wanneer de vis stopt met zwemmen en de beweging van operculum wordt verminderd, raak de vis met een plastic lepel om ervoor te zorgen dat het niet reageert op enig contact. Breng de vis vervolgens snel en voorzichtig over in de groef van de natte spons, met de ventrale kant naar boven.

Het hoofd van de vis moet wegwijzen van de dominante hand van de exploitant. Let onder de stereomicroscoop zorgvuldig naar de beweging van het kloppende hart onder de huid van de vis. Bepaal visueel het injectiepunt boven het kloppende hart en in het midden van de driehoek, gedefinieerd door de ventrale kraakbeenplaten.

Plaats de punt van de capillaire onder een hoek tussen 30 en 45 graden ten opzichte van de lichaamsas. Dringt voorzichtig de huid binnen met de punt van de microcapillaire in het pericardium. Zodra de naald zich in het pericardium bevindt, drukt u op het pedaal van de microinjector om de injectie te voltooien.

Trek na injectie de capillaire uit de thorax en breng de vis onmiddellijk in een tank met systeemwater voor terugwinning. Controleer de vis tot de totale terugwinning van anesthesie. Om de effecten van injectie te analyseren, verzamelt u het hart op het gewenste tijdstip en bereidt u het voor op verdere analyse.

In deze studie worden exogene verbindingen en eiwitten in de hartholte geleverd om hun effecten op het hart bij volwassen zebravissen te bestuderen. Om deze methode te valideren, worden twee testexperimenten uitgevoerd door kleur en fluorescerende kleurstoffen in geëuthanaseerde vissen te injecteren. In beide testen, hele-mount analyse onthult etikettering van het hele hart met inbegrip van de ventrikel, het atrium, en de bulbus arteriosus.

Deze resultaten laten een efficiënte verspreiding van de injectieoplossingen op het hartoppervlak zien. Om de geschiktheid van intrathoracische injectie ten opzichte van intraperitoneale injectie voor hartstudies te vergelijken, wordt een vergelijkbare hoeveelheid DAPI geïnjecteerd met behulp van beide methoden. De harten worden dan na vijf minuten of 120 minuten bevestigd.

Er worden geen DAPI-positieve cellen waargenomen in de harten na intraperitoneale injectie op beide tijdspunten. De intrathoracische injecties daarentegen resulteren in de aanwezigheid van DAPI-gelabelde kernen in het myocardium. Deze resultaten tonen aan dat de intrathoracische injectie de levering van de verbinding naar het hart verbetert, in vergelijking met de intraperitoneale injectie.

Om de geschiktheid van deze methode voor hartregeneratiestudies te testen, worden ventrikels cryoinjured, en vervolgens worden injecties uitgevoerd bij drie en zeven dagen na cryoinjury. Zowel het myocardium als het gewonde weefsel bevatten tal van DAPI-positieve cellen, wat wijst op een efficiënte penetratie van deze kleurstof in het intacte hart en fibrotisch weefsel. Bovendien, geïnjecteerd phalloidin AF649 is ook opgenomen door cardiomyocyten van de peri-letsel zone en een aantal gerekruteerde fibroblasten van het gewonde gebied.

Dit experiment laat zien dat de medicijnen het epicardium kunnen oversteken en doordringen in het onderliggende myocardium. Na het testen van de efficiëntie van intrathoracische injecties met behulp van kleurstoffen, worden de effecten van eiwitten geïnjecteerd op het hart geanalyseerd. Hiervoor wordt de effecten van de exogene cytokine op verschillende processen onderzocht.

De biologische aspecten van cardiomyocyte proliferatie, extracellulaire matrixdepositie, immuuncel werving, en cardioprotectieve genexpressie worden geactiveerd door intrathoracale injectie van cytokine. Deze resultaten tonen aan dat intrathoracische injectie een geschikte strategie biedt voor gerichte levering van eiwitten om hun effecten op verschillende hartweefsels in verschillende tests te bestuderen. Het inbrengen van de naald in het pericardium is een belangrijke stap voor een succesvolle injectie.

De vorm van de naald, de hoek van penetratie, en de punctie plaatsen zijn allemaal factoren die de naald inbrengen beïnvloeden. Na of voorafgaand aan intrathoracische injectie, kan men cryoinjury uitvoeren om het effect van geïnjecteerde moleculen op hartregeneratie te analyseren. Intrathoracische injectie werd gebruikt bij zebravissen om cardiale conditionering te bestuderen.

Een eiwit genaamd CNTF werd geïnjecteerd en is aangetoond dat cytoprotectieve en pro-regeneratieve programma's in het hart te verbeteren.