वयस्क Zebrafish दिल के अध्ययन के लिए अंतर्वक्षीय इंजेक्शन

वयस्क जेब्राफिश पर कार्डियक रिसर्च में आमतौर पर ड्रग ट्रीटमेंट सिस्टमिक तरीके से किए जाते हैं। इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन के साथ, कोई भी स्थानीय रूप से मायोकार्डियल क्षति के कारण बिना दिल को समाधान प्रदान कर सकता है। यह विधि वयस्क जेब्राफिश के दिल के चारों ओर समाधान में दवाओं, प्रोटीन या अन्य अणुओं की छोटी मात्रा की डिलीवरी की अनुमति देती है।

इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, माइक्रोइंजेक्शन-अनुकूलित बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं को खींचने के लिए सुई खींचने वाले का उपयोग करें। मॉडलिंग मिट्टी या चिपकने वाला टेप की पटरियों के साथ एक नौ सेंटीमीटर पेट्री डिश में खींचा केशिकाओं की दुकान । आम कैंची का उपयोग करना, स्पंज का एक टुकड़ा काट, और इसके बीच में एक मछली की तरह सिल्हूट उत्कीर्ण ।

इसके बाद, परीक्षण किए गए प्रोटीन या अन्य यौगिकों के साथ इंजेक्शन समाधानों के छोटे एलिकोट्स तैयार करें। 10% फेनोल लाल रंग के साथ पूरित 1x हैंक्स संतुलित नमक समाधान में पदार्थ को पतला करके परख के आधार पर उनकी एकाग्रता को समायोजित करें। एनेस्थेटिक्स की कामकाजी एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, मछली के पानी के 100 मिलीलीटर वाले बीकर में ट्राइकेन स्टॉक समाधान के दो से तीन मिलीलीटर जोड़ें।

सबसे पहले, ऊपर से प्रकाश के साथ स्टीरियो माइक्रोस्कोप चालू करें, और आवर्धन को 16x में समायोजित करें। स्पंज को मछली के पानी से भिगोकर माइक्रोस्कोप पर नौ सेंटीमीटर पेट्री डिश पर रखें। फोकस को समायोजित करें, और स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, पाठ प्रोटोकॉल के चित्र 1 ए में विस्तृत रूप से आधार से लगभग सात मिलीमीटर माइक्रोकैपिलरी के अंत को काटने के लिए इरिडेक्टॉमी कैंची का उपयोग करें।

माइक्रोइंजेक्टर उपकरण के सुई धारक में कट माइक्रोकैपिलरी डालें। माइक्रोलोडर युक्तियों का उपयोग करके, उचित प्रवाह प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन के दबाव को स्थापित करने के लिए एक नियंत्रण समाधान लोड करें, फिर सुई खाली करें। इसके बाद, इंजेक्शन समाधान की चयनित मात्रा को केशिका की नोक में लोड करें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि हवा के बुलबुले नहीं हैं।

एक वयस्क मछली को पकड़ने के लिए एक जाल का उपयोग करें, और इसे संवेदनाहारी समाधान में स्थानांतरित करें। एक से दो मिनट के बाद, जब मछली तैराकी बंद कर देती है और ऑपरकुलम का आंदोलन कम हो जाता है, तो मछली को प्लास्टिक के चम्मच से स्पर्श करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह किसी भी संपर्क पर प्रतिक्रिया नहीं करता है। इसके बाद, वेंट्रल साइड अप के साथ, जल्दी और सावधानी से मछली को गीले स्पंज के नाली में स्थानांतरित करें।

मछली के सिर ऑपरेटर के प्रमुख हाथ से दूर बात करनी चाहिए । स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, मछली की त्वचा के नीचे धड़कन दिल के आंदोलन को ध्यान से देखें। नेत्रहीन धड़कन दिल के ऊपर और त्रिकोण के बीच में इंजेक्शन बिंदु निर्धारित करते हैं, वेंट्रल कार्टिलाजिनस प्लेटों द्वारा परिभाषित।

शरीर की धुरी के सापेक्ष 30 और 45 डिग्री के बीच एक कोण पर केशिका की नोक डालें। धीरे-धीरे त्वचा को पेरिकार्डियम में माइक्रोकैपिलरी की नोक के साथ प्रवेश करें। एक बार सुई पेरिकार्डियम के अंदर हो जाने के बाद इंजेक्शन को पूरा करने के लिए माइक्रोइंजेक्टर डिवाइस के पेडल को दबाएं।

इंजेक्शन के बाद, धीरे-धीरे छाती से केशिका वापस लें, और तुरंत मछली को वसूली के लिए सिस्टम पानी के साथ एक टैंक में स्थानांतरित करें। संज्ञाहरण से कुल वसूली तक मछली की निगरानी करें। इंजेक्शन के प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए, वांछित समय बिंदु पर दिल इकट्ठा करें, और इसे आगे के विश्लेषण के लिए तैयार करें।

इस अध्ययन में, वयस्क जेब्राफिश में दिल पर उनके प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक्सोजेनस यौगिकों और प्रोटीन को पेरिकार्डियल गुहा में वितरित किया जाता है। इस विधि को मान्य करने के लिए, दो परीक्षण प्रयोग रंग और फ्लोरोसेंट रंगों को इच्छामृत्यु युक्त मछली में इंजेक्ट करके किए जाते हैं। दोनों परख में, पूरे माउंट विश्लेषण वेंट्रिकल, एट्रियम, और बल्बस आर्टेरियोसस सहित पूरे दिल की लेबलिंग का पता चलता है।

इन परिणामों से दिल की सतह पर इंजेक्शन समाधानों के कुशल प्रसार का पता चलता है। दिल के अध्ययन के लिए इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन बनाम इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन की उपयुक्तता की तुलना करने के लिए, दोनों तरीकों का उपयोग करके दापी की एक समान मात्रा इंजेक्ट की जाती है। इसके बाद दिल ों को या तो पांच मिनट या १२० मिनट के बाद तय किया जाता है ।

किसी भी समय बिंदु पर इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के बाद दिलों में कोई DAPI-सकारात्मक कोशिकाएं नहीं देखी जाती हैं। इसके विपरीत, इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन के परिणामस्वरूप मायोकार्डियम में डीएपीआई-लेबल वाले नाभिक की उपस्थिति हुई। इन परिणामों से पता चलता है कि इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन की तुलना में दिल में यौगिक की डिलीवरी में सुधार करता है।

हृदय उत्थान अध्ययन के लिए इस विधि की उपयुक्तता का परीक्षण करने के लिए, वेंट्रिकल्स क्रायोइंज घायल होते हैं, और फिर क्रायोइंजी के बाद तीन और सात दिनों में इंजेक्शन किए जाते हैं। मायोकार्डियम और घायल ऊतक दोनों में कई DAPI-सकारात्मक कोशिकाएं होती हैं, जो इस डाई के एक कुशल प्रवेश को बरकरार दिल और फाइब्रोटिक ऊतक में दर्शाती हैं। इसके अलावा, इंजेक्शन फालोइडिन AF649 को पेरी-इंजरी जोन के कार्डियोमायोसाइट्स और घायल क्षेत्र के कुछ भर्ती फाइब्रोब्लास्ट द्वारा भी शामिल किया गया है।

इस प्रयोग से पता चलता है कि दवाएं एपिकार्डियम को पार कर सकती हैं और अंतर्निहित मायोकार्डियम में प्रवेश कर सकती हैं। रंगों का उपयोग कर इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन की दक्षता का परीक्षण करने के बाद, दिल पर इंजेक्शन प्रोटीन के प्रभाव का विश्लेषण किया जाता है। इसके लिए विभिन्न प्रक्रियाओं पर एक्सोजेनस साइटोकिन के प्रभावों की जांच की जाती है।

कार्डियोमायोसाइट प्रसार, एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स जमाव, प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती, और कार्डियोप्रोटेक्टिव जीन अभिव्यक्ति के जैविक पहलुओं को साइटोकिन के इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन द्वारा सक्रिय किया जाता है। इन परिणामों से पता चलता है कि इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन विभिन्न प्रकार के परखों में अलग-अलग हृदय ऊतकों पर उनके प्रभावों का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन के लक्षित वितरण के लिए एक उपयुक्त रणनीति प्रदान करता है। पेरिकार्डियम में सुई का सम्मिलन एक सफल इंजेक्शन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।

सुई का आकार, प्रवेश का कोण, और पंचर साइटें सभी कारक हैं जो सुई प्रविष्टि को प्रभावित करते हैं। इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन के बाद या उससे पहले, हृदय उत्थान पर इंजेक्शन अणुओं के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए कोई क्रायोइंजन घायल हो सकता है। कार्डियक प्रीकंडीशनिंग का अध्ययन करने के लिए जेब्राफिश में इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन का उपयोग किया गया था।

सीएनटीएफ नामक एक प्रोटीन को इंजेक्ट किया गया था और इसे दिल में साइटोप्रोटेक्टिव और प्रो-रिजेनरेटिव प्रोग्राम्स को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है ।