Name: intrathoracic injection for the study of adult zebrafish heart
Uploaded: 2019-05-14T15:00:00
Duration: 7 min 22 s
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Ringraziamo V. Zimmermann per l'eccellente assistenza tecnica e per la cura del pesce, D. König (Università di Friburgo) per la lettura critica del manoscritto, D. Kressler (Università di Friburgo) per l'aiuto con la sintesi proteica zCNTF, F. Ruggiero (Institut de génomique Fonctionnelle de Lyon) per aver fornito l'anticorpo ColXII, e P. Martin (Università di Bristol) per l'anticorpo L-Plastin. Ringraziamo l'impianto di Imaging Core e la piattaforma di proteomica dell'Università di Friburgo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale Svizzera per la scienza, Grant Number 310030_179213, e dalla Schweizerische Herzstiftung (Swiss Heart Foundation).

La cura degli animali e tutte le procedure animali descritte nel seguente protocollo sono state approvate dall'ufficio veterinario cantonale di Friburgo, in Svizzera.
1. strumenti e soluzioni per iniezioni
<ol><li>Tirare capillari di vetro borosilicato adattato microiniezione utilizzando un estrattore di aghi secondo la Figura 1a. Conservare i capillari estratti in una piastra di Petri da 9 cm con rotaie di argilla modellante o nastro adesivo.</li>
	<li>Utilizzando le forbici comuni, tagliare un pezzo di spugna (7 cm x 3 cm x 1 cm) e intagliare una silhouette simile a un pesce nel suo mezzo.</li>
	<li>Preparare piccole aliquote di soluzione iniettabile con le proteine testate o altri composti. Regolare la loro concentrazione in modo dipendente sul saggio diluendo la sostanza in 1x soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) completata con il 10% di rosso fenolo. Nota: Qui, la concentrazione della proteina testata era 100 ng/mL.</li>
	<li>Per preparare una soluzione di stock di anestetici tricaina tamponata, sciogliere 4 g di tricaina in 980 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7,0 − 7,4 utilizzando 1 M Tris-HCl pH 9 e riempire con acqua fino a 1.000 mL. Conservare la soluzione al buio a 4 ° c.</li>
	<li>Per ottenere la concentrazione di lavoro di anestetici, aggiungere 1 − 2 mL di soluzione di stock di tricaina in 50 mL di acqua di pesce in un beaker. Nota: La concentrazione di lavoro di anestetici tricaina deve essere preparata appena prima dell'uso.</li>
</ol>2. preparazione della stazione di iniezione
<ol><li>Accendere lo stereomicroscopio con la luce dalla parte superiore e regolare l'ingrandimento a 16x.</li>
	<li>Immergere la spugna con acqua di pesce, posizionarla su una piastra di Petri da 9 cm sulla fase del microscopio e regolare la messa a fuoco.</li>
	<li>Sotto lo stereomicroscopio, tagliare l'estremità di un microcapillare a ~ 7 mm dalla base utilizzando una forbici iridectomia come mostrato nella Figura 1a. Il diametro della punta ideale sarebbe ~ 20 μm. Nota: Tagliare la punta del capillare in modo obliquo è ottimale per inserimenti nel tessuto.</li>
	<li>Inserire il microcapillare nel supporto dell'ago dell'apparato microiniettore.</li>
	<li>Utilizzando punte microloader, caricare una soluzione di controllo (ad esempio, 1x HBSS) per impostare la pressione di iniezione, al fine di ottenere il flusso appropriato compreso tra 0,3 μL/s e 0,5 μL/s. svuotare l'ago.</li>
	<li>Caricare il volume selezionato della soluzione iniettabile (ad esempio, fattore neurotrofico ciliare [CNTF] diluito in 1x HBSS) nella punta del capillare (Figura 1B). Non dovrebbe esserci una bolla d'aria nel capillare. Nota: Il volume massimo di soluzione iniettabile dipende dalla dimensione del pesce. Per una lunghezza standard di 2,5 − 3 cm (distanza dal muso al peduncolo caudale), il volume massimo di iniezione che previene il gonfiore e il sanguinamento toracico esessivo è stato determinato a 5 μL (Figura 1F). Volumi più grandi potrebbero essere iniettati a pesci più grandi.</li>
</ol>3. preparazione del pesce per l'iniezione intrathoracic
<ol><li>Prendere un pesce zebra adulto (Danio rerio) con una rete e trasferirlo nella soluzione anestetico.</li>
	<li>Dopo 1 − 2 min, quando il pesce smette di nuotare e il movimento dell'opercolo è ridotto, toccare il pesce con un cucchiaio di plastica per assicurarsi che non reagisca a qualsiasi contatto.</li>
	<li>Trasferire rapidamente e con cautela il pesce con il cucchiaio nella scanalatura della spugna bagnata, con il lato ventrale verso l'alto. La testa del pesce dovrebbe puntare lontano dalla mano dominante dell'operatore.</li>
</ol>4. microiniezione nel pericardio
<ol><li>Sotto lo stereomicroscopio, osservare attentamente il movimento del cuore pulsante sotto la pelle del pesce. Determinare visivamente il punto di iniezione sopra il cuore pulsante e al centro del triangolo definito dalle piastre cartilaginose ventrale (Figura 1D). Inserire la punta del capillare a un angolo di 30 − 45 ° rispetto all'asse del corpo (Figura 1e). Penetrare delicatamente la pelle con la punta del microcapillare nel pericardio (Figura 1C). Un punto di ingresso ottimale è più vicino all'addome che alla testa. Nota: Non inserire il capillare troppo profondamente nel corpo e nel cuore, in quanto ciò causerà lesioni all'organo. In caso di puntura cardiaca, l'ago generalmente si riempie di sangue. In questo caso, rimuovere il capillare ed escludere il pesce dall'esperimento.</li>
	<li>Una volta che l'ago è all'interno del pericardio, iniezione completa premendo il pedale del dispositivo microiniettore. Nota: Fare attenzione a non iniettare aria nella cavità toracica.</li>
	<li>Dopo l'iniezione, prelevare delicatamente il capillare dal torace e trasferire immediatamente il pesce in un serbatoio con acqua di sistema per il recupero.</li>
	<li>Monitorare il pesce fino al recupero totale dall'anestesia.</li>
	<li>Raccogliere il cuore al punto di tempo desiderato e prepararlo per ulteriori analisi. Nota: Nel caso in cui il pesce non riprende il movimento dell'opercolo entro 30 s, rianimare il pesce schiacciando l'acqua nelle branchie con una pipetta di plastica.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, descriviamo un metodo per la consegna di composti esogeni e proteine nella cavità pericardica al fine di studiare i loro effetti sul cuore in zebrafish adulto. La procedura si basa su iniezione intratoracica, che si traduce nella consegna di un piccolo volume di soluzione in prossimità dell'organo. Questa tecnica è stata sviluppata e descritta per studiare il precondizionamento cardiaco e la rigenerazione.
Il passo critico in questa procedura è la penetrazione del capillare di vetro nella cavità toracica. Questo passaggio dipende da tre parametri che sono: la rigidità e la nitidezza della punta capillare, l'angolo di penetrazione e il sito di puntura. Per ottimizzare la penetrazione attraverso la pelle, la parte estratta del capillare non deve essere troppo lunga, poiché tali aghi sono troppo flessibili e si piegano a contatto con la pelle. Per evitare questo, la rigidità può essere adattata riducendo la dimensione della punta con l'iridectomia Scissor. Anche se l'angolo di penetrazione può variare tra 30 ° e 45 °, può essere adattato alla rigidità della punta. Infatti, una punta sottile penetrerà la pelle meglio con un angolo più stretto.
Al fine di ottimizzare la penetrazione dell'ago, il sito di inserimento deve essere immediatamente sopra il cuore pulsante. Il rischio di puntura cardiaca è solitamente basso compreso tra il 5% e l'8%. L'inserimento dell'ago posteriore al cuore aumenta il rischio di puntura cardiaca, come visto da un aumento del sanguinamento. In questi casi, gli animali devono essere rimossi dagli esperimenti.
Un'altra fonte di problemi durante l'iniezione IT si verifica a livello capillare. Infatti il capillare può rompersi quando le forze laterali sono esercitate su di esso. Per evitare questo, l'ago deve muoversi lungo l'asse di iniezione in modo rettilineo. Occasionalmente, il capillare può essere bloccato da residui di tessuto che impediscono il flusso del liquido. L'ago può essere sbloccato ritirando delicatamente la punta mentre si inietta. Se questo non migliora il flusso, si consiglia di ritirare completamente l'ago dal torace e di sostituire l'ago.
Le lesioni possono essere causate da un ago troppo profondamente inserito nel pericardio. Al fine di evitare lesioni nel sacco pericardico, l'ago non deve essere inserito troppo (1 − 2 mm) nel torace. Alcune perdite sono state osservate quando il volume di iniezione era superiore a 8 μL.
Nel pesce zebra, la composizione esatta del fluido pericardico è sconosciuta. Tuttavia, il volume della cavità pericardico è stimato a ~ 10 μL31. Dato che il volume del ventricolo pesce zebra adulto è di circa 1 − 2 mm3, supponiamo che la cavità pericardica abbia di conseguenza un volume minuscolo, che deve essere considerato prima delle iniezioni. Dai nostri studi preliminari, abbiamo stabilito che la gamma ottimale del volume iniettato è compresa tra 0,5 e 3 μL per i pesci che misurano 2,5 − 2,8 cm (distanza dal muso al peduncolo caudale). Questo volume può essere adattato a seconda delle dimensioni del pesce. L'iniezione fino a 5 μL non ha indotto alcuna lesione nei pesci di queste dimensioni. Tuttavia, i volumi da 8 μL sono stati sufficienti a causare rigonfiamento e sanguinamento interno come mostrato nella Figura 1F. Sulla base di questi dati, stimiamo che una quantità di soluzione superiore a 3 μL possa causare stress fisico e fisiologico sull'organo. Questa limitazione deduce la necessità di scegliere una maggiore concentrazione di molecole invece di aumentare la quantità della soluzione iniettata.
Un altro fattore importante è la proprietà osmotica della soluzione iniettata, che dovrebbe essere nella gamma fisiologica. In effetti, per evitare il rischio di stress osmotico, raccomandiamo l'HBSS come mezzo di iniezione.
In zebrafish, i metodi comuni utilizzati per consegnare i farmaci sono attraverso il trattamento delle acque e l'iniezione intraperitoneale30,35. Anche se entrambe queste tecniche sono adatte per molte applicazioni, le iniezioni IT forniscono vantaggi sperimentali ed economici, diminuendo i rischi di effetti collaterali sistemici indesiderati e riducendo l'uso di molecole costose, rispettivamente. Questo metodo può essere adatto per la consegna di tamoxifene per attivare il sistema transgenico cre-ERT2 utilizzato per l'analisi di lignaggio delle cellule, e guidare RNA modificati per gli studi funzionali nella ricerca di rigenerazione.
Il metodo di iniezione it in pesce zebra è stato precedentemente descritto31,36. In tali segnalazioni, le iniezioni intratoraciche sono state eseguite con ago di insulina, perforando dal lato anteriore. Al contrario, il nostro protocollo presenta una strategia alternativa con il capillare di vetro tirato inserito dalla direzione posteriore. In particolare, il nostro approccio prende in considerazione l'anatomia del pericardio del pesce per ottimizzare l'iniezione con un rischio ridotto di puntura cardiaca. Inoltre, durante la procedura, il pesce non è detenuto da pinze metalliche, ma da una spugna umida e morbida, che è un metodo più adatto per evitare qualsiasi lesione esterna del pesce. Così, il metodo presentato potrebbe essere più adatto per gli studi di omeostasi cardiaca, precondizionamento e rigenerazione in adulti zebrafish.
Le iniezioni IT sono già state stabilite in organismi modello di mammiferi. Infatti, questo metodo è stato applicato anche in esperimenti con suini e studi clinici in esseri umani37,38. In topi, iniezioni intramiocardica transtoracico guidate da ultrasuoni sono stati utilizzati per sfidare il loro cuore39. All'interno di questo articolo proponiamo un protocollo dettagliato per facilitare l'uso dell'iniezione IT per il pesce zebra. Questo sarà particolarmente prezioso per il settore, al fine di integrare gli approcci genetici nell'omeostasi cardiaca, nella ricerca di precondizionamento e rigenerazione.

Tra i vertebrati, i pesce zebra possiedono una notevole capacità di rigenerare i loro cuori1,2. Questa capacità è stata riportata in diversi modelli di lesione, vale a dire resezione dell'apice ventricolare, criolesione (ci) e ablazione genetica dei cardiomiociti3,4,5,6,7. Dopo le ferite invasive, la parete danneggiata del ventricolo viene guarita transitoriamente dal tessuto fibrotico, che viene progressivamente sostituito da un nuovo miocardio8,9,10,11. La risposta di guarigione precoce della ferita comporta l'attivazione di epicardio e il reclutamento di cellule immunitarie12,13,14,15. In concomitanza, i cardiomiociti vicino al miocardio ferito si attivano, dedifferenziano, proliferano e sostituiscono progressivamente l'area ferita entro 30 − 90 giorni16,17,18, 19. progressi sostanziali nella decifratura dei meccanismi molecolari e cellulari della rigenerazione cardiaca sono stati raggiunti grazie alla disponibilità di strumenti genetici, come l'analisi di tracciatura delle cellule, l'iperespressione genica inducibile, linee reporter di tessuto fluorescente e mutagenesi genica CRISPR/Cas920,21.
Abbiamo recentemente istituito un modello di precondizionamento cardiaco nel pesce zebra adulto di toracotomia22,23. Il precondizionamento accresce l'espressione dei geni cardioprotettivi ed elesse il rientro nel ciclo cellulare nei cuori integri e rigeneranti. Questi processi sono associati all'assunzione di cellule immunitarie e al rimodellamento delle matrici22,24. I meccanismi di precondizionamento sono scarsamente compresi e la creazione di nuove tecniche è necessaria per promuovere questo settore della ricerca. In particolare, la somministrazione ottimizzata di proteine di segnalazione seccato o di altri composti chimici è essenziale per indagare ulteriormente su questo argomento.
Essendo animali acquatici, il pesce zebra può naturalmente assorbire varie sostanze disciolte in acqua attraverso le loro branchie e la pelle. Questo offre la possibilità per la consegna di farmaci non invasivi attraverso l'immersione del pesce in soluzioni con diverse sostanze chimiche, come gli inibitori farmacologici, ormoni steroidei, tamoxifene, BrdU e antibiotici. Infatti, numerosi studi di vari laboratori, tra cui25,26,27, hanno approfittato di questo metodo, che è particolarmente prezioso nel campo della biologia rigenerativa6, 28. questo approccio non è tuttavia appropriato per la consegna di peptidi, DNA, RNA, morfololinos o molecole con una limitata permeabilità tissutale. In questi casi, una consegna più efficiente è ottenuta mediante microiniezione nel corpo, ad esempio inserendo il capillare nel seno venoso retro-orbitale, nella cavità intraperitoneale o intrapericardiale29,30, al 31. Qui, descriviamo una procedura di iniezione intratoracica di una piccola quantità di soluzione, come metodo adatto per studiare la rigenerazione del cuore e il precondizionamento nel pesce zebra adulto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco by Life technology</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macroscope (binocular)</td>
			<td>M400</td>
			<td></td>
			<td>with Apozoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injector femtojet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247 0034 77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloaders femtotips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242 956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette glass needles type C</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-6</td>
			<td>thin-wall capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller model P-87</td>
			<td>Flaming/Brown</td>
			<td>20081016</td>
			<td>filament box 2.5 x 4.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td>any</td>
			<td>any</td>
			<td>dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Anestethic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes and Antibodies</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Chicken Cy5</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Guinea pig Cy5</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit Cy5</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken l-plastin</td>
			<td>gift from P. Martin, Bristol</td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1 / 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Concentration: 1 / 2000 (1&#181;g/ml); 1/100 IT injected</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-ColXII</td>
			<td>gift from Florence Ruggerio, Lyon</td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Atto-565 (F-actin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94072</td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Atto-647 (F-actin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95906</td>
			<td>Concentration: 1 / 50 IT injected</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-MCM5</td>
			<td>gift from Soojin Ryu, Heidelberg</td>
			<td></td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stamping Ink 4K</td>
			<td>Pelikan</td>
			<td>1 4k 351 197</td>
			<td>Concentration: 1 / 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISH probe primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystatin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gene number: ENSDARG00000074425 
			&#8203;fw primer: GATTCACTGTCGGGTTTGGG 
			Rev primer: ATTGGGTCCATGGTGACCTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intrathoracic injection for the study of adult zebrafish heart

Il cuore pesce zebra adulto fornisce un modello potente nella ricerca di rigenerazione cardiaca. Anche se la forza di questo sistema si basa su approcci transgenici, una rapida consegna di fattori esogeni fornisce una tecnica complementare negli studi funzionali. Qui, presentiamo un metodo che si basa sulla somministrazione di pochi microlitri di soluzione nella cavità pericardica senza causare danni al miocardio. Le iniezioni intratoraciche possono consegnare efficacemente proteine e composti chimici direttamente sulla superficie cardiaca. Le sostanze iniettate diffondono attraverso l'epicardio nei tessuti cardiaci sottostanti. Rispetto alle iniezioni intraperitoneali (IP), il principale vantaggio delle iniezioni intratoraciche è la somministrazione focale dei fattori testati sull'organo bersaglio. La consegna di molecole direttamente nel pericardio è una strategia adatta per gli studi di precondizionamento cardiaco e rigenerazione nel pesce zebra adulto.

Dopo iniezioni intratoracica (it), gli effetti della soluzione esogena possono essere analizzati. A tale scopo, il pesce deve essere eutanizzato e i cuori raccolti, fissi e istologicamente elaborati, secondo i protocolli pubblicati in precedenza32,33.
Per convalidare il metodo, abbiamo prima eseguito due esperimenti di test iniettando colori e coloranti fluorescenti. In primo luogo, abbiamo eutanizzato pesce e post-mortem iniettato 3 μL di inchiostro nel torace. I cuori sono stati raccolti dopo 5 minuti, lavati in soluzione salina tampone fosfato (PBS), fissato in 2% formalina, lavato in PBS e fotografato al microscopio. In secondo luogo, abbiamo iniettato 3 μL di 1 μg/mL 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in vivo e fissato il cuore dopo 2 h. In entrambi i saggi, l'analisi di montaggio completo ha rivelato l'etichettatura di tutto il cuore compreso il ventricolo, l'atrio e l'arterioso del bulbo (Figura 2a, B). Questi risultati rivelano una diffusione efficiente della soluzione iniettata sulla superficie cardiaca.
Un protocollo comune per la consegna di sostanze esogene nel pesce adulto è l'iniezione intraperitoneale (IP). Per confrontare l'idoneità delle iniezioni di IT versus IP per gli studi cardiaci, abbiamo iniettato una quantità simile di DAPI utilizzando entrambi i metodi e fissato i cuori dopo 5 min e 120 min (Figura 3A). I cuori sono stati sezionati e macchiati con Phalloidin Alexa Fluor (AF) 568 che etichetta F-actina nel muscolo cardiaco. Non sono state osservate cellule DAPI positive nei cuori dopo l'iniezione IP in entrambi i punti temporali (Figura 3B). Al contrario, l'iniezione di IT ha provocato la presenza di nuclei etichettati con DAPI nel miocardio (Figura 3B). Questi risultati dimostrano che l'iniezione di IT ha migliorato la consegna del composto al cuore, rispetto all'iniezione IP.
Per testare l'idoneità di questo metodo per gli studi di rigenerazione cardiaca, abbiamo crioferiti ventricoli8, ed eseguito iniezioni di it di 3 μL di 1 μg/ml DAPI e 1 μg/ml Phalloidin AF649 a 3 e 7 giorni post-crioinfortunio (DPCI) (Figura 4a). A 1 h post-iniezione, i cuori sono stati raccolti, fissi, sezionati e macchiati con Phalloidin AF568 per visualizzare il miocardio intatto. Abbiamo scoperto che sia il miocardio che il tessuto ferito contenevano numerose cellule positive DAPI, indicando una penetrazione efficiente di questo colorante nel cuore intatto e nel tessuto fibrotico (Figura 4B). Inoltre, l'iniezione di Phalloidin AF649 è stata anche incorporata dai cardiomiociti della zona peri-infortunio e da alcuni fibroblasti reclutati nell'area ferita. Questo esperimento rivela che i farmaci possono attraversare l'epicardio e penetrare nel miocardio sottostante.
Dopo aver testato l'efficienza delle iniezioni IT utilizzando coloranti, abbiamo analizzato gli effetti delle proteine iniettate sul cuore. Abbiamo sintetizzato una citochina, chiamato CNTF, che è upregulate dopo toracotomia24. Abbiamo studiato gli effetti del CNTF esogeno su vari processi, vale a dire la proliferazione dei cardiomiociti, la deposizione della matrice extracellulare, il reclutamento delle cellule immunitarie e l'espressione genica cardioprotettiva. Abbiamo scoperto che tutti questi aspetti biologici sono stati attivati dall'iniezione IT di CNTF, rispetto alle immunoglobuline di controllo (Figura 5)24. Questi risultati dimostrano che il metodo di iniezione intratoracica fornisce una strategia adeguata per la consegna mirata di proteine per studiare i loro effetti su tessuti cardiaci distinti in una varietà di saggi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59724/59724fig1.jpg"> Figura 1: iniezione Intrathorascica (it) nel pesce zebra adulto. A) fotografia di un capillare di microiniezione tirato con filamento (6 ", 1,0 mm di diametro) e valori del programma di estrazione dell'ago utilizzato. B) fotografia di un capillare di microiniezione tirato con filamento (6 ", 1,0 mm di diametro) riempito con 2,5 μl di soluzione contenente il 10% di rosso fenolo. La punta estratta dell'ago è massima di 7 mm di lunghezza. C) rappresentazione schematica della procedura di iniezione it. D) fotografie della procedura di iniezione it. Questa cifra è stata modificata da Bise et al.24. I numeri nei pannelli C e D corrispondono alle stesse fasi della procedura: (1) il pesce viene posto ventrale verso l'alto su una spugna umidificata. Il sito di puntura (punto rosso nel triangolo) si trova al centro del torace vicino alle branchie. (2) penetrazione dell'ago nel pericardio. Punto rosso indica sito di puntura. (3) l'iniezione è monitorata osservando la diffusione della soluzione rossa nella cavità pericardico. (E) schema di iniezione di esso. Angolo tra il capillare di iniezione e l'asse del corpo dovrebbe essere tra 30 ° e 45 ° per evitare la puntura del cuore. F) fotografie del torace di pesce a 1 ora dopo l'iniezione di it di volumi indicati. Le frecce bianche puntano al tessuto ripiatto, che potrebbe indicare un sanguinamento interno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59724/59724fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59724/59724fig2.jpg"> Figura 2: le soluzioni IT iniettate si diffondono quasi uniformemente sulla superficie cardiaca. A) immagini stereomicroscopio di cuori interi di pesci sottoposti a iniezione di it post mortem con 2,5 ΜL di hbss o 2,5 μl di inchiostro. Inchiostro macchiato la superficie del ventricolo (V), atrio (A) e bulbo arterioso (BA). Barra di scala = 300 μm.B) immagini di Stereomicroscopio a campo e fluorescente di cuori interi di pesci sottoposti ad iniezione di it con HBSS e 3 ΜL di DAPI da 1 μg/ml. La fluorescenza DAPI viene rilevata sulle parti cardiache subito dopo l'iniezione di IT. Barra di scala = 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59724/59724fig2large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59724/59724fig3.jpg"> Figura 3: confronto di due metodi di iniezione per la consegna di DAPI al cuore. A) schema del progetto sperimentale. Le iniezioni intraperitoneali (IP) e Intrathorascic (IT) sono state eseguite con la stessa quantità di 1 μg/mL di DAPI (3 μL). I cuori sono stati raccolti a 5 e 120 minuti dopo l'iniezione. B) immagini di microscopia confocale di sezioni cardiache macchiate con Phalloidin fluorescente (rosso) che etichettare abbondantemente le fibre muscolari. DAPI iniettato è stato visualizzato nel canale appropriato mostrato in verde. Dopo l'iniezione IP, DAPI non viene rilevata nel cuore in qualsiasi punto temporale. Dopo l'iniezione di IT, le cellule positive di DAPI sono presenti nel ventricolo dopo entrambi i punti temporali. Barra di scala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59724/59724fig3large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59724/59724fig4.jpg"> Figura 4: iniezione it per studiare la rigenerazione cardiaca. A) schema del progetto sperimentale. A 3 e 7 giorni dopo la criolesione, è stata iniettata una miscela di DAPI e Phalloidin AF649 (3 μL di 1 μg/mL). I cuori sono stati raccolti 1 ora dopo l'iniezione di IT, fisso, sezionato e macchiato con Phalloidin AF568 (rosso). B) immagini di microscopia confocale di sezioni cardiache longitudinali a 3 e 7 DPCI. DAPI iniettato (verde) e Phalloidin AF649 (blu) etichette delle celle dell'area lesa (delimitate da una linea tratteggiata bianca) e del miocardio intatto (colorazione rossa). Le frecce bianche puntano alla distribuzione DAPI (verde) attraverso la miocardia compatta e trabecolata intatta e l'epicardio. Barra di scala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59724/59724fig4large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59724/59724fig5.jpg"> Figura 5: il CNTF esogeno a iniezione it stimola diversi processi biologici nel cuore. A) schema del progetto sperimentale. In primo luogo, 2,5 μl di una soluzione contenente 250 ng di CNTF di pesce zebra o immunoglobuline di controllo (hIgG) è stata iniettata nel pericardio di pesci transgenici che esprimono DsRed2 nucleari in cardiomiociti. I cuori sono stati raccolti a 7 e 1 giorni dopo l'iniezione (dpi) e analizzati da immunofluorescenza e in situ ibridazione, rispettivamente. (B-D) Immagini di microscopia confocale di sezioni ventricolari di controllo e cuori iniettati CNTF. B) immunostaining contro un marcatore di ciclo cellulare, componente complesso di manutenzione minichromosoma 5 (MCM5; verde), rivela un numero più elevato di cardiomiociti proliferanti in risposta al CNTF esogeno. Barra di scala = 500 μm.c) immunostaining contro il collagene XII Mostra un aumento della deposizione di collagene XII nel miocardio dopo l'iniezione di CNTF. Nel cuore di controllo, il collagene XII è confinato all'epicardio34. Barra di scala = 500 μm. (D) immunostaining contro un marcatore di cellule immunitarie, L-Plastina, rileva un aumento del reclutamento di cellule immunitarie nel pesce iniettato CNTF. Barra di scala = 500 μm. (E) immagini di microscopio a campo luminoso di sezioni trasversali ventricolari dopo ibridazione in situ utilizzando una sonda mRNA antisenso contro la cistatina, un fattore cardioprotettivo, Mostra l'upregulation trascrizionale di questo gene nel cuore di pesce iniettato in CNTF. Barra di scala = 500 μm. Questa cifra è stata modificata da Bise et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59724/59724fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>

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Intrathoracic Injection for the Study of Adult Zebrafish Heart

Iniezione intrathoracica per lo studio del cuore di zebrafish adulto

Questo metodo si basa sull'iniezione di 0,5 − 3 μL di soluzione nel torace di zebrafish adulto. La procedura trasporta efficacemente proteine e composti chimici nella vicinanza del cuore del pesce zebra senza danneggiare l'organo. L'approccio è adatto per testare gli effetti di fattori esogeni su vari tessuti del cuore.

The adult zebrafish heart provides a powerful model in cardiac regeneration research. Although the strength of this system is based on transgenic ...

Nella ricerca cardiaca sul pesce zebra adulto, i trattamenti farmacologici vengono solitamente eseguiti in modo sistemico. Con l'iniezione intratoracica, si può fornire localmente soluzione al cuore senza causare danni al miocardio. Questo metodo consente la consegna di piccoli volumi di farmaci, proteine o altre molecole in soluzione proprio intorno al cuore di un zebrafish adulto.Per iniziare questa procedura, utilizzare un estrattore di ago per estrarre capillari di vetro borosilicato adattati alla microiniezione. Conservare i capillari tirati in una piastra di Petri di nove centimetri con rotaie di argilla modellante o nastro adesivo. Usando forbici comuni, taglia un pezzo di spugna e intasa una silhouette simile a un pesce nel suo mezzo.Successivamente, preparare piccole aliquote delle soluzioni di iniezione con le proteine testate o altri composti. Regolare la loro concentrazione a seconda del saggio diluire la sostanza in soluzione salina bilanciata 1x Hanks integrata con 10% rosso fenolo. Per ottenere la concentrazione di lavoro degli anestetici, aggiungere da due a tre millilitri di soluzione di stock di tricaina ad un bicchiere contenente 100 millilitri di acqua di pesce.Per prima cosa, accendi il microscopio stereo con la luce dall'alto e regola l'ingrandimento su 16x. Immergere la spugna con acqua di pesce e posizionarla su una piastra di Petri di nove centimetri al microscopio. Regolare la messa a fuoco e, al microscopio stereo, utilizzare le forbici per iridectomia per tagliare l'estremità di un microcapillare a circa sette millimetri dalla base, come descritto nella figura 1A del protocollo di testo.Inserire il microcapillare tagliato nel supporto dell'ago dell'apparato del microiniettore. Utilizzando le punte microloader, caricare una soluzione di controllo per impostare la pressione di iniezione per ottenere il flusso appropriato, quindi svuotare l'ago. Successivamente, caricare il volume selezionato della soluzione di iniezione nella punta del capillare, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria.Usa una rete per catturare un pesce adulto e trasferirlo nella soluzione anestetica. Dopo uno o due minuti, quando il pesce smette di nuotare e il movimento dell'opercolo è ridotto, toccare il pesce con un cucchiaio di plastica per assicurarsi che non reagisca ad alcun contatto. Successivamente, trasferire rapidamente e accuratamente il pesce nella scanalatura della spugna bagnata, con il lato ventrale verso l'alto.La testa del pesce dovrebbe puntare lontano dalla mano dominante dell'operatore. Al microscopio stereo, osservare attentamente il movimento del cuore pulsante sotto la pelle del pesce. Determinare visivamente il punto di iniezione sopra il cuore pulsante e al centro del triangolo, definito dalle placche cartilaginee ventrali.Inserire la punta del capillare con un angolo compreso tra 30 e 45 gradi rispetto all'asse del corpo. Penetrare delicatamente nella pelle con la punta del microcapillare nel pericardio. Una volta che l'ago si trova all'interno del pericardio, premere il pedale del dispositivo del microiniettore per completare l'iniezione.Dopo l'iniezione, ritirare delicatamente il capillare dal torace e trasferire immediatamente il pesce in un serbatoio con acqua di sistema per il recupero. Monitorare il pesce fino al recupero totale dall'anestesia. Per analizzare gli effetti dell'iniezione, raccogliere il cuore nel momento desiderato e prepararlo per ulteriori analisi.In questo studio, composti esogeni e proteine vengono consegnati nella cavità pericardica al fine di studiare i loro effetti sul cuore nel pesce zebra adulto. Per convalidare questo metodo, due esperimenti di prova vengono eseguiti iniettando coloranti colorati e fluorescenti in pesci eutanasiati. In entrambi i test, l'analisi a montaggio intero rivela l'etichettatura di tutto il cuore, incluso il ventricolo, l'atrio e il bulbus arteriosus.Questi risultati rivelano un'efficiente diffusione delle soluzioni di iniezione sulla superficie cardiaca. Per confrontare l'idoneità dell'iniezione intratoracica rispetto all'iniezione intraperitoneale per studi cardiaci, una quantità simile di DAPI viene iniettata utilizzando entrambi i metodi. I cuori vengono quindi fissati dopo cinque minuti o 120 minuti.Nessuna cellule dapi-positive si osserva nei cuori dopo l'iniezione intraperitoneale in entrambi i punti di tempo. Al contrario, le iniezioni intratoraciche si traducono nella presenza di nuclei etichettati DAPI nel miocardio. Questi risultati dimostrano che l'iniezione intratoracica migliora l'erogazione del composto al cuore, rispetto all'iniezione intraperitoneale.Per testare l'idoneità di questo metodo per gli studi di rigenerazione cardiaca, i ventricoli vengono crioingiunti e quindi le iniezioni vengono eseguite a tre e sette giorni dopo il crioinjury. Sia il miocardio che il tessuto ferito contengono numerose cellule dapi-positive, indicando un'efficiente penetrazione di questo colorante nel cuore intatto e nel tessuto fibrotico. Inoltre, la falloidina iniettata AF649 è anche incorporata dai cardiomiociti della zona peri-lesione e da alcuni fibroblasti reclutati dell'area ferita.Questo esperimento rivela che i farmaci possono attraversare l'epicardio e penetrare nel miocardio sottostante. Dopo aver testato l'efficienza delle iniezioni intratoraciche utilizzando coloranti, vengono analizzati gli effetti delle proteine iniettate sul cuore. Per questo, vengono studiati gli effetti della citochina esogena su vari processi.Gli aspetti biologici della proliferazione cardiomiocitaria, della deposizione della matrice extracellulare, del reclutamento delle cellule immunitarie e dell'espressione genica cardioprotettiva sono attivati dall'iniezione intratoracica di citochina. Questi risultati dimostrano che l'iniezione intratoracica fornisce una strategia adatta per la consegna mirata di proteine per studiare i loro effetti su tessuti cardiaci distinti in una varietà di test. L'inserimento dell'ago nel pericardio è un passaggio chiave per un'iniezione riuscita.La forma dell'ago, l'angolo di penetrazione e i siti di puntura sono tutti fattori che influenzano l'inserimento dell'ago. Dopo o prima dell'iniezione intratoracica, si può eseguire crioinjury al fine di analizzare l'effetto delle molecole iniettate sulla rigenerazione cardiaca. L'iniezione intratoracica è stata utilizzata nei pesci zebra per studiare la precondizione cardiaca.Una proteina chiamata CNTF è stata iniettata e ha dimostrato di migliorare i programmi citoprotettivi e pro-rigenerativi nel cuore.

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