Intratorakal injeksjon for studier av Adult sebrafisk Heart

I hjerteforskningen på voksen sebrafisk gjøres vanligvis narkotikabehandlinger på en systemisk måte. Med intrathoracic injeksjon, kan man lokalt levere løsning til hjertet uten å forårsake hjerteinfarkt. Denne metoden tillater levering av små mengder narkotika, proteiner eller andre molekyler i løsning nettopp rundt hjertet av en voksen sebrafisk.

For å starte denne prosedyren, bruk en nåletrekker til å trekke mikroinjeksjonstilpassede borosilikatglasskapillærer. Oppbevar de trukket kapillærer i en ni centimeter petriskål med skinner av modellering leire eller tape. Bruk vanlig saks, kutt et stykke svamp, og skjær en fiskelignende silhuett i midten.

Deretter forbereder du små aliquots av injeksjonsløsningene med de testede proteinene eller andre forbindelser. Juster konsentrasjonen avhengig av analysen ved å fortynne stoffet i 1x Hanks balansert saltløsning supplert med 10% fenolrød. For å oppnå arbeidskonsentrasjonen av anestetika, tilsett to til tre milliliter trikainlagerløsning til et beger som inneholder 100 milliliter fiskevann.

Slå først på stereomikroskopet med lyset fra toppen, og juster forstørrelsen til 16x. Bløtlegg svampen med fiskevann, og legg den på en ni centimeter petriskål på mikroskopet. Juster fokuset, og under stereomikroskopet, bruk iridektomisaks til å kutte enden av et mikrokapillær omtrent syv millimeter fra basen, som beskrevet i figur 1A i tekstprotokollen.

Sett det kuttede mikrokapilatoret inn i nåleholderen på mikroinjektorapparatet. Bruk mikrolasterspissene til å laste inn en kontrollløsning for å sette opp injeksjonstrykket for å oppnå riktig strømning, og tøm deretter nålen. Etter dette legger du det valgte volumet av injeksjonsoppløsningen inn i spissen av kapillæren, og pass på at det ikke er luftbobler.

Bruk et nett for å fange en voksen fisk, og overfør den til bedøvelsesløsningen. Etter ett til to minutter, når fisken slutter å svømme og bevegelsen av operculum reduseres, berører du fisken med en plastskje for å sikre at den ikke reagerer på noen kontakt. Deretter overfører du fisken raskt og forsiktig inn i sporet av den våte svampen, med ventralsiden opp.

Fiskehodet skal peke bort fra operatørens dominerende hånd. Under stereomikroskopet observerer du forsiktig bevegelsen av det bankende hjertet under fiskens hud. Visuelt bestemme injeksjonspunktet over det bankende hjertet og i midten av trekanten, definert av ventral bruskplater.

Sett spissen av kapillæren i en vinkel mellom 30 og 45 grader i forhold til kroppsaksen. Tren forsiktig inn i huden med spissen av mikrokapillæren inn i perikardiet. Når nålen er inne i perikardiet, trykker du på pedalen på mikroinjektorenheten for å fullføre injeksjonen.

Etter injeksjon, trekk forsiktig kapillæren fra thoraxen, og overfør fisken umiddelbart til en tank med systemvann for utvinning. Overvåk fisken til total utvinning fra anestesi. For å analysere effekten av injeksjon, samle hjertet på ønsket tidspunkt, og forberede det for videre analyse.

I denne studien leveres eksogene forbindelser og proteiner inn i perikardhulen for å studere deres effekter på hjertet hos voksne sebrafisk. For å validere denne metoden utføres to testeksperimenter ved å injisere farge og fluorescerende fargestoffer i eutanisert fisk. I begge analysene avslører helmontert analyse merking av hele hjertet, inkludert ventrikkelen, atriet og bulbus arteriosus.

Disse resultatene avslører effektiv spredning av injeksjonsløsningene på hjerteoverflaten. For å sammenligne egnetheten av intrathoracic injeksjon versus intraperitoneal injeksjon for hjertestudier, injiseres en tilsvarende mengde DAPI ved hjelp av begge metodene. Hjertene blir deretter fikset etter enten fem minutter eller 120 minutter.

Ingen DAPI-positive celler observeres i hjertene etter intraperitoneal injeksjon på begge tidspunktene. I motsetning resulterer de intrathoracic injeksjonene i nærvær av DAPI-merkede kjerner i myokardiet. Disse resultatene viser at intrathoracic injeksjon forbedrer levering av forbindelsen til hjertet, sammenlignet med intraperitoneal injeksjon.

For å teste egnetheten av denne metoden for hjerteregenereringsstudier, blir ventriklene kryoinjured, og deretter utføres injeksjoner ved tre og syv dager etter kryoskade. Både myokardiet og det skadede vevet inneholder mange DAPI-positive celler, noe som indikerer en effektiv penetrasjon av dette fargestoffet i det intakte hjertet og fibrotisk vev. Videre er injisert falloidin AF649 også innlemmet av kardiomyocytter i peri-skadesonen og noen rekrutterte fibroblaster i det sårede området.

Dette eksperimentet avslører at stoffene kan krysse epiardium og trenge inn i det underliggende myokardiet. Etter å ha testet effektiviteten av intrathoracic injeksjoner ved hjelp av fargestoffer, effekten av proteiner injisert på hjertet analyseres. For dette undersøkes effekten av eksogen cytokin på ulike prosesser.

De biologiske aspektene ved kardiomyocytterproliferasjon, ekstracellulær matrisedeponering, rekruttering av immunceller og kardiobeskyttende genuttrykk aktiveres ved intrathoracic injeksjon av cytokin. Disse resultatene viser at intrathoracic injeksjon gir en passende strategi for målrettet levering av proteiner for å studere deres effekter på distinkte hjertevev i en rekke analyser. Innsetting av nålen i perikardiet er et viktig skritt for en vellykket injeksjon.

Formen på nålen, vinkelen på penetrasjon, og punkteringsstedene er alle faktorer som påvirker nåleinnsettingen. Etter eller foregående intrathoracic injeksjon, man kan utføre kryoskade for å analysere effekten av injiserte molekyler på hjerte regenerering. Intrathoracic injeksjon ble brukt i sebrafisk for å studere hjertebeting.

Et protein kalt CNTF ble injisert og har vist seg å forbedre cytobeskyttende og pro-regenerative programmer i hjertet.