Inyección intratorácica para el estudio del corazón de pez cebra adulto

En la investigación cardíaca sobre peces cebra adultos, los tratamientos farmacológicos generalmente se realizan de manera sistémica. Con la inyección intratorácica, se puede administrar localmente la solución al corazón sin causar daño miocárdico. Este método permite la entrega de pequeños volúmenes de fármacos, proteínas u otras moléculas en solución precisamente alrededor del corazón de un pez cebra adulto.

Para comenzar este procedimiento, utilice un tirador de aguja para extraer los capilares de vidrio borosilicato adaptados a la microinyección. Almacene los capilares tirados en un plato Petri de nueve centímetros con rieles de arcilla de modelado o cinta adhesiva. Usando tijeras comunes, corta un pedazo de esponja y talla una silueta parecida a un pez en su medio.

A continuación, prepare pequeñas alícuotas de las soluciones de inyección con las proteínas probadas u otros compuestos. Ajustar su concentración dependiendo del ensayo diluyendo la sustancia en 1x solución de sal equilibrada de Hanks complementada con 10%rojo fenol. Para obtener la concentración de trabajo de anestésicos, añadir de dos a tres mililitros de solución de material de tricaína a un vaso de precipitados que contenga 100 mililitros de agua de pescado.

En primer lugar, encienda el microscopio estéreo con la luz de la parte superior y ajuste la ampliación a 16x. Remoje la esponja con agua de pescado y colóquela en una placa Petri de nueve centímetros en el microscopio. Ajuste el enfoque, y bajo el microscopio estéreo, utilice tijeras de iridectomía para cortar el extremo de un microcapilar aproximadamente siete milímetros de la base, como se detalla en la Figura 1A del protocolo de texto.

Inserte el microcapilar cortado en el soporte de la aguja del aparato microinyector. Con las puntas de Microloader, cargue una solución de control para configurar la presión de inyección con el fin de obtener el flujo adecuado y, a continuación, vacíe la aguja. Después de esto, cargue el volumen seleccionado de la solución inyectable en la punta del capilar, asegurándose de que no haya burbujas de aire.

Utilice una red para atrapar un pez adulto y transfiételo a la solución anestésica. Después de uno a dos minutos, cuando el pescado deje de nadar y se reduzca el movimiento del opérculo, toque el pescado con una cuchara de plástico para asegurarse de que no reacciona a ningún contacto. A continuación, transfiera rápida y cuidadosamente el pescado a la ranura de la esponja húmeda, con el lado ventral hacia arriba.

La cabeza del pez debe apuntar lejos de la mano dominante del operador. Bajo el microscopio estéreo, observe cuidadosamente el movimiento del corazón latiendo bajo la piel de los peces. Determinar visualmente el punto de inyección por encima del corazón latiendo y en el centro del triángulo, definido por las placas cartilaginosas ventrales.

Inserte la punta del capilar en un ángulo entre 30 y 45 grados en relación con el eje del cuerpo. Penetra suavemente la piel con la punta del microcapilar en el pericardio. Una vez que la aguja esté dentro del pericardio, presione el pedal del dispositivo microinyector para completar la inyección.

Después de la inyección, retire suavemente el capilar del tórax e inmediatamente transfiera el pescado a un tanque con agua del sistema para su recuperación. Monitoree los peces hasta la recuperación total de la anestesia. Para analizar los efectos de la inyección, recoja el corazón en el punto de tiempo deseado y prepárelo para un análisis posterior.

En este estudio, compuestos y proteínas exógenas se entregan en la cavidad pericárdica con el fin de estudiar sus efectos sobre el corazón en el pez cebra adulto. Para validar este método, se realizan dos experimentos de prueba inyectando color y colorantes fluorescentes en peces eutanizados. En ambos ensayos, el análisis de montaje completo revela el etiquetado de todo el corazón, incluyendo el ventrículo, la aurícula y el bulbo arterioso.

Estos resultados revelan una propagación eficiente de las soluciones de inyección en la superficie del corazón. Para comparar la idoneidad de la inyección intratorácica frente a la inyección intraperitoneal para estudios cardíacos, se inyecta una cantidad similar de DAPI utilizando ambos métodos. Los corazones se fijan después de cinco minutos o 120 minutos.

No se observan células DAPI positivas en los corazones después de la inyección intraperitoneal en cualquier momento. Por el contrario, las inyecciones intratorácicas dan lugar a la presencia de núcleos con etiqueta DAPI en el miocardio. Estos resultados demuestran que la inyección intratorácica mejora la administración del compuesto al corazón, en comparación con la inyección intraperitoneal.

Para probar la idoneidad de este método para los estudios de regeneración cardíaca, los ventrículos se lesionan crioincieras, y luego las inyecciones se realizan a los tres y siete días después del crioinjuro. Tanto el miocardio como el tejido lesionado contienen numerosas células DAPI positivas, lo que indica una penetración eficiente de este tinte en el corazón intacto y el tejido fibroso. Además, la faloideína inyectada AF649 también se incorpora por cardiomiocitos de la zona de la peri-lesión y algunos fibroblastos reclutados de la zona herida.

Este experimento revela que los fármacos pueden cruzar el epicardio y penetrar en el miocardio subyacente. Después de probar la eficiencia de las inyecciones intratorácicas utilizando tintes, se analizan los efectos de las proteínas inyectadas en el corazón. Para ello, se investigan los efectos de la citoquina exógena en varios procesos.

Los aspectos biológicos de la proliferación de cardiomiocitos, la deposición de matriz extracelular, el reclutamiento de células inmunitarias y la expresión génica cardioprotectora se activan mediante la inyección intratorácica de citoquinas. Estos resultados demuestran que la inyección intratorácica proporciona una estrategia adecuada para la administración dirigida de proteínas para estudiar sus efectos en tejidos cardíacos distintos en una variedad de ensayos. La inserción de la aguja en el pericardio es un paso clave para una inyección exitosa.

La forma de la aguja, el ángulo de penetración y los sitios de punción son factores que influyen en la inserción de la aguja. Después o antes de la inyección intratorácica, se puede realizar crioinjuro con el fin de analizar el efecto de las moléculas inyectadas en la regeneración del corazón. La inyección intratorácica se utilizó en peces cebra para estudiar el preacondicionamiento cardíaco.

Se inyectó una proteína llamada CNTF y se ha demostrado que mejora los programas citoprotectores y pro-regenerativos en el corazón.