Intrathoraxinjektion för studiet av vuxna Zebrafish hjärta

I hjärtforskningen på vuxna zebrafiskar görs läkemedelsbehandlingar vanligtvis på ett systemiskt sätt. Med intrathoracic injektion, man kan lokalt leverera lösning till hjärtat utan att orsaka myokardiell skada. Denna metod möjliggör leverans av små volymer av läkemedel, proteiner, eller andra molekyler i lösning just runt hjärtat av en vuxen zebrafisk.

Till att börja detta förfarande, använd en nåldragare för att dra mikroinjection-anpassade borosilikat glas kapillärer. Förvara de dragna kapillärerna i en nio centimeter petriskål med skenor av modellering av lera eller tejp. Med hjälp av vanliga saxar, skär en bit svamp, och skär en fisk-liknande silhuett i mitten.

Därefter förbereda små alikvoter av injektionslösningarna med de testade proteinerna eller andra föreningar. Justera deras koncentration beroende på analysen genom att späda substansen i 1x Hanks'balanserad saltlösning kompletterad med 10%fenolrött. För att få arbetskoncentrationen av bedövningsmedel, tillsätt två till tre milliliter trikain stamlösning till en bägare som innehåller 100 milliliter fiskvatten.

Först sätter du på stereomikroskopet med ljuset från toppen, och justera förstoringen till 16x. Blöt svampen med fiskvatten, och placera den på en nio centimeter Petriskål på mikroskopet. Justera fokus, och under stereomikroskopet, använd iridektomi sax för att skära slutet av en mikrokapillär cirka sju millimeter från basen, som beskrivs i figur 1A i textprotokollet.

För in den skurna mikrokapslingen i mikroinjektorapparatens nålhållare. Med hjälp av Microloader-spetsarna, ladda en styrlösning för att ställa in trycket från injektionen för att erhålla lämpligt flöde, töm sedan nålen. Efter detta, ladda den valda volymen av injektionslösningen i toppen av kapillären, se till att det inte finns några luftbubblor.

Använd ett nät för att fånga en vuxen fisk, och överföra den till anestesilösningen. Efter en till två minuter, när fisken slutar simma och rörelsen av operculum minskas, rör vid fisken med en plastsked för att se till att den inte reagerar på någon kontakt. Därefter snabbt och försiktigt överföra fisken i spåret av den våta svampen, med den ventrala sidan upp.

Fiskens huvud bör peka bort från aktörens dominerande hand. Under stereomikroskopet observerar du försiktigt det bultande hjärtats rörelse under fiskens hud. Visuellt bestämma injektionspunkten ovanför det slående hjärtat och i mitten av triangeln, som definieras av de ventrala broskplattorna.

För in kapillärens spets i en vinkel mellan 30 och 45 grader i förhållande till kroppsaxeln. Tränger försiktigt in i huden med toppen av mikrokapslingen in i hjärtsäcken. När nålen är inne i hjärtsäcken trycker du på mikroinjektorapparatens pedal för att slutföra injektionen.

Efter injektionen, dra försiktigt kapillären från bröstkorgen, och omedelbart överföra fisken i en tank med systemvatten för återhämtning. Övervaka fisken tills total återhämtning från anestesi. För att analysera effekterna av injektion, samla hjärtat vid önskad tidpunkt, och förbereda den för ytterligare analys.

I denna studie levereras exogena föreningar och proteiner till hjärtsäckshålan för att kunna studera deras effekter på hjärtat hos vuxna zebrafiskar. För att validera denna metod utförs två testexperiment genom att injicera färg och fluorescerande färgämnen i avlivad fisk. I båda analyserna, hela-mount analys avslöjar märkning av hela hjärtat inklusive ventrikeln, atriumet, och bulbus arteriosus.

Dessa resultat avslöjar effektiv spridning av injektionslösningarna på hjärtytan. För att jämföra lämpligheten av intrathoracic injektion kontra intraperitoneal injektion för hjärtstudier, en liknande mängd DAPI injiceras med båda metoderna. Hjärtana fixas därefter efter endera fem noterar eller 120 noterar.

Inga DAPI-positiva celler observeras i hjärtan efter intraperitoneal injektion vid endera tidpunkt. Däremot intrathoracic injektioner resultera i närvaro av DAPI-märkta atomkärnor i myokardiet. Dessa resultat visar att intrathoracic injektion förbättrar leveransen av föreningen till hjärtat, jämfört med den intraperitoneala injektionen.

För att testa lämpligheten av denna metod för hjärtregenereringsstudier, är ventriklarna cryoinjured, och sedan injektioner utförs vid tre och sju dagar post-cryo skada. Både myokardiet och den skadade vävnaden innehåller många DAPI-positiva celler, vilket indikerar en effektiv penetration av detta färgämne i intakt hjärta och fibrotisk vävnad. Vidare, injiceras phalloidin AF649 är också införlivas av kardiomyocyter av peri-skada zonen och några rekryterade fibroblaster av de sårade området.

Detta experiment avslöjar att drogerna kan korsa epikardiet och tränga in i det underliggande myokardiet. Efter att ha testat effektiviteten av intrathoracic injektioner med hjälp av färgämnen, effekterna av proteiner som injiceras på hjärtat analyseras. För detta undersöks effekterna av den exogena cytokinen på olika processer.

De biologiska aspekterna av kardiomyocyte spridning, extracellulära matris nedfall, immun cell rekrytering och hjärtskyddande genuttryck aktiveras genom intrathoracic injektion av cytokin. Dessa resultat visar att intrathoracic injektion ger en lämplig strategi för riktad leverans av proteiner för att studera deras effekter på distinkta hjärtvävnader i en mängd olika analyser. Nålens införande i hjärtsäcken är ett nyckelsteg för en lyckad injektion.

Nålens form, inträngningsvinkeln och punkteringsställena är alla faktorer som påverkar nålinföringen. Efter eller föregående intrathoracic injektion, man kan utföra cryo skada i syfte att analysera effekten av injicerade molekyler på hjärtregenerering. Intrathoracic injektion användes i zebrafish att studera hjärt preconditioning.

Ett protein som kallas CNTF injicerades och har visat sig förbättra cytoprotective och pro-regenerativa program i hjärtat.