Yetişkin zebrafish kalp çalışması için intratorasik enjeksiyon

Yetişkin zebra balığı üzerinde kardiyak araştırma, ilaç tedavileri genellikle sistemik bir şekilde yapılır. İntratorasik enjeksiyon ile, bir lokal miyokardiyal hasara neden olmadan kalbe çözüm sunabilir. Bu yöntem, yetişkin bir zebra balığının kalbinin etrafında küçük hacimlerde ilaç, protein veya çözelti içinde diğer moleküllerin teslimine olanak sağlar.

Bu prosedüre başlamak için, mikroenjeksiyon uyarlanmış borosilikat cam kılcal çeker çekmek için bir iğne çekmece kullanın. Çekilen kılcal damarları, kil veya yapışkan bant modelleme rayları ile dokuz santimetrelik Petri kabında saklayın. Ortak makas kullanarak, sünger bir parça kesilmiş ve ortasında bir balık gibi siluet oymak.

Daha sonra, test edilmiş proteinler veya diğer bileşikler ile enjeksiyon çözeltileri küçük aliquots hazırlamak. %10 fenol kırmızısı ile tamamlanan 1x Hanks'in dengeli tuz çözeltisindeki maddeyi seyrelterek, töze bağlı olarak konsantrasyonlarını ayarlayın. Anestezilerin çalışma konsantrasyonu elde etmek için, balık suyu 100 mililitre içeren bir kabına triain stok çözeltisi iki ila üç mililitre ekleyin.

İlk olarak, stereo mikroskobu üstten gelen ışıkla açın ve büyütmeyi 16 x'e ayarlayın. Süngeri balık suyuyla ıslatın ve mikroskoptaki dokuz santimetrelik Petri kabının üzerine koyun. Odağı ayarlayın ve stereo mikroskop altında, metin protokolünün Şekil 1A'sında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi, tabanından yaklaşık yedi milimetre uzaklıktaki bir mikrokapillerın ucunu kesmek için iridektomi makasını kullanın.

Kesilmiş mikrokapilleri mikroenjektör cihazının iğne tutucuya yerleştirin. Microloader ipuçlarını kullanarak, uygun akışı elde etmek için enjeksiyon basıncını ayarlamak için bir kontrol çözeltisi yükleyin, sonra iğneyi boşaltın. Bundan sonra, enjeksiyon çözeltisinin seçilen hacmini kılcal damarın ucuna yükleyin ve hava kabarcıkları olmadığından emin olun.

Yetişkin bir balık yakalamak için bir ağ kullanın ve anestezik çözelti içine aktarın. 1-2 dakika sonra, balık yüzmeyi bıraktığında ve operkülün hareketi azaldığında, herhangi bir temasa tepki vermemesi için balıklara plastik bir kaşıkla dokunun. Daha sonra, hızlı ve dikkatli bir şekilde ıslak sünger oluk içine balık aktarın, ventral tarafı yukarı ile.

Balığın başı operatörün baskın elinden uzağa işaret etmelidir. Stereo mikroskop altında, dikkatle balık derisi altında atan kalbin hareketini gözlemleyin. Görme atan kalp üzerinde enjeksiyon noktası belirlemek ve üçgenin ortasında, ventral kıkırdak plakaları tarafından tanımlanan.

Kılcal damar ucunu vücut eksenine göre 30 ila 45 derece arasında bir açıyla yerleştirin. Mikrokapillerin ucu yla cilde yavaşça nüfuz edin. İğne perikardın içine girdikten sonra, enjeksiyonu tamamlamak için mikroenjektör cihazının pedalına basın.

Enjeksiyondan sonra, kılcal damarı yavaşça torakstan çekin ve balığı hemen geri kazanım için sistem suyu olan bir tanka aktarın. Anesteziden tamamen iyileşene kadar balığı izleyin. Enjeksiyon etkilerini analiz etmek için, istenilen zaman noktasında kalp toplamak ve daha fazla analiz için hazırlamak.

Bu çalışmada, erişkin zebra balıklarında kalp üzerindeki etkilerini incelemek için eksojen bileşikler ve proteinler perikardiyal kaviteye teslim edilmektedir. Bu yöntemi doğrulamak için, ötanazi balıkiçine renk ve floresan boyalar enjekte ederek iki test deneyi yapılır. Her iki tahlilde, tam montaj analizi ventrikül de dahil olmak üzere tüm kalbin etiketleme ortaya koymaktadır, atriyum, ve bulbus arteriosus.

Bu sonuçlar, enjeksiyon çözeltilerinin kalp yüzeyinde verimli bir şekilde yayıldığını ortaya koymaktadır. İntratorasik enjeksiyonun kalp çalışmaları için intraperitoneal enjeksiyona karşı uygunluğunu karşılaştırmak için, benzer miktarda DAPI her iki yöntem kullanılarak enjekte edilir. Kalpler beş dakika veya 120 dakika sonra sabitlenir.

Her iki zaman da intraperitoneal enjeksiyondan sonra kalplerde DAPI pozitif hücre gözlenmez. Buna karşılık, intratorasik enjeksiyonlar miyokardiyumda DAPI etiketli çekirdeklerin varlığıile sonuçlanır. Bu sonuçlar intratorasik enjeksiyon kalbe bileşik teslimartırır göstermektedir, intraperitoneal enjeksiyon ile karşılaştırıldığında.

Kalp rejenerasyon çalışmaları için bu yöntemin uygunluğunu test etmek için, ventriküller kriyomlu, ve sonra enjeksiyonlar üç ve yedi gün post-kriyoyaralanma yapılır. Hem miyokardiyum hem de yaralı doku çok sayıda DAPI pozitif hücreler içerir, bozulmamış kalp ve fibrotik doku içine bu boya verimli bir penetrasyon gösteren. Ayrıca, enjekte phalloidin AF649 da peri-yaralanma bölgesikardiyomiyositler ve yaralı bölgenin bazı işe fibroblastlar tarafından dahil edilmiştir.

Bu deney, ilaçların epikardiyi geçerek altta yatan miyokardyuma nüfuz edebildiği ortaya çıkıyor. Boyalar kullanılarak intratorasik enjeksiyonların etkinliği test edildikten sonra, kalp üzerinde enjekte edilen proteinlerin etkileri analiz edilir. Bunun için eksojen sitokinin çeşitli süreçler üzerindeki etkileri araştırılır.

Kardiyomiyosit proliferasyonunun biyolojik yönleri, ekstrasellüler matriks birikimi, immün hücre alımı ve kardiyoprotektif gen ekspresyonu sitokin intratorasik enjeksiyonu ile aktive edilir. Bu sonuçlar intratorasik enjeksiyon çeşitli tahliller farklı kalp dokuları üzerindeki etkilerini incelemek için proteinlerin hedeflenen teslim için uygun bir strateji sağladığını göstermektedir. İğnenin perikard'a yerleştirilmesi başarılı bir enjeksiyon için önemli bir adımdır.

İğnenin şekli, penetrasyon açısı ve delinme bölgeleri iğne girişini etkileyen faktörlerdir. İntratorasik enjeksiyondan sonra veya öncesinde, enjekte edilen moleküllerin kalp yenilenmesi üzerindeki etkisini analiz etmek için kriyoinjury yapılabilir. İntratorasik enjeksiyon, zebra balıklarında kardiyak ön koşullanmayı incelemek için kullanıldı.

CNTF adı verilen bir protein enjekte edildi ve kalpteki sitoprotektif ve pro-rejeneratif programları geliştirdiği gösterilmiştir.