Name: analysis of interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro bath fermentation systems
Uploaded: 2019-08-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 31741109), קרן הונאן למדעי הטבע (No. 2018JJ3200), ואת התוכנית לבנות של משמעת אופיינית מיושם באוניברסיטת הונאן של המדע וההנדסה. אנו מודים LetPub (www.letpub.com) על הסיוע הלשוני שלה במהלך הכנת כתב היד הזה.

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של הונאן אוניברסיטת המדע והנדסה (הונאן, סין), ואת אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג גונגאנג (ג'ג'יאנג, סין).
1. הכנת חיידקים
<ol><li>הכנת מרק בינוני ביפידוחיידק<ol>
<li>שלב את הרכיבים הבאים ב 950 מ ל של מים מזוקקים: תמצית בשר, 5 g/L; תמצית שמרים, 5 גר'/L; פנימה ש?...

<ol>
	<li>Maarten, V. D. G., Blotti&#232;re Herv&#233;, M., Dor&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+as+holobionts:+implications+for+prevention+and+therapy.">Humans as holobionts: implications for prevention and therapy.</a> Microbiome. 6 (1), 81 (2018).</li><li>Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+psychology+of+the+human+brain-gut-microbiome+axis.">A psychology of the human brain-gut-microbiome axis.</a> Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).</li><li>Arora, T., B&#228;ckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+and+metabolic+disease:+current+understanding+and+future+perspectives.">The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives.</a> Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).</li><li>Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotics+shape+the+physiology+and+gene+expression+of+the+active+human+gut+microbiome.">Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome.</a> Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).</li><li>Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbial+interactions+in+the+metabolism+of+therapeutic+and+diet-derived+xenobiotics.">Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).</li><li>Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotics:+interaction+with+the+intestinal+microflora.">Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora.</a> ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).</li><li>Taguer, M., Maurice, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+interplay+of+diet,+xenobiotics,+and+microbial+metabolism+in+the+gut:+implications+for+clinical+outcomes.">The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).</li><li>Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotic+metabolism+and+gut+microbiomes.">Xenobiotic metabolism and gut microbiomes.</a> PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).</li><li>Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+transformation+of+xenobiotics+by+the+human+gut+microbiota.">Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota.</a> Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).</li><li>Hidalgo-Cantabrana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+overview+and+biological+functions+of+exopolysaccharide+biosynthesis+in+Bifidobacterium+spp.">Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+bifidobacteria-produced+exopolysaccharides+on+human+gut+microbiota+in+vitro.">Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).</li><li>Tang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbial+profile+is+altered+in+primary+biliary+cholangitis+and+partially+restored+after+UDCA+therapy.">Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy.</a> Gut. 67 (3), 534-541 (2018).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+QIIME+to+analyze+16S+rRNA+gene+sequences+from+microbial+communities.">Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities.</a> Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).</li><li>Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy+mothur+Toolset+(GmT):+a+user-friendly+application+for+16S+rRNA+gene+sequencing+analysis+using+mothur.">Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur.</a> GigaScience. , (2018).</li><li>Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+Bayesian+classifier+for+rapid+assignment+of+rRNA+sequences+into+the+new+bacterial+taxonomy.">Na&#239;ve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).</li><li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+mothur:+open-source,+platform-independent,+community-supported+software+for+describing+and+comparing+microbial+communities.">Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).</li><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+the+in+vitro+effects+of+pseudomonas+aeruginosa+and+seaweed+alginates+on+human+gut+microbiota.">Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota.</a> Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).</li><li>Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+for+the+analysis+of+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).</li><li>Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbiota+interactions:+from+holobiont+theory+to+analysis.">Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis.</a> Microbiome. 7 (5), (2019).</li><li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Holobiont:+how+microbial+metabolites+affect+human+health+and+shape+the+immune+system.">Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system.</a> Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).</li><li>Kramer, P., Bressan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humans+as+superorganisms:+how+microbes,+viruses,+imprinted+genes,+and+other+selfish+entities+shape+our+behavior.">Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior.</a> Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).</li><li>Malfertheiner, P., Nardone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota:+the+forgotten+organ.">Gut microbiota: the forgotten organ.</a> Digestive Diseases. 29 (6), (2011).</li><li>Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+is+a+new+organ+in+our+body.">The gut microbiota is a new organ in our body.</a> The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).</li><li>Mika, A., Van, W. T., Gonz&#225;lez, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+is+more+effective+at+altering+gut+microbial+composition+and+producing+stable+changes+in+lean+mass+in+juvenile+versus+adult+male+f344+rats.">Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats.</a> PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).</li><li>Hugenholtz, F., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+human+intestinal+microbiota+research:+a+critical+evaluation.">Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).</li><li>Takagi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-batch+fermentation+system+to+simulate+human+colonic+microbiota+for+high-throughput+evaluation+of+prebiotics.">A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics.</a> PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).</li><li>Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+analysis+in+rats+with+methamphetamine-induced+conditioned+place+preference.">Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).</li></ol>

התקדמות משמעותית נעשתה לקראת הבנה מיקרוביוטה הבטן האנושית הרכב ופעילויות בעשור האחרון. כתוצאה ממחקרים אלה, הושג הולובימונט, המייצג את האינטראקציות בין מחשבים מארחים לבין קהילות מיקרוביאלית הקשורות, כגון בין בני אדם לבין המעיים שלהם מיקרוביוטה19,20. יתר על כ...

מיקרוביוטה במעיים ממלאים תפקיד חשוב בתפקוד המעי האנושי ובבריאות המארחת. כתוצאה מכך, המעיים microbiota לאחרונה להיות יעד חשוב למניעת מחלות וטיפול1. יתר על כן, בקטריה המעיים אינטראקציה עם תאי מעיים מארחים ומווסת תהליכים מארחים יסודיים, כולל פעילויות מטבוליות, זמינות מזינים, אפנון מערכת חיסונית, ואפילו תפקוד המוח וקבלת ההחלטות2,3 . אנדוביוטיקה יש פוטנציאל רב להשפיע על הרכב חיידקי וגיוון של מיקרוביוטה בטן. כך, אינטראקציות בין האנדוביוטיקה ומיקרוביוטה האדם משכו את תשומת הלב מחקר הגוברת4,5,6,7,8,9.
קשה להעריך את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האנושית בvivo בשל האילוצים הביואתיים וההגבלות הכלכליות. לדוגמה, ניסויים החוקרים את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם לא ניתן לבצע ללא אישור של מינהל המזון והתרופות, וגיוס מתנדבים הוא יקר. לכן, מודלים בעלי חיים משמשים לעתים קרובות לחקירות כאלה. עם זאת, השימוש במודלים בעלי חיים מוגבל בשל קומפוזיציות microbiota שונים וגיוון בבעלי חיים לעומת הקהילות הקשורות לאדם. חלופה בשיטת חוץ גופית כדי לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה ומיקרוביוטה האדם הבטן היא באמצעות השימוש בניסויים בתרבות האצווה.
הפרפוליסכדים (EPSs) הם prebiotics שתורמים באופן משמעותי לשמירה על בריאות האדם10. ברור epss כי מורכב של קומפוזיציות חד-סוכר שונים ומבנים יכולים להפגין פונקציות נפרדות. ניתוחים קודמים קבעו את ההרכב של ביף EPSs, אשר הם הנציג הבכיר ממוקד במחקר הנוכחי11. עם זאת, אפקטים מטבוליים המשויכים למארח לא נחשבו ביחס לקומפוזיציה ולגיוון של EPS.
הפרוטוקול המתואר כאן משתמש במיקרוביוטה צואה מ -12 מתנדבים להחמיץ את ביף EPSs. כרומטוגרפיה של שכבה דקה (למעלה), 16 s rRNA התפוקה הגבוהה ברצף של הגז, כרומטוגרפיה גז (GC) משמשים בשילוב כדי לחקור את האינטראקציות בין EPSs לבין מיקרוביוטה בטן האדם. יתרונות שונים של פרוטוקול זה בהשוואה לניסויים vivo הם בעלות נמוכה והימנעות של אפקטים מפריעים מחילוף החומרים של המארח. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר במחקרים אחרים החוקרים את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בבטן האדם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Use to filter samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4-mm Sieve</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>308080-99-1</td>
			<td>Use to prepare human fecal samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>X1010</td>
			<td>Use to prepare color plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71251</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-1012214</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic chamber</td>
			<td>Electrotek&#160;</td>
			<td>AW 400SG</td>
			<td>Bacteria culture and fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>SANYO</td>
			<td>MLS-3750</td>
			<td>Use to autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto soytone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70178</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baking oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td>Use to heat and bake</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef Extract</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8270</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium longum Reuter</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; 51870&#8482;</td>
			<td>Bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-1071304</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyric</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>19215</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C7250</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary column</td>
			<td>SHIMADZU-GL</td>
			<td>InertCap FFAP (0.25 mm &#215; 30 m &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td>Used to SCFA detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39396</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 8</td>
			<td>Use for centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoSO4.7H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C7490</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>203165</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine-HCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>L1550</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Use to prepare vitamin K1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-111614</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>399388</td>
			<td>Used to TLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography</td>
			<td>Shimadzu Corporation</td>
			<td>GC-2010 Plus</td>
			<td>Used to SCFA detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB10050</td>
			<td>Used for slurry preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8760</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>H8130</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30721</td>
			<td>Basic solution used to adjust the pH of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutyric</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46935-U</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovaleric Acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>129542</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D9880</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P9921</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P7392</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl.3H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8380</td>
			<td>Use to prepare color plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meat Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td>
			<td>70164</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaphosphoric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7350</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8160</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8300</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISEQ</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MiSeq 300PE system</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4.H20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8179</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupirocin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-1448901</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-100376</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792519</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000</td>
			<td>NanoDrop Technologies</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Determine DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30620</td>
			<td>Basic solution used to adjust the pH of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-butanol</td>
			<td>ChemSpider</td>
			<td>71-36-3</td>
			<td>Used to TLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiCl2</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>746460</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>447420</td>
			<td>Used to prepare orcinol reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94425</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Stool Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>51504</td>
			<td>Extract bacterial genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready-to-use PBS powder</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A610100-0001</td>
			<td>Used to prepare the lipid suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R8150</td>
			<td>Anaerobic Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vacuum Concentrator</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>CentriVap</td>
			<td>Use to prepare EPSs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starch</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YZ-140602</td>
			<td>Use to the carbon source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>150692</td>
			<td>Used to prepare orcinol reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 PCR</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC aluminium sheets</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>116835</td>
			<td>Used to TLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z699209</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7293</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8360</td>
			<td>Salt solution of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valeric</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75054</td>
			<td>Standard sample for SCFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin K1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3501</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex oscillator</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>Vortex.Genie2</td>
			<td>Use to vortexing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td>The component of medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro bath fermentation systems

מיקרואורגניזמים מעיים אנושיים הפכו לאחרונה למטרה חשובה של מחקר בקידום בריאות האדם ומניעת מחלות. כתוצאה מכך, חקירות של אינטראקציות בין אנביוקינטיקה (למשל, תרופות וטרום ביודונטיה) ומיקרוביוטה לבטן הפכו לנושא מחקר חשוב. עם זאת, בניסויים vivo עם מתנדבים אנושיים אינם אידיאליים למחקרים כאלה בשל ביואתיקה ואילוצים כלכליים. כתוצאה מכך, מודלים בעלי חיים שימשו להערכת האינטראקציות הללו בvivo. למרות זאת, לימודי מודל בעלי חיים עדיין מוגבלים בשיקולים ביולוגיים, בנוסף לקומפוזיציות והבדלים שונים של מיקרוביוטה בבעלי חיים לעומת בני אדם. אסטרטגיית מחקר אלטרנטיבית היא השימוש בניסויים תסיסה אצווה המאפשרים הערכה של האינטראקציות בין אנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בטן במבחנה. כדי להעריך את האסטרטגיה הזאת, נעשה שימוש ב-EP (ביף) האקפוליסכאנטיות (בדומה) כנציג מסוג xenobiotic יוטי. לאחר מכן, האינטראקציות בין ביף EPS לבין מיקרוביוטה בבטן האדם נחקרו באמצעות מספר שיטות כגון כרומטוגרפיה של שכבה דקה, ניתוח מקומי קהילתי חיידקי עם רצף התפוקה הגבוה של 16 rRNA, וכרומטוגרפיה של גז של חומצות שומן קצרות (SCFAs). המוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת. וחשוב מכך, פרוטוקול זה יכול להיות גם שונה כדי לחקור אינטראקציות כלליות בין האנדוביוטיקה אחרים המעיים microbiota.

הייצור של EPS mucoid ניתן לצפות ב -B. longum התרבויות על לוחיות pyg לאחר דגירה אנאירובית עבור 72 h (איור 1a). צנטריפוגה של שריטות התרבות, ואחריו משקעים אתנול וייבוש, הביא את האוסף של תאית כמו EPS (איור 1B). EPS מיובש ועמילן מסיסים שימשו לאחר מכן כמקורות פחמן לתרבויות תסיסה....

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems at JoVE.com

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

ניתוח אינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה של האדם באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט

המתואר כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת.

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

הפרוטוקול שלנו יכול להיות בשימוש נרחב עבור תפוקה גבוהה סינון מהיר של האינטראקציות בין אנדוביוטיקה microbiota המעיים האנושיים. עלות נמוכה והימנעות מהשפעות הפרעה מחילוף החומרים של המארח. הליך זה יש פוטנציאל לשמש באבחון.ראשית, להמיס BIF EPS ועיוולן בנפרד במים חמים על מסית מגנטי כדי להפוך את הריכוז של שמונה גרם לליטר. במדיום התרבות הבסיסית המוכן, VI, הוסף 100 מיליליטר של פתרון BIF EPS כדי ליצור פתרון תרבות VI BIF. הוסף 100 מיליליטר של פתרון עמילן כדי להפוך את פתרון עמילן VI תרבות.אוטוקלאב את שתי המדיה עם מקור פחמן, ואת המדיום ללא מקור פחמן כבקרה, ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. אפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר ולהוסיף יימן וציסטאין. מעבירים תת מדגם של חמישה מיליליטר של כל מדיום לצינורות תרבות.ולאחסן באינקובטור אנאירובי. אחסן את שאר המדיה בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין מדגם צואה אנושי, להעביר גרם אחד של מדגם צואה טרי לתוך 10 מיליליטר של 0.1 PBS אנאירובי טוחן ב pH שבע ב זכוכית.ואז להשתמש מוט זכוכית כדי לבחוש אותו כדי להשיג תרחיף. בתא אנאירובי, להוסיף 500 microliters של תרחיף צואה מסונן לתוך שלוש מדיה תסיסה מוכן, בנפרד. ואז, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר 24 שעות ו -48 שעות, לאסוף שני מיליליטר של דגימות מותססות בתא אנאירובי. ואז צנטריפוגה מחוץ לתא ב 6000 פעמים G, במשך שלוש דקות. מעבירים בזהירות את העל-טבעיים לצינורות צנטריפוגה חדשים שישמשו לניתוח השפלת פוליסכריד ומדידות חומצות שומן קצרות שרשרת.אחסן את כדורי הצנטריפוגה ב-80 מעלות צלזיוס. לטעון 0.2 microliters של supernatants מותססים על כל ג'ל סיליקה מצופה מראש 60 לוח אלומיניום TLC מערבולת להתפשט. לאחר מכן השתמש במייבש שיער עם אוויר חם לייבוש.לטבול קצה אחד של הלוחות שנדגמו ב 20 מיליליטר של חומצה פורמית:n-butanol:פתרון מים במשך כמה דקות, עד אלקטרופורזה משתרע כמעט לקצה השני. ואז להוציא את הצלחות עם מדפים, ויבש עם מייבש שיער. ואז להשרות את הצלחות בריג'נט orcinol במשך שתי דקות לצבוע.ויבש שוב. מעבירים את הצלחות לתנור אפייה ב-120 מעלות לחום במשך שלוש דקות. לאחר מכן צלם את הלוח כדי להעריך השפלה של EPS על ידי מדידת להקות TLC.כדי לחקור את ההשפעות של EPS על ייצור SCFA, להוסיף מיליליטר אחד של supernatants מותססים צינורות צנטריפוגה שני מיליליטר ולהוסיף 0.2 מיליליטר של 25 משקל / נפח אחוז של חומצה גרורתית לכל מדגם. מערבולת לערבב ביסודיות את הפתרונות. צנטריפוגה תערובות ב 13, 000 פעמים G במשך 20 דקות.בינתיים, להכין פתרונות של 120 מילימולרית אצטית, propionic, butyric, isobutyric, ולרי, וחומצות isovaleric בצינורות. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של כל חומצה מוכנה לצינור המכיל 1.2 מיליליטר של 25 משקל / נפח אחוז חומצה מטא-זרחנית. ולהעמיס אותם לתוך בקבוק הדגימה של מכשיר כרומטוגרפיה גז כמו קוקטיילים סטנדרטיים.מוציאים את הצינורות מהצנטריפוגה, ומעבירים את העל-טבעיים לצינורות טריים. השתמש במזרק המצויד במסנן 0.22 מיקרון כדי לסנן את העל-טבעיים לצינורות חדשים לניתוח כרומטוגרפיה של גז. במחקר זה, הייצור של EPS ריר נצפתה בתרבויות bifidobacterium longum על צלחות PYG, לאחר דגירה אנאירובית במשך 72 שעות.צנטריפוגה של שריטות תרבות, ואחריו משקעים אתנול וייבוש, הביא אוסף של EPS דמוי תאית. ניתוח TLC גילה כי שיעור ההשפלה של עמילן על ידי מיקרוביוטה צואה אנושית היה מהיר יותר מזה של BIF EPS. ניתוח קואורדינטות ראשי מראה תרבות VI BIF, ותרבות VI קבוצות עמילן, מקובצים בנפרד זה מזה, המציין כי EPS וזמינות עמילן באופן דיפרנציאלי לעצב קהילות חיידקים צואה אנושית.ניתוח מפלה ליניארי על גודל האפקט מראה את סוג קולינסלה, coprococcus, parabacteroides, ו rhodopseudomonas היו באופן משמעותי יותר בשפע בתרבות VI BIF דגימות מאשר בתרבות VI דגימות עמילן. יתר על כן, מדידות GC מראות SCFAs שנמדדו מתרבויות תסיסה כללו אצטית, פרופיונית, isobutyric, butyric, isovaleric, וחומצות ולריות. לאחר תסיסה של 24 שעות ו-48 שעות, חמישה מתוך ששת ריכוזי SCFA היו דומים ולא שונים סטטיסטית בין התרבות VI BIF, עמילן תרבות VI וקבוצות תרבות VI.עם זאת, ריכוזי חומצה פרופריונית היו גבוהים באופן משמעותי בקבוצת התרבות VI BIF מאשר בקבוצת עמילן VI תרבות, לאחר 48 שעות של תסיסה. לעשות את הניסוי הזה בתנאים אנאירוביים, ולאחר מכן להעביר את הדגימות הקבועות לתוך אינקובטור אנאירובי בהקדם האפשרי. חלק מהריגנסים של TLC מסוכנים.אתה צריך להיות זהיר להשתמש בהם.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

רומן<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

באצווה מחוץ לגופית-מודל תרבות להעריך את ההשפעות של משטרי התערבותית על האדם מיקרוביוטה בצואה

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

המשך הדגירה של האינטראקציה התחרותית בין vibrio פישרי מבודד

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

ניתוח של הקבוצה הרביעית ויראלית שימוש במבחנה ובשיטות סיליקו

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...