Name: evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Proteinâ€“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique at JoVE.com

Deze studie werd deels gesteund door Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI subsidie nummer 17K09869 (to AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI subsidie nummer 15K09418 (TM), een onderzoeksbeurs van Kanehara Ichiro Medical Science Foundation en een onderzoeksbeurs van Suzuken Memorial Foundation (all to TM).

1. immunoprecipitatie
Opmerking: we gebruikten niet-natriumdodecylsulfaat (SDS) lysisbuffer en citraat elutie, zoals beschreven in de volgende secties. Het gebruik van een alternatieve in-House immunoprecipitatie-techniek kan echter ook van toepassing zijn voor het bereiden van LC-MS/MS-monsters.
<ol><li>Transfect gekweekte cellen met vectoren coderen van een epitoop tag alleen of een fusie-eiwit. Voor het verwerven van representatieve gegevens, overdracht J774 cellen (1 x 106) me...

<ol>
	<li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+protein+folding:+progress+and+methods.">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation.">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders.">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li><li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly.">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li><li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics.">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li><li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS/MS.">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li><li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes.">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry.">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li><li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing.">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li><li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems.">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling.">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing.">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li><li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6,+a+microtubule-stabilizing+protein,+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1.">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li><li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+elongation,+co-translational+folding+and+targeting.">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li><li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%+acetonitrile.">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li></ol>

We hebben eerder beschreven een analyse van de oxidatieve modificaties van apolipoproteïne B-100 in geoxideerde low-density lipoproteïne met behulp van LC-MS/MS voorafgegaan door een op-membraan spijsvertering techniek6. In de huidige studie, we combineerden deze techniek met immunoprecipitatie en hebben verschillende calpain-6-geassocieerde eiwitten geïdentificeerd. Deze nieuwe techniek vertegenwoordigt een handige methode voor het screenen van kandidaat-geassocieerde eiwitten. Calpain-6 is ee...

Hoewel eiwitten een constitutieve rol spelen in levende organismen, worden ze voortdurend gesynthetiseerd, verwerkt en afgebroken in de intracellulaire omgeving. Bovendien, intracellulaire eiwitten vaak fysiek en biochemisch interactie, die de functie van een of beide1,2,3beïnvloedt. Bijvoorbeeld, de directe binding van spliceosome-geassocieerde proteïne homo CWC22 met eukaryotische omzettings initiatie factor 4a3 (eIF4A3) is noodzakelijk voor de assemblage van de Exon Junction complex4. Consistent met deze, een eIF4A3 mutant die niet affiniteit voor CWC22 niet in slaagt om Exon Junction complex gestuurde mRNA splicing4te faciliteren. Zo is de studie van eiwit interacties cruciaal voor het precieze begrip van fysiologische regulering en van cellulaire functies.
Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) zijn toegepast op de uitgebreide analyse van eiwit-eiwit interacties. Bijvoorbeeld, de co-precipitatie van endogene eiwitten of exogenously introduceerde gelabelde eiwitten met hun geassocieerde eiwitten, gevolgd door MS-analyse, maakt de identificatie mogelijk van nieuwe eiwit interacties5. Een belangrijk knelpunt bij MS/MS-analyses is echter een slecht herstel van tryptische vergisters van eiwit monsters. Voor het uitvoeren van proteomische analyses op cellysaten worden in het algemeen in-gel en op membraan vergistings technieken gebruikt om MS/MS-monsters voor te bereiden. We hebben eerder een in-gel vergistings procedure vergeleken met een on-membraan vergistings techniek6, en toonden aan dat deze laatste gepaard ging met een betere sequentiedekking. Polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan kan geschikt zijn voor dit doel, omdat het mechanisch robuust en bestand is tegen hoge concentraties van organische oplosmiddelen7,8, waardoor de enzymatische vertering van geïmmobiliseerde eiwitten in aanwezigheid van 80% acetonitril9. Bovendien kan immobilisatie op een membraan conformationele veranderingen in doel eiwitten veroorzaken, wat leidt tot verbeteringen in de efficiëntie van tryptische spijsvertering10. Dienovereenkomstig hebben we in dit artikel het gebruik van Immunoprecipitation-LC/MS/MS-analyse van eiwit interacties beschreven met behulp van een verterings techniek op het membraan. Deze eenvoudige methode vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties, zelfs in niet-gespecialiseerde laboratoria.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Wako</td>
			<td>014-00386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-05525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNA</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNa AI</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads protein G</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>066-00461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiQ Sil C18W-3</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>E03-100-100</td>
			<td>0.10mmID * 100mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-02151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>018-21742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6507</td>
			<td>poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peptide standard</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>tBSA-04</td>
			<td>tryptic digests of bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP vial</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>03100S</td>
			<td>plastic sample tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cooctail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5034057</td>
			<td>software for protein identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Wako</td>
			<td>206-10731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trap column</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>A03-05-001</td>
			<td>0.5mmID * 1mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600 system</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4466015</td>
			<td>Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Wako</td>
			<td>207-06275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-21211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique

Talrijke intracellulaire eiwitten communiceren fysiek in overeenstemming met hun intracellulaire en extracellulaire omstandigheden. Inderdaad, cellulaire functies grotendeels afhangen van intracellulaire eiwit – eiwit interacties. Daarom is onderzoek met betrekking tot deze interacties onmisbaar om het begrijpen van fysiologische processen te vergemakkelijken. Co-precipitatie van geassocieerde eiwitten, gevolgd door massaspectrometrie (MS) analyse, maakt het mogelijk nieuwe eiwit interacties te identificeren. In deze studie hebben we details gegeven over de nieuwe techniek van Immunoprecipitation-vloeistofchromatografie (LC)-MS/MS-analyse in combinatie met on-membraan vertering voor de analyse van eiwit-eiwit interacties. Deze techniek is geschikt voor ruwe immunoprecipitanten en kan de doorvoer van proteomische analyses verbeteren. Gelabelde recombinant eiwitten werden neergeprecipiteerd met specifieke antilichamen; vervolgens werden immunoprecipitanten die op polyvinylideendifluoride membraan stukken werden geblopt, onderworpen aan reductieve alkylatie. Na trypsinisatie werden de verteerde proteïne residuen geanalyseerd met LC-MS/MS. met behulp van deze techniek, waren we in staat om verschillende kandidaat-geassocieerde eiwitten te identificeren. Deze methode is dus handig en nuttig voor de karakterisering van nieuwe proteïne-eiwit interacties.

Door middel van de hierboven beschreven procedure werden immunoprecipitanten geanalyseerd met LC-MS/MS (Figuur 1). Na de uitsluiting van exogenously afgeleide eiwitten (eiwitten van andere soorten en Igg's) werden 17 eiwitten geïdentificeerd in calpain-6-geassocieerde immunoprecipitanten (tabel 1) en 15 eiwitten werden geïdentificeerd in GFP-geassocieerde immunoprecipitanten ( Tabel 2). Van de calpain-6-en GFP-geassocieerde...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Proteinâ€“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique at JoVE.com

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Hier presenteren we een protocol voor een verterings techniek op membraan voor de bereiding van monsters voor massaspectrometrie. Deze techniek vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties.

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Onderzoek naar eiwit-eiwit interactie is onmisbaar voor het begrijpen van fysiologische processen op verschillende terreinen. In deze video introduceren we on-membraanverteringstechniek waarmee de onderzoekers op een handige manier een uitgebreide analyse van bindende eiwitten door MS kunnen uitvoeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de doorvoer van proteomische analyse voor ruwe immunoprecipitanten kunnen verbeteren omdat scheiding van eiwitten door polyacrylamide gel elektroforese niet nodig is.Begin met het vervoegen van het antilichaam aan de magnetische kralen, door het anti-GFP-antilichaam met de kralen te mengen in 500 microliter van citraatfosfaatbuffer. Draai het mengsel een uur bij 50 RPM bij kamertemperatuur. En was vervolgens de geconjugeerde kralen drie keer met citraatfosfaatbuffer met 1%polysorbate 20.Lyse transfected cellen volgens manuscript richtingen. Schraap de schotel en breng het lysaat in de 1,5 milliliter reageerbuis. Maak vervolgens vijf minuten het lysaat schoon door te centrifugeren bij 15,000 x g en verzamel de supernatant.Bereid ongelabelde magnetische kralen door ze drie keer te wassen met 500 microliter citraatfosfaatbuffer. Verwijder na de laatste wasbeurt de buffer en voeg de cellysaat toe aan de kralen. Draai het mengsel 30 minuten op kamertemperatuur bij 50 RPM.Voer magnetische scheiding uit op de magnetische standaard en verzamel het cellysaat. Om de doeleiwitten te binden aan de immunoglobuline geconjugeerde kralen, plaatst u de kralen gedurende vijf minuten op de magnetische standaard. Gooi de citrate buffer weg en voeg het cellysaat toe aan de kralen.Draai het mengsel gedurende een uur bij 50 RPM. Om doeleiwitten te scheiden van de vrije niet-doeleiwitten, was de kralen drie keer met 500 microliter citraatfosfaatbuffer met 1%polysorbate 20. Voeg na de laatste wasbeurt 30 microliter citraatbuffer toe en laat de kralen vijf minuten op kamertemperatuur zitten om de doeleiwitten te ontwijken.Om het membraan voor te bereiden, snijd PVDF membranen in 3 millimeter bij 3 millimeter stukken met behulp van chirurgische schaar die onmiddellijk voor gebruik werden gereinigd. Plaats de stukjes membraan op aluminiumfolie en voeg twee tot vijf microliter ethanol toe aan elk stuk. Voordat membranen volledig droog zijn, voeg twee tot vijf microliter van het eiwit eluent aan elk stuk en de lucht drogen totdat het membraanoppervlak wordt mat.Breng vervolgens membranen over in buizen van 1,5 milliliter en bewaar ze op vier graden Celsius. Voeg bij gebruik onmiddellijk twee tot 30 microliter ethanol toe, waardoor ze hydrofiel worden. Verwijder de ethanol met een pipet, maar voordat de membranen drogen, volledig toe te voegen 200 microliters van DTT-gebaseerde reactie oplossing aan elke buis, en incubeer ze op 56 graden Celsius gedurende een uur.Vervang na incubatie de reactieoplossing door 300 microliters iodoacetamide-oplossing en broed gedurende 45 minuten in het donker. Was vervolgens de membranen twee keer met gedestilleerd water en eenmaal met 2%acetonitril door minstens tien seconden te vortexen. Werken met diaphaneuze-gerelateerde acetonitril kan zeer gevaarlijk zijn.Een masker, bril en handschoenen moeten altijd worden gedragen bij het uitvoeren van de on-membraan spijsvertering procedure. Bereid trypsine volgens manuscript aanwijzingen, en voeg 100 microliters van trypsine reactie oplossing aan elk membraan. Incubeer 's nachts op 37 graden Celsius voor de spijsvertering.Breng de reactieoplossing de volgende dag over in een schone buis van 1,5 milliliter en voeg 100 microliter wasoplossingen toe aan het membraan. Broed het membraan twee uur lang in op 60 graden Celsius, verzamel vervolgens de wasoplossing en meng het met de reactieoplossing. Voeg nog eens 100 microliter wasoplossing toe aan het membraan en sonisch gedurende 10 minuten.Verzamel vervolgens de wasoplossing en meng deze met de reactieoplossing. Bedek de reageerbuis met een stuk laboratoriumfilm en maak kleine gaatjes in de film met een naald. Droog de oplossing met behulp van een vacuümconcentrator en los het residu op in 10 microliter van 2%mierenzuur.Centrifuge de buis op 12, 000 x g gedurende drie minuten, en breng de supernatant in een monsterbuis. Analyseer het monster met behulp van een massaspectrometer gekoppeld aan een nano LC/HPLC-systeem. Met behulp van dit protocol werden 17 eiwitten geïdentificeerd in de Calpain-6 geassocieerde immunoprecipitant, 15 in de GFP-geassocieerde immunoprecipitant, en 11 werden geïdentificeerd in beide.Het is belangrijk op te merken dat detectie van ten minste een high fidelity peptide fragment nodig is voor een positieve identificatie van een kandidaat-eiwit. Eiwitten die neergeslagen in de GFP-uitdrukkende lysaat evenals histonen, exogene en ribosomale eiwitten werden weggelaten uit de lijst. Het wassen van de membranen vóór tryptische spijsvertering met gedestilleerd water en 2%acetonitril is de belangrijkste stap in de procedure van on-membraanvertering over eiwitten.Volgens deze methode is het mogelijk om co-neerslag van doeleiwit te bevestigen door andere experimenten uit te voeren, zoals immunoprecipitatie en westerse vlekanalyse. Deze eenvoudige methode stelt de onderzoekers in staat om de nieuwe eiwit-eiwit interacties te verkennen met handige en hooggevoelige analyse.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

Proteomisch profiel van EPS-urine door FASP-vergisting en data-onafhankelijke analyse

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Studies van Chaperone-Cochaperone Interacties met behulp van Homogene Bead-Based Assay

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...