Name: evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00
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Este estudio fue apoyado en parte por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI Grant Number 17K09869 (a AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), una beca de investigación de Kanehara Ichiro Medical Science Foundation y una beca de investigación de Suzuken Memorial Foundation (todo a TM).

1. Inmunoprecipitación
NOTA: Utilizamos tampón de lisis dodecilo no sódico (SDS) y elución de citrato, como se describe en las secciones siguientes. Sin embargo, el uso de una técnica alternativa de inmunoprecipitación interna también puede ser aplicable para preparar muestras LC-MS/MS.
<ol><li>Células cultivadas transfectos con vectores que codifican una etiqueta de epítopos solo o una proteína de fusión. Para adquirir datos representativos, transfiera células J774 (1 x 106...

<ol>
	<li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+protein+folding:+progress+and+methods.">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation.">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders.">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li><li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly.">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li><li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics.">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li><li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS/MS.">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li><li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes.">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry.">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li><li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing.">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li><li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems.">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li><li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling.">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing.">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li><li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-6,+a+microtubule-stabilizing+protein,+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1.">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li><li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+elongation,+co-translational+folding+and+targeting.">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li><li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%+acetonitrile.">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li></ol>

Hemos descrito previamente un análisis de las modificaciones oxidativas de la apolipoproteína B-100 en lipoproteínas oxidadas de baja densidad utilizando LC-MS/MS precedida por una técnica de digestión en membrana6. En el presente estudio, combinamos esta técnica con la inmunoprecipitación y hemos identificado varias proteínas asociadas al calpain-6. Esta novedosa técnica representa un método conveniente de detección de proteínas asociadas a los candidatos. Calpain-6 es un miembro no p...

Aunque las proteínas desempeñan un papel constitutivo en los organismos vivos, se sintetizan, procesan y degradan continuamente en el entorno intracelular. Además, las proteínas intracelulares interactúan con frecuencia física y bioquímicamente, lo que afecta a la función de uno o ambos1,2,3. Por ejemplo, la unión directa del homólogo proteico asociado al esferoctico CWC22 con el factor de inicio de latraslación eucariota 4A3 (eIF4A3) es necesaria para el montaje del complejo de unión de exón 4. En consonancia con esto, un mutante eIF4A3 que carece de afinidad por CWC22 no facilita el empalme de ARNm impulsado por el complejo de cruces de exón4. Por lo tanto, el estudio de las interacciones proteicas es crucial para la comprensión precisa de la regulación fisiológica, así como de las funciones celulares.
Los avances recientes en espectrometría de masas (EM) se han aplicado al análisis exhaustivo de las interacciones proteína-proteína. Por ejemplo, la co-precipitación de proteínas endógenas o proteínas etiquetadas introducidas exógenamente con sus proteínas asociadas, seguida según el análisis de la EP, permite la identificación de nuevas interacciones proteicas5. Sin embargo, uno de los principales cuellos de botella del análisis de la SM/MS es la mala recuperación de los resúmenes trípticos de las muestras de proteínas. Para realizar análisis proteómicos en los lysatos celulares, generalmente se emplean técnicas de digestión en gel y en membrana para preparar muestras de MS/MS. Hemos comparado previamente un procedimiento de digestión en gel con una técnica de digestión en la membrana6, y hemos demostrado que este último se asoció con una mejor cobertura de secuencia. La membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) puede ser adecuada para este fin, ya que es mecánicamente robusta y resistente a altas concentraciones de disolventes orgánicos7,8, lo que permite la digestión enzimática de inmovilizados proteínas en presencia de 80% acetonitrilo9. Además, la inmovilización en una membrana puede inducir cambios de conformación en las proteínas diana, lo que conduce a mejoras en la eficiencia de la digestión tríptica10. En consecuencia, en este artículo, hemos descrito el uso del análisis de inmunoprecipitación-LC/MS/MS de interacciones proteicas utilizando una técnica de digestión en la membrana. Este sencillo método facilita el análisis conveniente de las interacciones proteína-proteína incluso en laboratorios no especializados.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Wako</td>
			<td>014-00386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-05525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNA</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiNa AI</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td></td>
			<td>nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>14112-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads protein G</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>066-00461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiQ Sil C18W-3</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>E03-100-100</td>
			<td>0.10mmID * 100mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-02151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>018-21742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6507</td>
			<td>poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peptide standard</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>tBSA-04</td>
			<td>tryptic digests of bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP vial</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>03100S</td>
			<td>plastic sample tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cooctail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5034057</td>
			<td>software for protein identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Wako</td>
			<td>206-10731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trap column</td>
			<td>KYA Tech Co.</td>
			<td>A03-05-001</td>
			<td>0.5mmID * 1mmL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600 system</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4466015</td>
			<td>Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Wako</td>
			<td>207-06275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-21211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of protein&#8211;protein interactions using an on-membrane digestion technique

Numerosas proteínas intracelulares interactúan físicamente de acuerdo con sus circunstancias intracelulares y extracelulares. De hecho, las funciones celulares dependen en gran medida de las interacciones proteína-proteína intracelular. Por lo tanto, la investigación sobre estas interacciones es indispensable para facilitar la comprensión de los procesos fisiológicos. La co-precipitación de proteínas asociadas, seguida de un análisis de espectrometría de masas (EM), permite la identificación de nuevas interacciones proteicas. En este estudio, hemos proporcionado detalles de la novedosa técnica de la cromatografía inmunoprecipitada-líquido (LC)-MS/MS combinado con la digestión en la membrana para el análisis de interacciones proteína-proteína. Esta técnica es adecuada para inmunoprecipitados crudos y puede mejorar el rendimiento de los análisis proteómicos. Las proteínas recombinantes etiquetadas se precipitaron utilizando anticuerpos específicos; a continuación, los inmunoprecipitados borrados en piezas de membrana de difluoruro de polivinilideno fueron sometidos a alquilación reductiva. Después de la tripinización, los residuos de proteínas digeridas se analizaron utilizando LC-MS/MS. Usando esta técnica, pudimos identificar varias proteínas asociadas candidatas. Por lo tanto, este método es conveniente y útil para la caracterización de nuevas interacciones proteína-proteína.

Mediante el procedimiento descrito anteriormente, se analizaron los inmunoprecipitantes utilizando LC-MS/MS (Figura1). Después de la exclusión de proteínas derivadas exógenamente (proteínas de otras especies e IgG), se identificaron 17 proteínas en inmunoprecipitantes asociados con calpato-6 (Tabla 1) y se identificaron 15 proteínas en inmunoprecipitantes asociados a la PTF ( Tabla 2). De las proteínas asociadas al ca...

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Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Aquí, presentamos un protocolo para una técnica de digestión en la membrana para la preparación de muestras para espectrometría de masas. Esta técnica facilita el análisis conveniente de las interacciones proteína-proteína.

Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Investigar la interacción proteína-proteína es indispensable para comprender los procesos fisiológicos en varios campos. En este vídeo introducimos la técnica de digestión en la membrana que permite a los investigadores realizar un análisis exhaustivo de las proteínas de unión por LA MS de una manera conveniente. La principal ventaja de esta técnica es que podemos mejorar el rendimiento del análisis proteómico para inmunoprecipitantes crudos porque no es necesaria la separación de proteínas por electroforesis de gel de poliacrilamida.Comience a conjugar el anticuerpo con las perlas magnéticas, mezclando el anticuerpo anti-GFP con las perlas en 500 microlitros de tampón de fosfato de citrato. Gire la mezcla a 50 RPM durante una hora a temperatura ambiente. Y luego lavar las cuentas conjugadas tres veces con tampón de fosfato de citrato que contiene 1%polisorbato 20.Lyse células trans infectadas de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Raspa el plato y transfiere el izado al tubo de ensayo de 1,5 mililitros. A continuación, despeje el izado centrifugando a 15.000 x g durante cinco minutos y recoja el sobrenadante.Preparar perlas magnéticas sin etiqueta lavándolas tres veces con 500 microlitros de tampón de fosfato de citrato. Después del lavado final, retire el búfer y agregue el lysate de la célula a las cuentas. Gire la mezcla a 50 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente.Realice la separación magnética en el soporte magnético y recoja el lysate celular. Para unir las proteínas diana a las perlas conjugadas de inmunoglobulina, coloque las perlas en el soporte magnético durante cinco minutos. Deseche el búfer de citrato y agregue el lysate de celda a las cuentas.Gire la mezcla durante una hora a 50 RPM. Para separar las proteínas diana de las proteínas libres no objetivo, lave las cuentas tres veces con 500 microlitros de tampón de fosfato de citrato que contienen 1%polisorbato 20. Después del lavado final, agregue 30 microlitros de tampón de citrato, y deje que las cuentas se sienten durante cinco minutos a temperatura ambiente para eluir las proteínas diana.Para preparar la membrana, corte las membranas PVDF en piezas de 3 milímetros por 3 milímetros utilizando tijeras quirúrgicas que se limpiaron inmediatamente antes de su uso. Coloque las piezas de membrana sobre papel de aluminio y agregue dos a cinco microlitros de etanol a cada pieza. Antes de que las membranas estén completamente secas, agregue dos a cinco microlitros de la proteína eluyentes a cada pieza y séquelos al aire hasta que la superficie de la membrana se vuelva mate.Luego transfiera las membranas a tubos de 1,5 mililitros y guárdelas a cuatro grados centígrados. Si se utiliza inmediatamente, añadir de dos a 30 microlitros de etanol que los hará hidrófilos. Retire el etanol con una pipeta, pero antes de que las membranas se sequen, agregue completamente 200 microlitros de solución de reacción a base de TDT a cada tubo, e incubarlos a 56 grados centígrados durante una hora.Después de la incubación, sustituya la solución de reacción por 300 microlitros de solución de iodoacetamida e incubar en la oscuridad durante 45 minutos. A continuación, lave las membranas dos veces con agua destilada y una vez con 2% de acetonitrilo por vórtice durante al menos diez segundos. Trabajar con acetonitrilo diáfano puede ser extremadamente peligroso.Siempre se debe usar una máscara, gafas y guantes al realizar el procedimiento de digestión en la membrana. Preparar la trippsina de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y añadir 100 microlitros de solución de reacción de trippsina a cada membrana. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados para la digestión.Al día siguiente, transfiera la solución de reacción a un tubo limpio de 1,5 mililitros y añada 100 microlitros de soluciones de lavado a la membrana. Incubar la membrana a 60 grados centígrados durante dos horas, luego recoger la solución de lavado y mezclarla con la solución de reacción. Añadir otros 100 microlitros de solución de lavado a la membrana y sonicar durante 10 minutos.A continuación, recoja la solución de lavado y mezcle con la solución de reacción. Cubra el tubo de ensayo con una pieza de película de laboratorio y haga pequeños agujeros en la película con una aguja. Seque la solución con un concentrador de vacío y disuelva el residuo en 10 microlitros de ácido fórmico al 2%.Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante tres minutos y transfiera el sobrenadante a un tubo de muestra. Analice la muestra utilizando un espectrómetro de masas vinculado a un sistema nano LC/HPLC. Con este protocolo, se identificaron 17 proteínas en el inmunoprecipitante asociado Calpain-6, 15 en el inmunoprecipitante asociado a la GFP y 11 en ambos.Es importante tener en cuenta que la detección de al menos un fragmento de péptido de alta fidelidad es necesaria para la identificación positiva de una proteína candidata. Las proteínas que se precipitaron en el lisolato que expresa la GFP, así como las histonas, las proteínas exógenas y ribosomales se omitieron de la lista. Lavar las membranas antes de la digestión tríptica con agua destilada y 2%acetonitrilo es el paso más importante en el procedimiento de digestión en membrana sobre las proteínas.Siguiendo este método, es posible confirmar la co-precipitación de la proteína diana mediante la realización de otros experimentos, como la inmunoprecipitación y el análisis de manchas occidentales. Este sencillo método permite a los investigadores explorar las nuevas interacciones proteína-proteína con análisis convenientes y altamente sensibles.

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Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

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Un método eficaz para la síntesis de peptoides con monómeros de tipo mixto lisina / arginina del tipo y la evaluación de su actividad anti-Leishmania

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