Name: development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية، ومشروع هاتش 1016879، ومحطة ماريلاند للتجارب الزراعية عن طريق منحة MAES رقم 2956952.

1. إعداد منحنى الجرعة لتحول فعال
<ol><li>نقع 100 بذور مع النمط الجيني من الاهتمام في ستة قوارير زجاجية 250 مل (100 في كل قارورة) تحتوي على 50 مل من الماء المقطر. يهز في 100 دورة في الدقيقة لمدة 8 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) لimbibition من البذور.</li>
	<li>في غطاء الدخان، إعداد 50 مل من 0.4٪، 0.6٪، 0.8٪، 1.0٪، و 1.2٪ (ث / خم?...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+screening+for+induced+mutations.">Targeted screening for induced mutations.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).</li><li>Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Recovery+of+Mutations+in+Drosophila.">Targeted Recovery of Mutations in Drosophila.</a> Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rare+Mutations+in+Populations:+TILLING+by+Sequencing.">Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing.</a> Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).</li><li>Caldwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structured+mutant+population+for+forward+and+reverse+genetics+in+Barley+(Hordeum+vulgare+L.).">A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.).</a> The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).</li><li>Hazard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Mutations+in+the+Starch+Branching+Enzyme+II+(+SBEII+)+Genes+Increase+Amylose+and+Resistant+Starch+Content+in+Durum+Wheat.">Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat.</a> Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diploid+wheat+TILLING+resource+for+wheat+functional+genomics.">A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics.</a> BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILL-D:+An+Aegilops+tauschii+TILLING+Resource+for+Wheat+Improvement.">TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Fhb1+encodes+a+chimeric+lectin+with+agglutinin+domains+and+a+pore-forming+toxin-like+domain+conferring+resistance+to+Fusarium+head+blight.">Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight.</a> Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).</li><li>Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+spring+hexaploid+wheat+line+with+no+functional+VRN2+genes.">Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).</li><li>Greene, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Chemically+Induced+Mutations+From+a+Large-Scale+Reverse-Genetic+Screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).</li><li>Harwood, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+remaining+challenges+in+the+transformation+of+barley+and+wheat.">Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).</li><li>Henikoff, S., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Nucleotide+Mutations+for+Plant+Functional+Genomics.">Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics.</a> Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).</li><li>Uauy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+TILLING+approach+to+detect+induced+mutations+in+tetraploid+and+hexaploid+wheat.">A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).</li><li>Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Traditional+Mutagenesis+with+New+High-Throughput+Sequencing+and+Genome+Editing+to+Reveal+Hidden+Variation+in+Polyploid+Wheat.">Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat.</a> Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequences+of+1504+Mutants+in+the+Model+Rice+Variety+Kitaake+Facilitate+Rapid+Functional+Genomic+Studies.">The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies.</a> The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+Mutant+Resource+as+an+Efficient+Platform+for+Gene+Discovery+in+Grasses.">A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses.</a> The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).</li><li>Krasileva, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+hidden+variation+in+polyploid+wheat.">Uncovering hidden variation in polyploid wheat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).</li><li>Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+TILLING+Method+for+Wheat+Breeding.">A Modified TILLING Method for Wheat Breeding.</a> The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).</li><li>Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+TILLING+and+Ecotilling+in+plants+and+animals.">A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).</li><li>Wu, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-+and+Irradiation-induced+Mutants+of+Indica+Rice+IR64+for+Forward+and+Reverse+Genetics.">Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics.</a> Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).</li><li>Feldman, M., Levy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Evolution+Due+to+Allopolyploidization+in+Wheat.">Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat.</a> Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).</li><li>Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+and+disadvantages+of+being+polyploid.">The advantages and disadvantages of being polyploid.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Efficient+Mutation+Resource+with+Phenotypic+Variation+in+Hexaploid+Winter+Wheat+and+Identification+of+Novel+Alleles+in+the+TaAGP.L-B1+Gene.">Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li><li>Rakszegi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+agronomic+and+morphological+traits+in+a+mutant+population+of+bread+wheat+studied+in+the+Healthgrain+program.">Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program.</a> Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).</li><li>Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilling+by+Sequencing.">Tilling by Sequencing.</a> Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).</li></ol>

TILLING هو أداة وراثية عكسية قيمة للغاية للتحقق من الجينات، وخاصة بالنسبة للحبوب الصغيرة حيث النهج القائمة على التحول لديها اختناقات خطيرة11. تطوير السكان المتحولين مع تردد طفرة عالية هي واحدة من الخطوات الحاسمة في إجراء دراسات الجينوم الوظيفية. الخطوة الأكثر أهمية في تطوير الس?...

يمكن أن تخدم الطفرات نقطة في الجينوم العديد من الأغراض المفيدة للباحثين. اعتمادا على طبيعتها وموقعها، يمكن استخدام هذه الطفرات لتعيين وظائف للجينات أو حتى مجالات متميزة من البروتينات ذات الأهمية. ومن ناحية أخرى، يمكن اختيار الطفرات المفيدة، كمصدر للتباين الجيني الجديد، للصفات المرغوبة باستخدام شاشات النماذج الظاهرية وزيادة استخدامها في تحسين المحاصيل. TILLING هو أداة قوية عكس علم الوراثة التي تشمل الطفرات الكيميائية والكشف عن اختلاف التسلسل في الجين المستهدف. وضعت لأول مرة في أرابيدوبسي1 ودروسوفيليا melanogaster2، وقد تم تطوير السكان TILLING واستخدامها في العديد من محاصيل الحبوب الصغيرة مثل القمح الخبز سداسية(Triticum aestivum)3، الشعير(Hordeum vulgare)4، القمح القاسي رباعي الأرجل (T.dicoccoides durum)5، القمح ثنائي الديلويد (T.monococcum)6 و "D" جينوم السلف من القمح Aegilops tauschii7 . وقد استخدمت هذه الموارد للتحقق من أدوار الجينات في تنظيماللاأحيائي والحيوي تحمل الإجهاد 8، وتنظيم وقت المزهرة9،وتطوير أصناف المحاصيل متفوقة من الناحية التغذوية5.
الحرث، جنبا إلى جنب مع استخدام العوامل المطفرة الألكيلات مثل ميثانسولفونات الإيثيل (EMS)، أزيد الصوديوم، N-ميثيل-N-nitrosourea (MNU)، وميثانسولفونات الميثيل (MMS)، له مزايا على غيرها من أدوات علم الوراثة العكسيلعدة أسباب. أولا، يمكن إجراء الطفرات على أي نوع تقريبا أو مجموعة متنوعة من النبات10 ومستقلة عن عنق الزجاجة التحول، وهو أمر صعب بشكل خاص في حالة الحبوب الصغيرة11. ثانيا، بالإضافة إلى توليد الطفرات بالضربة القاضية التي يمكن الحصول عليها من خلال نهج التحقق من صحة الجينات الأخرى، يمكن أن يسبب مجموعة من الطفرات الخاطئة والربط، والتي يمكن تمييز وظائف المجالات الفردية للبروتينات ذات الأهمية12. وعلاوة على ذلك، تولد TILLING مجموعة خالدة من الطفرات في جميع أنحاء الجينوم. وبالتالي، يمكن استخدام مجموعة واحدة للتحقق الوظيفي من الجينات المتعددة. وعلى النقيض من ذلك، فإن أدوات وراثية عكسية أخرى تولد موارد خاصة بالجين فقط تحت الدراسة13. ويمكن نشر الطفرات المفيدة التي يتم تحديدها من خلال TILLING لأغراض التكاثر ولا تخضع للتنظيم، على عكس تحرير الجينات، التي لا يزال تصنيفها غير المعدل وراثيا غير مؤكد في العديد من البلدان. هذا يصبح [توين تو] بشكل خاصّ إلى حبات صغيرة أنّ يكون دوليّا يتاجر14.
الحرث هو استراتيجية بسيطة وفعالة للتحقق من الجينات ويتطلب السكان المتحولين لتطوير هافة الجينات ذات الأهمية. إن تطوير مجموعة سكانية فعالة من المتحولين أمر أساسي لتحديد كفاءة دراسة التحقق من صحة الجينات المستندة إلى TILLING. ويشير عدد السكان الذين يعانون من انخفاض معدل الطفرة الإجمالية إلى أنه يجب فحص عدد كبير من السكان بشكل غير عملي بحثاً عن الطفرات المطلوبة، في حين أن ارتفاع تركيز الطفرات يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات بين السكان وعدم كفاية عدد السكان. الأفراد المتحولين. وبمجرد تطوير مجموعة جيدة من السكان، هناك طرق متعددة للكشف عن الطفرات في الجينات ذات الأهمية، ويعتمد اختيار المنصة على النطاق التجريبي وتوافر الموارد. وقد استخدم تسلسل الجينوم كله وتسلسل exome لتوصيف جميع الطفرات في مجموعات TILLING في النباتات مع الجينوم الصغيرة15،16. وقد تم تنفيذ تسلسل Exome من اثنين من السكان TILLING في الخبز والقمح القاسي ومتاح للجمهور لتحديد الطفرات المرغوب فيها وترتيب خطوط متحولة من الفائدة17. وهو مورد عام كبير من حيث توافر الطفرات المستصوبة؛ ومع ذلك، في دراسات التحقق من صحة الجينات، يجب أن يمتلك خط من النوع البري الجين المرشح للاهتمام. ولسوء الحظ، لا يزال من الباهظ التكلفة تسلسل الإكسوتومي من جميع سكان TILLING للتحقق من صحة الجينات العكسية القائمة على علم الوراثة لعدد قليل من الجينات المرشحة في خلفية أخرى. وقد استخدمت تسلسل Amplicon والاختبارات المستندة إلى Cel-1 في الكشف عن الطفرات في السكان المستهدفين في القمح، وCel-1 الاختبارات هي أبسط، لا تتطلب أي معرفة حسابية، ومناسبة بشكل خاص للتحقق من صحة عدد صغير من الجينات مع الأساسية معداتالمختبر 6،18.
في هذه المقالة، وصفت هي أساليب لتطوير السكان TILLING جيدة، بما في ذلك إعداد منحنى الجرعة، والمتحولين والحفاظ على السكان متحولة، وفحص السكان المتحولين باستخدام اختبار Cel-1 المستندة إلى PCR . وقد تم بالفعل تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح في تطوير واستخدام السكان المتحولين من Triticum aestivum، Triticum monoccocum6، الشعير ، Aegilops tauchii7، والعديد من الاخرين. وشملت تفاصيل صريحة من هذه الأساليب جنبا إلى جنب مع نصائح مفيدة من شأنها أن تساعد الباحثين على تطوير السكان TILLING، وذلك باستخدام EMS كمغيرة في أي مصنع الحبوب الصغيرة من الاختيار.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well 1.1 ml microtubes in microracks</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>TN0946-08R</td>
			<td>For collecting leaf tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0710-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosprint 96 DNA Plant Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>941558</td>
			<td>Kit for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-1 endonuclease</td>
			<td>Extracted as described by Till et al 2006</td>
			<td></td>
			<td>Single strand specific endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-0880-25G</td>
			<td>EMS, Chemical mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry/Shell freeze system</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>For lyophilization of leaf tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kingfisher Flex purification system</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>5400610</td>
			<td>High throughput DNA extraction robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius gel imaging system</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbit Environ-shaker</td>
			<td>Lab-line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROstar Nano</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Nano drop for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis

استهداف الآفات المحلية المستحثة في الجينوم (TILLING) هو أداة قوية للجينات العكسية التي تشمل الطفرات الكيميائية والكشف عن اختلاف التسلسل في الجينات المستهدفة. TILLING هو أداة علم الجينوم وظيفية قيمة للغاية للتحقق من الجينات، وخاصة في الحبوب الصغيرة التي تتبع النهج القائمة على التحول قيود خطيرة. إن تطوير مجموعة سكانية قوية من المتحولين أمر أساسي لتحديد كفاءة دراسة التحقق من صحة الجينات المستندة إلى TILLING. ويشير عدد السكان الذين يعانون من انخفاض معدل الطفرة الإجمالية إلى أنه يجب فحص عدد كبير من السكان بشكل غير عملي للعثور على الطفرات المطلوبة، في حين أن ارتفاع تركيز الطفرات يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات بين السكان، مما يؤدي إلى عدم كفاية عدد الأفراد المتحولين. وبمجرد تطوير مجموعة سكانية فعالة، هناك طرق متعددة للكشف عن الطفرات في جين ذي أهمية، ويعتمد اختيار المنصة على النطاق التجريبي وتوافر الموارد. إن منهج Cel-1 القائم على الجل والجيل من الأغاروز لتحديد المتحولين مناسب، ويمكن استنساخه، ومنصة أقل كثافة في استخدام الموارد. ومن المفيد من حيث أنها بسيطة، لا تتطلب أي معرفة حسابية، وأنها مناسبة بشكل خاص للتحقق من صحة عدد صغير من الجينات مع معدات المختبر الأساسية. في هذه المقالة، هي طرق لتطوير السكان TILLING جيدة، بما في ذلك إعداد منحنى الجرعة، والمتحولين والحفاظ على السكان متحولة، وفحص السكان المتحولين باستخدام اختبار Cel-1 المستندة إلى PCR .

الشكل 2 يظهر منحنى الجرعة من سداسي ة القمح القمح المستعمر جاغر، القمح ثنائي الديبلويد Triticum monococcum6، ومانح الجينوم من القمح Aegilops tauschii7. وكانت جرعات EMS لمعدلات البقاء على قيد الحياة 50٪ المطلوب حوالي 0.25٪، 0.6٪ و 0.7٪ لT. monococcum?...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

وصف هو بروتوكول لتطوير الآفات المحلية المستحثة المستهدفة في الجينوم (TILLING) السكان في محاصيل الحبوب الصغيرة مع استخدام ميثانسولفونات إيثيل (EMS) كمغير. كما يتم توفير بروتوكول للكشف عن الطفرات باستخدام SCel-1.

تطوير استهداف الآفات المحلية المستحثة في الجينوم (TILLING) السكان في محاصيل الحبوب الصغيرة من قبل الطفرات ميثانسولفونات إيثيل

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

ويفصّل هذا البروتوكول تطور مجموعات حراثة قوية ذات ترددات طفرات عالية عن طريق التطفّل المُتَمَرَسّيّة في محاصيل الحبوب الصغيرة. ويمكن استخدام مجموعات حراثة في علم الجينوم الوظيفي، وكذلك لاكتشاف جينات الفضاء الجينية في محاصيل الحبوب الصغيرة. السكان الحرث المتقدمة باستخدام هذه التقنية لديها ترددات الطفرة العالية، ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي نوع جيني.يمكن إجراء الكشف عن الطفرات القائمة على Cel-1 باستخدام معدات المختبر الأساسية. الخطوة الأكثر أهمية هي تحديد التركيز الأمثل EMS. ولذلك, ينبغي إجراء منحنى جرعة EMS خصيصا للسكان الفردية.للبدء، نقع 100 البذور مع النمط الجيني من الاهتمام في كل من 250 250 ملليلتر قارورة الزجاج، التي تحتوي على 50 ملليلتر من الماء المقطر. يهز في 100 دورة في الدقيقة لمدة ثماني ساعات في درجة حرارة الغرفة لibmbibition. ثم, في غطاء الدخان, إعداد 50 ملليلتر من حلول EMS من خمسة تركيزات مختلفة عن طريق خلط السائل EMS والمياه المقطرة.بعد التذمر، اُخرج الماء من خمس قارورات. إضافة 50 ملليلتر من حل EMS في كل من القارورة الخمسة التي تحتوي على البذور الممدودة. هز القارورة لمدة 16 ساعة عند 75 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة.الآن، decant حل EMS في زجاجة نفايات فارغة وصب البذور المعالجة على قماش الجبن وضعت على زجاجة نفايات فارغة لجمع بشكل منفصل لكل معالجة. استخدام المياه الزائدة للمساعدة في صب البذور. أيضا، رش عدة ملليلترات من محلول EMS المعطل على جدار القارورة الملوثة.وتزج نصائح الماصات المستخدمة في الحل لمدة 24 ساعة. غير نشط في حل EMS المستخدمة عن طريق إضافة وحدة تخزين واحدة من محلول تعطيل EMS لعلاج لمدة 24 ساعة. باستخدام ربطة عنق تطور، عقد البذور EMS المعالجة داخل قماش الجبن وغسل تحت مياه الصنبور الجارية لمدة ساعتين.بعد الغسيل، وزرع كل البذور على حدة في المدربين الجذر التي تحتوي على التربة بوتينغ. تنمو النباتات في 20 إلى 25 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ضوء. بعد 15 يوما من زرع، والتحقق من النباتات، وعدد من البذور التي فشلت في الإنبات.بيانات تسجيل بقاء النبات. إذا كان معدل البقاء على قيد الحياة ليس ضمن 40 إلى 60٪ إجراء جولة ثانية من تحسين الجرعة مع تركيز معدلة حتى تحقيق معدل الفتك المطلوب من 40 إلى 60٪ بعد تجربة الطفرات، وجمع الأنسجة ورقة من النباتات M2 في 96 جيدا مربع جمع الأنسجة. يتم جمع الأنسجة من النباتات M2 التي كانت تزرع من النباتات M1 الذاتي.يتم عرض مصنع M2 واحد من كل مصنع M1. استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي النباتي مع نظام تنقية الحمض النووي بعد توصيات الشركة المصنعة. ثم، تحميل اثنين microliters من استخراج الحمض النووي في لوحات LV مع 16 فتحات.كمي الحمض النووي باستخدام مقياس طيفي عند أطوال موجية من 260 و 280 نانومتر. تخفيف تركيز الحمض النووي إلى 25 نانوغرام لكل ميكرولتر مع المياه الخالية من النوى. إنشاء أربع مرات برك الحمض النووي من 200 ميكرولترات من خلال الجمع بين الحمض النووي من كل بئر في أربع كتل بئر 96 في لوحة تجمع مع الحفاظ على هوية الصف والعمود من كل عينة.بعد ذلك، قم بإعداد أنبوب خلط رئيسي لـ PCR لـ التمهيديات الخاصة بالجينات عن طريق إضافة إلى كل مخزن مؤقت PCR في الأنبوب، والتمهيدي الأمامي والعكوس، وبوليمرات الحمض النووي وفقًا للمخطوطة. Aliquot مزيج سيد في آبار 96 جيدا لوحة PCR. ثم، إضافة قالب الحمض النووي تجمع.قم بتحميل أنابيب PCR في دورة حرارية، واستخدم ملف تعريف هبوط لتشغيل تفاعل PCR على الدورة الحرارية. لتوليد heteroduplexes بين DNAs غير متطابقة، احتضان منتجات PCR في دورة الحرارية في برنامج مختلف. ثم، إضافة 2.5 ميكرولتررس من endonuclease Cel-1 محلية الصنع إلى كل من المنتجات PCR غير المتغايرة.احتضان لمدة 45 دقيقة في 45 درجة مئوية. بعد ذلك، إنهاء رد فعل Cel-1 بإضافة 2.5 ميكرولترات من 0.5 EDTA المول في ثماني درجة ا.ف. تحميل 30.5 ميكرولترات من كل منتج علاج Cel-1 مختلطة مع خمسة microliters من صبغ على جل agarose 3 ٪ وتشغيلها في 100 فولت لمدة ساعتين ونصف.لdevolonvolute برك متحولة، وتحديد zygosity من المسوخ عن طريق تشغيل اثنين من ردود الفعل PCR للحمض النووي M2 الفردية التي يحتوي التفاعل الأول 2.5 ميكرولترات من الحمض النووي M2 و 2.5 ميكرولترات من الحمض النووي من النوع البرية والتفاعل الثاني يحتوي فقط على خمسة ميكرولترات من الحمض النووي M2. ويبين هذا البروتوكول أن التبّح النظم البيئية هي التي تُعدّ من محاصيل الحبوب الصغيرة وتوصيف المُتحولين. منحنى الجرعة يشير إلى جرعات EMS الأمثل لمعدلات البقاء على قيد الحياة 50٪ المطلوبة لثلاثة أنواع مختلفة من القمح.إن وجود أنماط ظاهرية يمكن التعرف عليها بسهولة في السكان M2 يؤكد فعالية الطفرات في مجموعات الحبوب الصغيرة. وفيما يلي أربعة أمثلة على الأنماط الظاهرية المتحولة في مجموعات M2 تهيّف، متحولة المهق في مجموعة الشعير M2، متحولة كلوريد في سكان الشعير M2، متحولة مُتبدّرة مع تلون وردي في مجموعة Aegilops tauschii M2، ومتحول منخفض الحرث في مجموعة من المكورات التكرومية ثلاثية اللوكتوماتية M2. يُظهر تحديد متحول باستخدام Cel-1 على منصات هلام agarose بركة متحولة محتملة تم تحديدها من أصل 12 تجمعًا متحولًا بواسطة نطاقات مشقوقة فريدة.وحدد إلغاء الفبركات المتحولة zygosity الطفرة وساعد على تتبع الطفرة وصولا الى عينات فردية. وكان تجمع A4 طفرات غير متغايرة، المشار إليها من قبل العصابات مشقوق في كل من الإطار 4 ومربع 4 عينات الحمض النووي من النوع البري. احتوى تجمع H5 على طفرات هُموزيغوس لأن النطاقات المشقوقة الفريدة كانت موجودة فقط في عينة الحمض النووي من النوع البري في المربع 5 H5.الخطوة الأكثر أهمية هي تحديد التركيز الأمثل من EMS لتحقيق معدل 40 إلى 60٪ من الفتك. مرة واحدة في مجال حراثة السكان مع ارتفاع تردد الطفرة وقد تم تطويرها يمكن استخدامها في توصيف وظيفي لأي جين من الاهتمام. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون السكان مصدراً للتباين الوراثي المفيد لتحسين المحاصيل.وقد استخدمت الحرث على نطاق واسع لإجراء دراسات الجينوم الوظيفية في النباتات النموذجية والمحاصيل. يمكن أن تكون مجموعة الطفرات التي تم الحصول عليها من الأخطاء أو الضربات القاضية أو أشكال الصمت أو حتى أشكال الأخطاء. EMS هو مطفرة.لذلك، استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء التعامل مع EMS. إزالة التلوث بقايا الحلول وتستخدم نصائح الماصات.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

التجديد الكلى في اسماك الزرد الكبار قبل جنتاميسين المستحثة الإصابات

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

تطوير متليفة الكبد نموذج الناجم عن الإيثانول في الزرد لدراسة السلف بوساطة الخلايا الكبدية التجديد

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

خلية "التجميع فحوصات" لتقييم ربط الشق المورفولوجية مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

نموذج تأثير القشرية الخاضعة للرقابة لإصابة الدماغ الماوس مع زرع العلاجية من الخلايا العصبية المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

استهداف الصفائح العصبية الفئرانية بواسطة حقن النانو في الرحم (NEPTUNE) في اليوم الجنيني 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...