Name: development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Project 1016879 og Maryland Agricultural eksperiment Station via MAES Grant No. 2956952.

1. klargøring af doserings kurven for effektiv mutagenese
<ol><li>Soak 100 frø med genotype af interesse i 6 250 mL glaskolber (100 i hver kolbe) indeholdende 50 mL destilleret vand. Ryst ved 100 rpm i 8 timer ved stuetemperatur (RT) for opsugning af frøene.</li>
	<li>I en røg hætte, forberede 50 mL af 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0%, og 1,2% (w/v) ethyl methanesulfonat (EMS) opløsning ved at opløse 0,167, 0,249, 0,331, 0,415, og 0,498 mL EMS i destilleret vand, hhv. Bemærk: EMS er flydende ved RT med en densitet på...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+screening+for+induced+mutations.">Targeted screening for induced mutations.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).</li><li>Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Recovery+of+Mutations+in+Drosophila.">Targeted Recovery of Mutations in Drosophila.</a> Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rare+Mutations+in+Populations:+TILLING+by+Sequencing.">Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing.</a> Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).</li><li>Caldwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structured+mutant+population+for+forward+and+reverse+genetics+in+Barley+(Hordeum+vulgare+L.).">A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.).</a> The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).</li><li>Hazard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Mutations+in+the+Starch+Branching+Enzyme+II+(+SBEII+)+Genes+Increase+Amylose+and+Resistant+Starch+Content+in+Durum+Wheat.">Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat.</a> Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diploid+wheat+TILLING+resource+for+wheat+functional+genomics.">A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics.</a> BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILL-D:+An+Aegilops+tauschii+TILLING+Resource+for+Wheat+Improvement.">TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Fhb1+encodes+a+chimeric+lectin+with+agglutinin+domains+and+a+pore-forming+toxin-like+domain+conferring+resistance+to+Fusarium+head+blight.">Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight.</a> Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).</li><li>Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+spring+hexaploid+wheat+line+with+no+functional+VRN2+genes.">Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).</li><li>Greene, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Chemically+Induced+Mutations+From+a+Large-Scale+Reverse-Genetic+Screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).</li><li>Harwood, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+remaining+challenges+in+the+transformation+of+barley+and+wheat.">Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).</li><li>Henikoff, S., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Nucleotide+Mutations+for+Plant+Functional+Genomics.">Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics.</a> Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).</li><li>Uauy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+TILLING+approach+to+detect+induced+mutations+in+tetraploid+and+hexaploid+wheat.">A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).</li><li>Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Traditional+Mutagenesis+with+New+High-Throughput+Sequencing+and+Genome+Editing+to+Reveal+Hidden+Variation+in+Polyploid+Wheat.">Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat.</a> Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequences+of+1504+Mutants+in+the+Model+Rice+Variety+Kitaake+Facilitate+Rapid+Functional+Genomic+Studies.">The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies.</a> The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+Mutant+Resource+as+an+Efficient+Platform+for+Gene+Discovery+in+Grasses.">A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses.</a> The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).</li><li>Krasileva, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+hidden+variation+in+polyploid+wheat.">Uncovering hidden variation in polyploid wheat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).</li><li>Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+TILLING+Method+for+Wheat+Breeding.">A Modified TILLING Method for Wheat Breeding.</a> The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).</li><li>Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+TILLING+and+Ecotilling+in+plants+and+animals.">A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).</li><li>Wu, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-+and+Irradiation-induced+Mutants+of+Indica+Rice+IR64+for+Forward+and+Reverse+Genetics.">Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics.</a> Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).</li><li>Feldman, M., Levy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Evolution+Due+to+Allopolyploidization+in+Wheat.">Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat.</a> Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).</li><li>Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+and+disadvantages+of+being+polyploid.">The advantages and disadvantages of being polyploid.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Efficient+Mutation+Resource+with+Phenotypic+Variation+in+Hexaploid+Winter+Wheat+and+Identification+of+Novel+Alleles+in+the+TaAGP.L-B1+Gene.">Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li><li>Rakszegi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+agronomic+and+morphological+traits+in+a+mutant+population+of+bread+wheat+studied+in+the+Healthgrain+program.">Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program.</a> Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).</li><li>Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilling+by+Sequencing.">Tilling by Sequencing.</a> Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).</li></ol>

TILLING er et meget værdifuldt omvendt genetik værktøj til genvalidering, især for små korn, hvor Transformations baserede tilgange har alvorlige flaskehalse11. Udvikling af en mutageniceret population med høj mutationsfrekvens er et af de afgørende trin i gennemførelsen af funktionelle genomundersøgelser. Det vigtigste skridt i udviklingen af en robust TILLING befolkning er at bestemme den optimale koncentration af EMS. Overlevelsesraten på 40%-60% i M1 er blevet fundet som e...

Punktmutationer i genomer kan tjene mange nyttige formål for forskere. Afhængigt af deres art og placering, kan disse mutationer bruges til at tildele funktioner til gener eller endda særskilte domæner af proteiner af interesse. På den anden side, som en kilde til nye genetiske variation, nyttige mutationer kan vælges til ønskede træk ved hjælp af fænotypebestemmelse skærme og yderligere anvendes i afgrøde forbedring. TILLING er en kraftfuld reverse genetik værktøj, der omfatter kemisk mutagenese og påvisning af sekvens variation i målgenet. Først udviklet i Arabidopsis1 og Drosophilia melanogaster2, tilling populationer er blevet udviklet og udnyttet i mange små kornafgrøder såsom Hexaploid brødhvede (Triticum aestivum)3, Byg (Hordeum vulgare)4, hård hvede (t. dicoccoides hård)5, diploide hvede (t. monococcum)6 og "D" genom stamfader af hvede Aegilops tauschii7 . Disse ressourcer er blevet brugt til at validere rollerne af gener i reguleringen af abiotisk og biotisk stress tolerance8, regulere blomstringstid9, og udvikle ernæringsmæssigt overlegne afgrødesorter5.
TILLING, sammen med brugen af alkylerende mutagene stoffer såsom ethyl methansulfonat (EMS), natriumazid, N-methyl-N-nitrosourea (MNU), og methylmethanesulfonat (MMS), har fordele i forhold til andre reverse Genetics værktøjer af flere årsager. For det første kan mutagenese udføres på praktisk taget enhver art eller variation af plante10 og er uafhængig af Transformations flaskehalsen, hvilket er særlig udfordrende i tilfælde af små korn11. For det andet, ud over at generere knockout-mutationer, der kan opnås ved andre gen validering tilgange, en række missense og splejsning mutationer kan induceres, som kan skelne funktioner af individuelle domæner af proteiner af interesse12. Desuden genererer TILLING en udødelig samling af mutationer i hele genomet; således kan en enkelt population bruges til funktionel validering af flere gener. I modsætning hertil genererer andre reverse Genetics-værktøjer kun ressourcer, som er specifikke for genet under studie13. Nyttige mutationer identificeret gennem TILLING kan anvendes til avlsformål og er ikke omfattet af regulering, i modsætning til genredigering, hvis ikke-transgene klassifikation stadig er usikker i mange lande. Dette bliver især relevant for små korn, der handles internationalt14.
TILLING er en enkel og effektiv genvaliderings strategi og kræver, at der udvikles mutagenicerede populationer til undersøgelse af gener af interesse. Udvikling af en effektiv mutageniceret population er afgørende for at bestemme effektiviteten af en TILLING-baseret genvaliderings undersøgelse. En FLISEinddelt population med en lav samlet mutationsfrekvens indikerer, at en upraktisk stor population skal screenes for de ønskede mutationer, hvorimod en høj mutagen koncentration fører til høj dødelighed i befolkningen og et utilstrækkeligt antal mutagenicerede individer. Når en god befolkning er udviklet, der er flere måder at opdage mutationer i de gener af interesse, og valget af platform afhænger af eksperimentel skala og tilgængelighed af ressourcer. Hele genomsekvensering og exome sekventering er blevet brugt til at karakterisere alle mutationer i tilling populationer i planter med små genomer15,16. Der er udført exome sekventering af to TILLING populationer i brød og hård hvede og er tilgængelig for offentligheden til identificering af ønskværdige mutationer og bestilling af mutant linjer af interesse17. Det er en stor offentlig ressource med hensyn til tilgængeligheden af ønskværdige mutationer; i genvaliderings undersøgelser bør Wild-type-linjen dog være i besiddelse af det kandidat-gen, som er af interesse. Desværre er det stadig koste-uoverkommelige at sekvens af exome af hele TILLING befolkning for reverse genetik-baseret validering af et par kandidat gener i en anden baggrund. Amplicon sekvensering og cel-1-baserede assays har været anvendt til påvisning af mutationer i målrettede populationer i hvede, og cel-1 assays er enklere, kræver ingen beregningsmæssige viden, og er særligt velegnede til validering af et lille antal gener med grundlæggende laboratorieudstyr6,18.
I denne artikel beskrives metoder til udvikling af en god TILLING af populationen, herunder fremstilling af doserings kurven, mutagenese og vedligeholdelse af den mutante population og screening af den mutante population ved anvendelse af PCR-baseret cel-1-analyse . Denne protokol er allerede blevet gennemført med succes med at udvikle og udnytte mutagenicerede populationer af Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, Byg, Aegilops tauchii7og flere Andre. Inkluderet er eksplicitte detaljer om disse metoder sammen med nyttige tips, der vil hjælpe forskerne med at udvikle TILLING populationer, ved hjælp af EMS som et mutagent i enhver lille korn plantevalg.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well 1.1 ml microtubes in microracks</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>TN0946-08R</td>
			<td>For collecting leaf tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0710-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosprint 96 DNA Plant Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>941558</td>
			<td>Kit for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-1 endonuclease</td>
			<td>Extracted as described by Till et al 2006</td>
			<td></td>
			<td>Single strand specific endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-0880-25G</td>
			<td>EMS, Chemical mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry/Shell freeze system</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>For lyophilization of leaf tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kingfisher Flex purification system</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>5400610</td>
			<td>High throughput DNA extraction robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius gel imaging system</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbit Environ-shaker</td>
			<td>Lab-line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROstar Nano</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Nano drop for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis

Målretning induceret lokale læsioner i genomer (TILLING) er en kraftfuld reverse genetik værktøj, der omfatter kemisk mutagenese og påvisning af sekvens variation i Target gener. Tilling er et yderst værdifuldt funktionelt genomforskning-værktøj til genvalidering, især i små kerner, hvor Transformations baserede tilgange har alvorlige begrænsninger. Udvikling af en robust, mutageniceret population er afgørende for at bestemme effektiviteten af et TILLING-baseret genvaliderings studie. En FLISEinddelt population med en lav samlet mutation frekvens indikerer, at en upraktisk stor population skal screenes for at finde de ønskede mutationer, hvorimod en høj mutagen koncentration fører til høj dødelighed i befolkningen, hvilket fører til en utilstrækkelig antallet af mutagenicerede individer. Når en effektiv population er udviklet, er der flere måder at detektere mutationer i et gen af interesse, og valget af platform afhænger af eksperimentel skala og tilgængelighed af ressourcer. Cel-1-analysen og agrose gel-baseret tilgang til mutant identifikation er praktisk, reproducerbar og en mindre ressourceintensiv platform. Det er fordelagtigt i, at det er simpelt, kræver ingen beregningsmæssige viden, og det er især egnet til validering af et lille antal gener med grundlæggende laboratorieudstyr. I denne artikel beskrives metoderne til udvikling af en god TILLING-population, herunder forberedelse af doserings kurven, mutagenese og opretholdelse af den mutante population samt screening af den mutante population ved anvendelse af PCR-baseret cel-1-analyse .

Figur 2 viser doserings kurven for hexaploid brødhvede sort Jagger, diploide hvede Triticum monococcum6, og en genom donor af hvede Aegilops tauschii7. EMS-doserne for de ønskede 50% overlevelsesrater var omkring 0,25%, 0,6% og 0,7% for t. monococcum, AE. tauschii, og t. aestivum, hhv. Den højere EMS-tolerance over for hexaploid hvede skyldes dens genom-bufferings ...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Beskrevet er en protokol til udvikling af målrettede lokale læsioner i genomer (TILLING) af små kornafgrøder med anvendelse af ethylmethanesulfonat (EMS) som mutagent. Der findes også en protokol til mutation Detection ved hjælp af cel-1-analysen.

Udvikling af målretning mod inducerede lokale læsioner i genomer (TILLING) i små kornafgrøder ved Ethylmethanesulfonat-Mutagenicose

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Denne protokol beskriver udviklingen af robuste tillingspopulationer med høj mutationsfrekvens ved EMS-mutagenese i små kornafgrøder. TILLING populationer kan bruges til funktionelle genomics, samt for frem genetiske rum gen opdagelse i små kornafgrøder. Tilling populationer udviklet ved hjælp af denne teknik har høje mutationsfrekvenser, og denne protokol kan anvendes på enhver genotype.Cel-1-analysebaseret mutationsdetektion kan udføres ved hjælp af grundlæggende laboratorieudstyr. Det vigtigste skridt er at bestemme den optimale EMS-koncentration. Derfor bør der laves en EMS-doseringskurve specielt til den enkelte population.I første tilsætning lægges der 100 frø i blød med den genotype, der er af interesse for hver af de seks 250 milliliterglaskolber, og som indeholder 50 milliliter destilleret vand. Ryst ved 100 omdr./min. i otte timer ved stuetemperatur til imbibition. Derefter, i en røghætte, forberede 50 milliliter EMS-opløsninger af fem forskellige koncentrationer ved at blande EMS væske og destilleret vand.Efter imbibition dekanteres vandet ud af fem kolber. Der tilsættes 50 milliliter EMS-opløsning i hver af de fem kolber, der indeholder imbiberede frø. Kolberene rystes i 16 timer ved 75 omdr./min. og rumtemperatur.Nu dekantere EMS løsning i en tom affaldsflaske og hæld de behandlede frø på ostelærred placeret på en tom affaldsflaske til at indsamle separat for hver behandling. Brug ekstra vand til at hjælpe hælde af frøene. Også spray flere milliliter EMS inaktivering opløsning på væggen af forurenede kolber.Og nedsænk brugte pipettespidser i opløsningen i 24 timer. Inaktive den brugte EMS-løsning ved at tilføje et volumen af INaktivering af EMS til behandling i 24 timer. Ved hjælp af en twist slips, holde EMS behandlede frø inde i ostelærred og vask under rindende vand fra hanen i to timer.Efter vask, transplantation hver frø individuelt i rod undervisere, der indeholder potteplanter jord. Dyrk planter ved 20 til 25 grader Celsius i en 16 timers lysperiode. Efter 15 dages transplantation, kontrollere planterne og tælle antallet af frø, der undlod at spire.Registrere data om anlæggets overlevelse. Hvis overlevelsesraten ikke er inden for 40 til 60% foretage en anden runde af dosering optimering med en modificeret koncentration, indtil opnå den ønskede dødelighed på 40 til 60% Efter mutagenesis eksperiment, indsamle bladvæv af M2 planter i en 96 godt væv indsamling boks. Væv indsamles fra M2 planter, som blev dyrket fra selfed M1 planter.En M2 plante er vist fra hver M1 plante. Ekstrakt DNA ved hjælp af en plante DNA ekstraktion kit med en DNA rensningssystem efter producentens anbefalinger. Derefter indlæses to mikroliter af DNA-ekstraktet i LV-plader med 16 pladser.Kvantificere DNA ved hjælp af et spektrofotometer ved bølgelængder på 260 og 280 nanometer. Dna-koncentrationen fortyndes til 25 nanogram pr. mikroliter med nukleasefrit vand. Opret fire gange DNA-puljer på 200 mikroliter ved at kombinere DNA fra hver brønd i de fire 96 brøndblokke i en poolplade, samtidig med at hver prøves række- og kolonneidentitet bevares.Dernæst forberede en PCR master mix rør til genspecifikke primere ved at tilføje i hvert rør PCR buffer, frem og tilbage primere, og DNA polymerase i henhold til manuskriptet. Aliquot master mix i brøndene af en 96 godt PCR plade. Tilføj derefter den samlede DNA-skabelon.Indbelæs PCR-rørene i en termisk cykelr, og brug en touchdown-profil til at køre PCR-reaktionen på den termiskecykel. Hvis du vil generere heteroduplexes mellem uoverensstemmende DNAs, inkuberes PCR-produkter i den termiske cycler i et andet program. Derefter tilsættes 2,5 mikroliter hjemmelavet Cel-1 endonuclease til hver af de heteroduplexed PCR produkter.Inkuberes i 45 minutter ved 45 grader Celsius. Derefter skal Cel-1-reaktionen afsluttes ved at tilsætte 2,5 mikroliter på 0,5 molar EDTA ved pH-8. 30,5 mikroliter af hvert Cel-1 behandlet produkt blandet med fem mikroliter farvestof på en 3% agarosegel og køre ved 100 volt i to og en halv time.At dekonstruere mutant pools, bestemme zygosity af mutanter ved at køre to PCR reaktioner for individuelle M2 DNA, hvor den første reaktion indeholder 2,5 mikroliter af M2 DNA og 2,5 mikroliter af vilde type DNA og den anden reaktion indeholder kun fem mikroliter af M2 DNA. Denne protokol viser EMS mutagenizing af små kornafgrøder og karakterisering af mutant. Doseringskurven indikerer optimale EMS-doser for de ønskede 50% overlevelsesrater for tre forskellige hvedearter.Tilstedeværelsen af let identificerbare fænotyper i M2-populationen bekræfter effektiviteten af mutagenese i små kornpopulationer. Her er fire eksempler på de mutante fænotyper i M2 TILLING populationer, en albino mutant i en byg M2 population, en klor mutant i en byg M2 population, en broget mutant med pink misfarvning i en Aegilops tauschii M2 population, og en lav-fræsende mutant i en Triticum monococcum M2 population. En mutant identifikation ved hjælp af Cel-1 på agarose gel platforme viser en potentiel mutant pulje identificeret ud af 12 mutant pools af unikke kløvet bands.Decentraliseringen af mutante pools bestemte mutationens zygositet og hjalp med at spore mutationen ned til individuelle prøver. A4-puljen havde heterozygode mutationer, angivet ved kløvet bands i både Box 4 og Box 4 wild type DNA-prøver. H5-puljen indeholdt homozygotmutationer, da unikke kløvet bånd kun var til stede i boks 5 H5 wild type DNA-prøve.Det vigtigste skridt er at bestemme den optimale koncentration af EMS for at opnå 40 til 60% dødelighed. Når en TILLING befolkning med en høj mutation frekvens er blevet udviklet det kan bruges til funktionel karakterisering af ethvert gen af interesse. Derudover kan befolkningen være en kilde til nyttig genetisk variation for afgrødeforbedring.TILLING er blevet anvendt i udstrakt grad til funktionelle genomiske undersøgelser i model- og afgrødeplanter. Rækken af opnåede mutationer kan være missents, knockouts, tavse, eller endda misspliced former. EMS er et mutagen.Brug derfor passende personlige værnemidler under håndtering af EMS. Dekontaminere sidestensopløsninger og brugte pipettespidser.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nyre Regeneration i Adult Zebrafisk af Gentamicin induceret skade

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering af tymisk Bundfældning Progenitorer i Mouse Embryo Brug<em&gt; In vivo</em&gt; Og<em&gt; In vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik Target Mikroinjektion til udviklingslandene<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Udvikling af en Ethanol-induceret Fibrotiske Lever Model i Zebrafisk at studere progenitorcelle-medieret hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anvendelse af RNAi og Heat-shock-induceret transskription faktor udtryk til at omprogrammere kønsceller til neuroner i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle sammenlægning Assays til at evaluere bindingen af Drosophila Notch med Trans-ligander og dens hæmning af Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrolleret kortikal indvirkning model af mus hjerneskade med terapeutisk transplantation af menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledte neurale celler

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

Murine neurale plade målretning af In Utero nano-injektion (NEPTUN) på embryonal dag 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...