Name: development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door het USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch project 1016879 en Maryland Agricultural experiment station via MAES Grant No. 2956952.

1. bereiding van de doserings curve voor effectieve mutagenese
<ol><li>Week 100 zaden met het genotype van belang in de glazen kolven van 6 250 mL (100 in elke kolf) met 50 mL gedistilleerd water. Schud bij 100 rpm voor 8 uur bij kamertemperatuur (RT) voor imbibitie door de zaden.</li>
	<li>Bereid in een rook afzuigkap 50 mL 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0%, en 1,2% (w/v) ethylmethanesulfonaat (EMS) oplossing door respectievelijk het oplossen van 0,167, 0,249, 0,331, 0,415 en 0,498 mL EMS in gedistilleerd water. NB: EMS is vl...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+screening+for+induced+mutations.">Targeted screening for induced mutations.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).</li><li>Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Recovery+of+Mutations+in+Drosophila.">Targeted Recovery of Mutations in Drosophila.</a> Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rare+Mutations+in+Populations:+TILLING+by+Sequencing.">Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing.</a> Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).</li><li>Caldwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structured+mutant+population+for+forward+and+reverse+genetics+in+Barley+(Hordeum+vulgare+L.).">A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.).</a> The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).</li><li>Hazard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Mutations+in+the+Starch+Branching+Enzyme+II+(+SBEII+)+Genes+Increase+Amylose+and+Resistant+Starch+Content+in+Durum+Wheat.">Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat.</a> Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diploid+wheat+TILLING+resource+for+wheat+functional+genomics.">A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics.</a> BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILL-D:+An+Aegilops+tauschii+TILLING+Resource+for+Wheat+Improvement.">TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Fhb1+encodes+a+chimeric+lectin+with+agglutinin+domains+and+a+pore-forming+toxin-like+domain+conferring+resistance+to+Fusarium+head+blight.">Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight.</a> Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).</li><li>Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+spring+hexaploid+wheat+line+with+no+functional+VRN2+genes.">Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).</li><li>Greene, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Chemically+Induced+Mutations+From+a+Large-Scale+Reverse-Genetic+Screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).</li><li>Harwood, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+remaining+challenges+in+the+transformation+of+barley+and+wheat.">Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).</li><li>Henikoff, S., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Nucleotide+Mutations+for+Plant+Functional+Genomics.">Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics.</a> Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).</li><li>Uauy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+TILLING+approach+to+detect+induced+mutations+in+tetraploid+and+hexaploid+wheat.">A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).</li><li>Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Traditional+Mutagenesis+with+New+High-Throughput+Sequencing+and+Genome+Editing+to+Reveal+Hidden+Variation+in+Polyploid+Wheat.">Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat.</a> Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequences+of+1504+Mutants+in+the+Model+Rice+Variety+Kitaake+Facilitate+Rapid+Functional+Genomic+Studies.">The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies.</a> The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+Mutant+Resource+as+an+Efficient+Platform+for+Gene+Discovery+in+Grasses.">A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses.</a> The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).</li><li>Krasileva, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+hidden+variation+in+polyploid+wheat.">Uncovering hidden variation in polyploid wheat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).</li><li>Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+TILLING+Method+for+Wheat+Breeding.">A Modified TILLING Method for Wheat Breeding.</a> The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).</li><li>Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+TILLING+and+Ecotilling+in+plants+and+animals.">A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).</li><li>Wu, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-+and+Irradiation-induced+Mutants+of+Indica+Rice+IR64+for+Forward+and+Reverse+Genetics.">Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics.</a> Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).</li><li>Feldman, M., Levy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Evolution+Due+to+Allopolyploidization+in+Wheat.">Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat.</a> Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).</li><li>Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+and+disadvantages+of+being+polyploid.">The advantages and disadvantages of being polyploid.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Efficient+Mutation+Resource+with+Phenotypic+Variation+in+Hexaploid+Winter+Wheat+and+Identification+of+Novel+Alleles+in+the+TaAGP.L-B1+Gene.">Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li><li>Rakszegi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+agronomic+and+morphological+traits+in+a+mutant+population+of+bread+wheat+studied+in+the+Healthgrain+program.">Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program.</a> Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).</li><li>Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilling+by+Sequencing.">Tilling by Sequencing.</a> Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).</li></ol>

TILLING is een zeer waardevol reverse genetics tool voor genvalidering, vooral voor kleine granen waar op transformatie gebaseerde benaderingen ernstige knelpunten hebben11. Het ontwikkelen van een mutagene populatie met een hoge mutatiefrequentie is een van de kritische stappen in het uitvoeren van functionele genomics studies. De belangrijkste stap in de ontwikkeling van een robuuste TILLING-populatie is het bepalen van de optimale concentratie van EMS. De overlevings ratio van 40%-60% in de M<s...

Puntmutaties in genomen kunnen vele nuttige doeleinden voor onderzoekers dienen. Afhankelijk van hun aard en locatie kunnen deze mutaties worden gebruikt om functies toe te wijzen aan genen of zelfs afzonderlijke domeinen van eiwitten die van belang zijn. Aan de andere kant kunnen, als bron van nieuwe genetische variatie, nuttige mutaties worden geselecteerd voor gewenste eigenschappen met behulp van fenotypscreens en verder gebruikt bij gewas verbetering. TILLING is een krachtige reverse genetics tool die chemische mutagenese en detectie van sequentie variatie in het doel gen omvat. Voor het eerst ontwikkeld in Arabidopsis1 en drosophilia melanogaster2, zijn Tilling populaties ontwikkeld en gebruikt in veel kleine graangewassen zoals Braam brood tarwe (Triticum aestivum)3, gerst (Hordeum vulgare)4, tetraploïde durumtarwe(t. dicoccoides durum)5, diploïde tarwe (t. monococcum)6 en de "D" genoom voorlopercellen van tarwe aegilops tauschii7 . Deze middelen zijn gebruikt om de rollen van genen te valideren bij het reguleren van abiotische en biotische stress tolerantie8, het reguleren van bloeitijd9, en het ontwikkelen van nutritioneel superieure gewas rassen5.
Tilling, samen met het gebruik van alkylerende mutagene agentia zoals ethyl methanesulfonaat (EMS), natrium azide, n-methyl-N-nitrosourea (mnu), en methyl methanesulfonaat (MMS), heeft voordelen ten opzichte van andere reverse genetics tools om verschillende redenen. Ten eerste kan mutagenese worden uitgevoerd op nagenoeg elke soort of variëteit van plant10 en is deze onafhankelijk van het knelpunt bij de transformatie, wat in het geval van kleine korrels11bijzonder uitdagend is. Ten tweede kan naast het genereren van Knockout-mutaties die kunnen worden verkregen door andere genvalidatiebenaderingen, een reeks missense en splicing-mutaties worden geïnduceerd, die functies van afzonderlijke domeinen van de eiwitten van belang kunnen onderscheiden12. Bovendien genereert TILLING een onsterfelijke verzameling van mutaties in het genoom; Zo kan een enkele populatie worden gebruikt voor functionele validatie van meerdere genen. Andere tools voor reverse genetica genereren daarentegen alleen middelen die specifiek zijn voor het gen in studie13. Nuttige mutaties geïdentificeerd door middel van BETEGELING kunnen worden ingezet voor fokdoeleinden en zijn niet onderworpen aan regulering, in tegenstelling tot het bewerken van genen, waarvan de niet-transgene classificatie in veel landen nog onzeker is. Dit wordt vooral relevant voor kleine granen die internationaal worden verhandeld14.
TILLING is een eenvoudige en efficiënte genvaliderings strategie en vereist dat mutagenized populaties worden ontwikkeld voor het onderzoeken van genen van belang. Het ontwikkelen van een effectieve gemutageniseerde populatie is de sleutel tot het bepalen van de efficiëntie van een op TILLING gebaseerd gen-valideringsonderzoek. Een TILLING populatie met een lage totale mutatiefrequentie geeft aan dat een onpraktisch grote populatie moet worden gescreend op gewenste mutaties, terwijl een hoge mutagene concentratie leidt tot een hoge sterfte in de populatie en een ontoereikend aantal mutagenized personen. Zodra een goede populatie is ontwikkeld, zijn er meerdere manieren om mutaties in de genen van belang te detecteren, en de keuze van het platform is afhankelijk van de experimentele schaal en beschikbaarheid van middelen. Hele genoom sequentiëren en exoomsequencing sequencing zijn gebruikt om alle mutaties in Tilling populaties in planten met kleine genomen15,16te karakteriseren. Exome sequencing van twee TILLING populaties is uitgevoerd in brood en durumtarwe en is beschikbaar voor het publiek voor het identificeren van gewenste mutaties en het bestellen van mutant lijnen van belang17. Het is een grote openbare bron in termen van beschikbaarheid van wenselijk mutaties; in genvaliderings studies moet de wild-type lijn echter het kandidaatgen bezitten dat van belang is. Helaas is het nog steeds kosten-prohibitief om de exoomsequencing van de hele TILLING populatie te sequenties voor reverse-genetica gebaseerde validering van enkele kandidaatgenen op een andere achtergrond. Amplicon-sequencing en cel-1-gebaseerde assays zijn gebruikt bij het opsporen van mutaties in gerichte populaties in tarwe, en cel-1-assays zijn eenvoudiger, vereisen geen computationele kennis en zijn vooral geschikt voor validatie van een klein aantal genen met basis labomateriaal6,18.
In dit artikel worden beschreven methoden voor de ontwikkeling van een goede TILLING populatie, met inbegrip van de bereiding van de doserings curve, mutagenese en onderhoud van de Mutante populatie, en screening van de Mutante populatie met behulp van de PCR-gebaseerde cel-1 test . Dit protocol is al met succes geïmplementeerd in de ontwikkeling en het gebruik van mutageen populaties van Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, gerst, aegilops tauchii7, en verschillende Anderen. Inbegrepen zijn expliciete details van deze methoden, samen met nuttige tips die onderzoekers helpen bij het ontwikkelen van TILLING-populaties, het gebruik van EMS als een mutagene stof in een kleine graan plant naar keuze.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well 1.1 ml microtubes in microracks</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>TN0946-08R</td>
			<td>For collecting leaf tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0710-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosprint 96 DNA Plant Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>941558</td>
			<td>Kit for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-1 endonuclease</td>
			<td>Extracted as described by Till et al 2006</td>
			<td></td>
			<td>Single strand specific endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-0880-25G</td>
			<td>EMS, Chemical mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry/Shell freeze system</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>For lyophilization of leaf tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kingfisher Flex purification system</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>5400610</td>
			<td>High throughput DNA extraction robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius gel imaging system</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbit Environ-shaker</td>
			<td>Lab-line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROstar Nano</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Nano drop for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis

Gerichte lokale laesies IN Genomes (TILLING) is een krachtige reverse genetics tool die chemische mutagenese en detectie van sequentie variatie in doel genen omvat. TILLING is een zeer waardevol functioneel Genomics-instrument voor genvalidering, vooral in kleine korrels waarin op transformatie gebaseerde benaderingen ernstige beperkingen hebben. Het ontwikkelen van een robuuste, gemutageniseerde populatie is de sleutel tot het bepalen van de efficiëntie van een op TILLING gebaseerd gen-valideringsonderzoek. Een TILLING populatie met een lage totale mutatiefrequentie geeft aan dat een onpraktisch grote populatie moet worden gescreend om gewenste mutaties te vinden, terwijl een hoge mutagene concentratie leidt tot een hoge sterfte in de populatie, wat leidt tot een onvoldoende aantal mutageen personen. Zodra een effectieve populatie is ontwikkeld, zijn er meerdere manieren om mutaties in een gen van belang te detecteren, en de keuze van het platform is afhankelijk van de experimentele schaal en beschikbaarheid van middelen. De cel-1 assay en agarose gel-gebaseerde aanpak voor Mutante identificatie is handig, reproduceerbaar en een minder hulpbronnen intensief platform. Het is voordelig omdat het eenvoudig is, zonder computationele kennis, en het is vooral geschikt voor validatie van een klein aantal genen met basis labapparatuur. In dit artikel worden de methoden beschreven voor de ontwikkeling van een goede TILLING populatie, met inbegrip van de bereiding van de doserings curve, mutagenese en het onderhoud van de Mutante populatie, en screening van de Mutante populatie met behulp van de PCR-gebaseerde cel-1 test .

Figuur 2 toont de doserings curve van Braam brood tarwe cultivar Jagger, diploïde tarwe Triticum monococcum6, en een genoom donor van tarwe aegilops tauschii7. De EMS doses voor gewenste 50% overlevingskansen waren ongeveer 0,25%, 0,6% en 0,7% voor t. monococcum, AE. tauschii, en t. aestivum, respectievelijk. De hogere EMS-tolerantie van Braam tarwe is te wijten aan ...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Beschreven is een protocol voor het ontwikkelen van een gerichte lokale laesies bij Genomes (TILLING) populatie in kleine graangewassen met gebruik van ethyl methanesulfonaat (EMS) als een mutageen. Ook voorzien is een protocol voor mutatie detectie met behulp van de cel-1 test.

Ontwikkeling van gerichte lokale laesies bij Genomes (TILLING) populaties in kleine graangewassen door mutageen

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van robuuste TILLING-populaties met een hoge mutatiefrequentie door EMS mutagenesis in kleine graangewassen. TILLING populaties kunnen worden gebruikt voor functionele genomics, evenals voor forward genetische ruimte gen ontdekking in kleine graangewassen. De MET deze techniek ontwikkelde TILLING-populaties hebben hoge mutatiefrequenties, en dit protocol kan worden toegepast op elk genotype.De Cel-1 test gebaseerde mutatie detectie kan worden uitgevoerd met behulp van basislabapparatuur. De belangrijkste stap is het bepalen van de optimale EMS-concentratie. Daarom moet een EMS-doseringscurve specifiek worden gemaakt voor de individuele bevolking.Om te beginnen, weken 100 zaden met het genotype van belang in elk van de zes 250 milliliter glazen kolven, met 50 milliliter gedestilleerd water. Schud acht uur lang bij 100 RPM bij kamertemperatuur voor imbibition. Bereid vervolgens in een rookkap 50 milliliter EMS-oplossingen van vijf verschillende concentraties door EMS-vloeistof en gedestilleerd water te mengen.Na imbibition, decanteren het water uit vijf flessen. Voeg 50 milliliter EMS-oplossing toe in elk van de vijf kolven die indrongen zaden bevatten. Schud de kolven 16 uur bij 75 RPM en kamertemperatuur.Decanteer nu de EMS-oplossing in een lege afvalfles en giet de behandelde zaden op kaasdoek geplaatst op een lege afvalfles om apart te verzamelen voor elke behandeling. Gebruik extra water om te helpen gieten van de zaden. Spuit ook meerdere milliliters EMS-inactiverende oplossing op de wand van verontreinigde kolven.En dompel gebruikte pipettips 24 uur onder in de oplossing. Inactief de gebruikte EMS-oplossing door één volume EMS-inactiverende oplossing toe te voegen om gedurende 24 uur te behandelen. Houd met behulp van een twist das de EMS behandelde zaden in de kaasdoek en was twee uur onder stromend leidingwater.Na het wassen, transplanteer elk zaad afzonderlijk in worteltrainers die potgrond bevatten. Kweek planten op 20 tot 25 graden Celsius voor een 16 uur licht periode. Controleer na 15 dagen transplantatie de planten en tel het aantal zaden dat niet ontkiemde.Gegevens van de overleving van planten registreren. Als de overlevingskans niet binnen 40 tot 60% is, voert u een tweede ronde van doseringsoptimalisatie uit met een gewijzigde concentratie tot het bereiken van de gewenste letaliteit van 40 tot 60%Na het mutagenesis-experiment verzamelt u het bladweefsel van M2-planten in een 96-putweefselopvangdoos. Weefsel wordt verzameld uit M2 planten die werden geteeld uit zelfvoorzienende M1 planten.Van elke M1-installatie wordt één M2-plant getoond. Haal DNA af met behulp van een planten-DNA-extractiekit met een DNA-zuiveringssysteem volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Laad vervolgens twee microliters van het DNA-extract in LV-platen met 16 sleuven.Kwantificeer DNA met behulp van een spectrofotometer op golflengten van 260 en 280 nanometer. Verdun de DNA-concentratie tot 25 nanogram per microliter met nuclease-vrij water. Maak vier keer DNA-pools van 200 microliters door het DNA van elke put in de vier 96 putblokken te combineren tot een poolplaat met behoud van de rij- en kolomidentiteit van elk monster.Bereid vervolgens een PCR master mix buis voor gen specifieke primers door toe te voegen in elke buis PCR buffer, vooruit en omgekeerde primers, en DNA polymerase volgens het manuscript. Aliquot de master mix in de putten van een 96 goed PCR plaat. Voeg vervolgens de samengevoegde DNA-sjabloon toe.Laad de PCR-buizen in een thermische cycler en gebruik een touchdownprofiel om de PCR-reactie op de thermische cycler uit te voeren. Om heteroduplexen tussen niet-overeenkomende 100 000 100 PCR-producten in de thermische cycler in een ander programma uit te broeden. Voeg vervolgens 2,5 microliter zelfgemaakte Cel-1 endonuclease toe aan elk van de heteroduplexed PCR-producten.Incubeer gedurende 45 minuten bij 45 graden Celsius. Daarna beëindigt u de Cel-1-reactie door 2,5 microliter van 0,5 molaire EDTA toe te voegen bij pH acht. Laad 30,5 microliter van elk cel-1 behandeld product gemengd met vijf microliter kleurstof op een 3%agarose gel en loop twee en een half uur op 100 volt.Om mutanten te deconvoluteeren, de zygositeit van mutanten te bepalen door twee PCR-reacties uit te voeren voor individueel M2-DNA waarin de eerste reactie 2,5 microliter M2-DNA en 2,5 microliter van wild type DNA bevat en de tweede reactie slechts vijf microliter van M2-DNA bevat. Dit protocol toont EMS mutageenizing van kleine graangewassen en de karakterisering van mutant. De doseringscurve geeft optimale EMS-doses aan voor de gewenste overlevingskansen van 50% voor drie verschillende tarwesoorten.De aanwezigheid van gemakkelijk identificeerbare fenotypes in de M2-populatie bevestigt de effectiviteit van mutagenese in kleine graanpopulaties. Hier zijn vier voorbeelden van de mutant fenotypes in M2 TILLING populaties, een albino mutant in een gerst M2 populatie, een chlorina mutant in een gerst M2 populatie, een bonte mutant met roze verkleuring in een Aegilops tauschii M2 populatie, en een low-tillering mutant in een Triticum monococcum M2 populatie. Een mutant identificatie met behulp van Cel-1 op agarose gel platforms toont een potentiële mutant zwembad geïdentificeerd uit 12 mutant zwembaden door unieke cleaved bands.De deconvolutie van mutantenspoorten bepaalde de zygositeit van mutatie en hielp om de mutatie op te sporen tot individuele monsters. De A4 zwembad had heterozygoot mutaties, aangegeven door cleaved bands in zowel Box 4 en Box 4 wild type DNA monsters. De H5-pool bevatte homozygootmutaties omdat unieke gespleten banden alleen aanwezig waren in box 5 H5 wild type DNA monster.De belangrijkste stap is het bepalen van de optimale concentratie van EMS om 40 tot 60% letaliteit te bereiken. Zodra een TILLING populatie met een hoge mutatiefrequentie is ontwikkeld, kan deze worden gebruikt voor functionele karakterisering van elk gen van belang. Bovendien kan de populatie een bron van nuttige genetische variatie zijn voor gewasverbetering.TILLING is veelvuldelijk gebruikt voor functionele genomische studies in model- en gewasplanten. Het bereik van de verkregen mutaties kan worden missents, knock-outs, stille, of zelfs mispliced vormen. EMS is een mutageen.Gebruik daarom de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens het hanteren van het EMS. Ontsmetten restjes oplossingen en gebruikte pipet tips.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nier Regeneratie in Adult zebravis door Gentamicin geïnduceerd letsel

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp<em&gt; In Vivo</em&gt; En<em&gt; In Vitro</em&gt; Testen

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Gecontroleerde corticale impact model van muis hersenletsel met therapeutische transplantatie van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neurale cellen

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

Murine Neural Plate Targeting door In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) op Embryonale Dag 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...