Name: development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

이 작품은 농무부 국립 식품 농업 연구소에 의해 지원되었다, 해치 프로젝트 1016879 및 MAES 그랜트 No. 2956952를 통해 메릴랜드 농업 실험 역.

1. 효과적인 돌연변이 발생을 위한 투여 곡선의 준비
<ol><li>증류수 50mL를 함유한 6개의 250 mL 유리 플라스크(각 플라스크에 100개)에 100개의 씨앗을 담그십시오. 실온(RT)에서 100rpm에서 8시간 동안 흔들어 서 씨앗에 의한 침전을 위해 흔들어 주세요.</li>
	<li>연기 후드에서, 0.167, 0.249, 0.331, 0.415 및 0.498 mL의 증류수를 용해시킴으로써 50 mL을 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0%, 1.0%, 1.2%(emS) 용액을 준비한다. 참고: EMS는 R...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+screening+for+induced+mutations.">Targeted screening for induced mutations.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).</li><li>Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Recovery+of+Mutations+in+Drosophila.">Targeted Recovery of Mutations in Drosophila.</a> Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rare+Mutations+in+Populations:+TILLING+by+Sequencing.">Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing.</a> Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).</li><li>Caldwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structured+mutant+population+for+forward+and+reverse+genetics+in+Barley+(Hordeum+vulgare+L.).">A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.).</a> The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).</li><li>Hazard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Mutations+in+the+Starch+Branching+Enzyme+II+(+SBEII+)+Genes+Increase+Amylose+and+Resistant+Starch+Content+in+Durum+Wheat.">Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat.</a> Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diploid+wheat+TILLING+resource+for+wheat+functional+genomics.">A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics.</a> BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILL-D:+An+Aegilops+tauschii+TILLING+Resource+for+Wheat+Improvement.">TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Fhb1+encodes+a+chimeric+lectin+with+agglutinin+domains+and+a+pore-forming+toxin-like+domain+conferring+resistance+to+Fusarium+head+blight.">Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight.</a> Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).</li><li>Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+spring+hexaploid+wheat+line+with+no+functional+VRN2+genes.">Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).</li><li>Greene, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Chemically+Induced+Mutations+From+a+Large-Scale+Reverse-Genetic+Screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).</li><li>Harwood, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+remaining+challenges+in+the+transformation+of+barley+and+wheat.">Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).</li><li>Henikoff, S., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Nucleotide+Mutations+for+Plant+Functional+Genomics.">Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics.</a> Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).</li><li>Uauy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+TILLING+approach+to+detect+induced+mutations+in+tetraploid+and+hexaploid+wheat.">A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).</li><li>Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Traditional+Mutagenesis+with+New+High-Throughput+Sequencing+and+Genome+Editing+to+Reveal+Hidden+Variation+in+Polyploid+Wheat.">Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat.</a> Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequences+of+1504+Mutants+in+the+Model+Rice+Variety+Kitaake+Facilitate+Rapid+Functional+Genomic+Studies.">The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies.</a> The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+Mutant+Resource+as+an+Efficient+Platform+for+Gene+Discovery+in+Grasses.">A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses.</a> The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).</li><li>Krasileva, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+hidden+variation+in+polyploid+wheat.">Uncovering hidden variation in polyploid wheat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).</li><li>Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+TILLING+Method+for+Wheat+Breeding.">A Modified TILLING Method for Wheat Breeding.</a> The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).</li><li>Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+TILLING+and+Ecotilling+in+plants+and+animals.">A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).</li><li>Wu, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-+and+Irradiation-induced+Mutants+of+Indica+Rice+IR64+for+Forward+and+Reverse+Genetics.">Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics.</a> Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).</li><li>Feldman, M., Levy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Evolution+Due+to+Allopolyploidization+in+Wheat.">Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat.</a> Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).</li><li>Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+and+disadvantages+of+being+polyploid.">The advantages and disadvantages of being polyploid.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Efficient+Mutation+Resource+with+Phenotypic+Variation+in+Hexaploid+Winter+Wheat+and+Identification+of+Novel+Alleles+in+the+TaAGP.L-B1+Gene.">Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li><li>Rakszegi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+agronomic+and+morphological+traits+in+a+mutant+population+of+bread+wheat+studied+in+the+Healthgrain+program.">Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program.</a> Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).</li><li>Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilling+by+Sequencing.">Tilling by Sequencing.</a> Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).</li></ol>

TILLING은 유전자 검증을 위한 매우 가치 있는 역유전학 도구이며, 특히 변형 기반 접근법이 심각한 병목 현상이 있는 작은 곡물의 경우11. 높은 돌연변이 빈도로 돌연변이 집단을 개발하는 것은 기능적 유전체학 연구를 수행하는 데 중요한 단계 중 하나입니다. 강력한 TILLING 인구를 개발하는 데 가장 중요한 단계는 EMS의 최적의 농도를 결정하는 것입니다. M1에서 40%-60%의 생...

게놈에 있는 점 돌연변이는 연구원을 위한 많은 유용한 목적을 봉사할 수 있습니다. 그들의 성격 과 위치에 따라, 이 돌연변이는 관심 있는 단백질의 유전자 또는 명백한 도메인에 기능을 할당하기 위하여 이용될 수 있습니다. 한편, 새로운 유전적 변이의 근원으로서, 유용한 돌연변이는 자형질 나는 스크린을 사용하여 원하는 특성에 대해 선택될 수 있고 작물 개선에 더 많이 사용될 수 있다. TILLING은 표적 유전자에서 화학적 돌연변이 발생 및 서열 변이의 검출을 포함하는 강력한 역유전학 도구이다. 애기장대 1과 초록색 멜라노가스터2에서 처음 개발된 틸링 개체수는 헥사플로이드 빵 밀(Triticumaestivum)3, 보리(Hordeum vulgare)4,테트라포이드 듀럼 밀 (T.dicoccoides durum)5, 디플로이드 밀 (T.모노 코쿰)6 및 밀 Aegilops tauschii7의 "D"게놈 선조 . 이러한 자원은 비생물성 및 생물학적 스트레스 내성 조절 8, 개화 시간조절 9,영양적으로 우수한 작물 품종 을 개발하는 유전자의 역할을 검증하는 데 사용되었습니다5.
틸링, 에틸 메탄설포네이트 (EMS), 나트륨 아지드, N-메틸 -N-n-n-nitrosourea (MNU) 및 메틸 메탄 술포네이트 (MMS)와 같은 알킬라이팅 돌연변이 성 제제의 사용과 함께, 여러 가지 이유로 다른 역 유전학 도구에 비해 장점이 있습니다. 먼저, 돌연변이 발생은 거의 모든 종 또는 다양한 식물(10)에서 수행될 수 있으며, 변형 병목 현상과 무관하며, 이는 작은입자(11)의경우에 특히 도전적이다. 둘째, 다른 유전자 유효성 검사 접근법에 의해 수득될 수 있는 녹아웃 돌연변이를 생성하는 것 외에도, 관심 있는 단백질의 개별 도메인의 기능을 분별할수 있는 다양한 오센스 및 접합 돌연변이가 유도될 수 있다. 더욱이, 틸링은 게놈을 통하여 돌연변이의 불멸의 집합을 생성합니다; 따라서, 단일 집단은 다중 유전자의 기능적 검증을 위해 사용될 수 있다. 대조적으로, 그밖 역유전학 공구는 연구13의밑에 유전자에특정 자원을 생성합니다. TILLING을 통해 확인된 유용한 돌연변이는 번식 목적으로 전개될 수 있으며, 유전자 편집과 달리 많은 국가에서 비유전자 변형 분류가 아직 불확실하다는 규제의 대상이 되지 않습니다. 이것은 국제적으로 거래되는 작은 곡물과 특히 관련이있습니다14.
TILLING은 간단하고 효율적인 유전자 검증 전략이며 관심 있는 유전자를 조사하기 위해 돌연변이 집단을 개발해야 합니다. 효과적인 돌연변이 집단을 개발하는 것은 TILLING 기지를 둔 유전자 검증 연구 결과의 효율성을 결정하는 열쇠입니다. 낮은 전반적인 돌연변이 빈도를 가진 TILLING 인구는 비현실적으로 큰 인구가 원하는 돌연변이를 위해 가려져야 한다는 것을, 반면 높은 돌연변이 원 농도는 인구에 있는 높은 사망으로 이끌어 내고 부족한 수의 돌연변이 개인. 좋은 인구가 개발되면 관심있는 유전자에서 돌연변이를 감지하는 여러 가지 방법이 있으며 플랫폼의 선택은 실험 적 규모와 자원의 가용성에 달려 있습니다. 전체 게놈 시퀀싱 및 엑솜 시퀀싱은 작은 게놈15,16을가진 식물에서 틸링 집단의 모든 돌연변이를 특성화하는 데 사용되어 왔다. 2개의 틸링 집단의 엑소메 시퀀싱은 빵과 듀럼 밀에서 수행되었으며 바람직한 돌연변이를 식별하고 관심 있는 돌연변이 라인을 주문하기 위한 대중에게 제공된다17. 그것은 바람직한 돌연변이의 가용성 측면에서 훌륭한 공공 자원입니다. 그러나, 유전자 검증 연구에서, 야생형 선은 관심 있는 후보 유전자를 소유해야 한다. 불행하게도, 다른 배경에서 몇 가지 후보 유전자의 역유전학 기반 유효성 검사를 위해 전체 틸링 집단의 엑소메를 서열화하는 것은 여전히 비용이 많이 든다. Amplicon 시퀀싱 및 Cel-1 기반 분석은 밀의 표적 집단에서 돌연변이를 검출하는 데 사용되어 왔으며, Cel-1 분석제는 더 간단하고 계산 지식이 필요하지 않으며, 기본유전자의 소수의 유효성 검사에 특히 적합합니다. 실험실장비 6,18.
본 기사에서, 설명된 양호한 틸링 집단의 개발을 위한 방법은, 투여 곡선의 제조, 돌연변이 집단의 돌연변이 생성 및 유지, 및 PCR 기반 Cel-1 분석법을 이용한 돌연변이 집단의 스크리닝을 포함하는 것이다. . 이 프로토콜은 이미 트리티쿰 aestivum, Triticum monoccocum6, 보리, Aegilops tauchii7,및 몇몇의 돌연변이 인구를 개발하고 활용하는 데 성공적으로 구현되었습니다. 다른. 여기에는 연구원이 틸링 인구를 개발하는 데 도움이되는 유용한 팁과 함께 이러한 방법의 명시적 세부 사항이 포함되어 있으며, EMS를 선택한 작은 곡물 식물에서 돌연변이 원으로 사용하십시오.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well 1.1 ml microtubes in microracks</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>TN0946-08R</td>
			<td>For collecting leaf tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0710-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosprint 96 DNA Plant Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>941558</td>
			<td>Kit for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-1 endonuclease</td>
			<td>Extracted as described by Till et al 2006</td>
			<td></td>
			<td>Single strand specific endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-0880-25G</td>
			<td>EMS, Chemical mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry/Shell freeze system</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>For lyophilization of leaf tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kingfisher Flex purification system</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>5400610</td>
			<td>High throughput DNA extraction robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius gel imaging system</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbit Environ-shaker</td>
			<td>Lab-line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROstar Nano</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Nano drop for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis

게놈에서 유도된 국소 병변을 표적으로 하는 것은 (TILLING) 표적 유전자에 있는 화학적인 돌연변이 및 서열 변이의 탐지를 포함하는 강력한 역유전학 공구입니다. TILLING은 유전자 검증을 위한 매우 가치 있는 기능성 유전체학 도구로, 특히 변형 기반 접근법이 심각한 한계를 가지고 있는 작은 곡물에서 특히 중요합니다. 강력한 돌연변이 집단을 개발하는 것은 TILLING 기반 유전자 검증 연구의 효율성을 결정하는 열쇠입니다. 낮은 전반적인 돌연변이 빈도를 가진 TILLING 인구는 비실질적으로 큰 인구가 부족한 부족으로 이끌어 내는 인구에 있는 높은 사망으로 이끌어 내는 반면, 원하는 돌연변이를 찾아내는 것을 가려야 한다는 것을 표시합니다 돌연변이 된 개인의 수. 효과적인 인구가 개발되면 관심 있는 유전자에서 돌연변이를 감지하는 여러 가지 방법이 있으며 플랫폼의 선택은 실험 적 규모와 자원의 가용성에 달려 있습니다. 돌연변이 식별을 위한 Cel-1 분석 및 아가로즈 겔 기반 접근법은 편리하고 재현 가능하며 자원 집약적인 플랫폼입니다. 그것은 간단하다는 점에서 유리하다, 어떤 계산 지식을 필요로하지 않으며, 기본 실험실 장비를 가진 유전자의 소수의 유효성 검사에 특히 적합하다. 본 기사에서, 설명된 양호한 틸링 집단의 개발 방법은, 투여 곡선의 제조, 돌연변이 집단의 돌연변이 발생 및 유지, 및 PCR 기반 Cel-1 분석법을 이용한 돌연변이 집단의 스크리닝을 포함하는 것이다. .

도 2는 헥사플로이드 빵 밀 품종 재거, 디플로이드 밀 트리티쿰 모노코쿰6,및 밀 Aegilops 타우스키이의게놈 공여자의 투여 곡선을 나타낸다. 원하는 50% 생존율에 대한 EMS 투여량은 각각 T. 모노코쿰, Ae. 타우스키,및 T. aestivum에대해 약 0.25%, 0.6% 및 0.7%였다. 헥사플로이드 밀의 EMS 내성?...

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Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

기재된 것은 돌연변이원으로서 에틸 메탄설포네이트(EMS)를 사용하는 작은 곡물 작물에서 게놈(TILLING) 집단의 표적화 유도국소 병변을 개발하기 위한 프로토콜이다. 또한 Cel-1 분석규를 이용한 돌연변이 검출프로토콜이 제공된다.

에틸 메탄술포네이트 돌연변이 발생에 의한 작은 곡물 작물의 게놈(TILLING) 인구에 있는 표적으로 한 현지 병변의 발달

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

이 프로토콜은 작은 곡물 작물에서 EMS 돌연변이 발생에 의해 높은 돌연변이 주파수를 가진 강력한 틸링 인구의 발달을 상세히 설명합니다. 경유 인구는 기능적 유전체학뿐만 아니라 작은 곡물 작물에서 유전자 유전자 발견을 위해 사용될 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 개발된 틸링 인구는 높은 돌연변이 주파수를 가지며,이 프로토콜은 모든 유전자형에 적용 될 수있다.Cel-1 분석 기반 돌연변이 검출은 기본 실험실 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 가장 중요한 단계는 최적의 EMS 농도를 결정하는 것입니다. 따라서, EMS 투여량 곡선은 개별 집단을 위해 특별히 이루어져야 한다.우선, 증류수 50밀리리터를 함유한 6개의 250밀리리터 유리 플라스크에 관심 있는 유전자형으로 100개의 씨앗을 담급니다. 실온에서 8시간 동안 100 RPM에서 흔들어 서 비비티온을 만드시면 됩니다. 그런 다음 연기 후드에서 EMS 액체와 증류수를 혼합하여 5가지 농도의 EMS 용액 50 밀리리터를 준비합니다.imbibition 후, 다섯 플라스크에서 물을 디게. 임비브 씨앗을 포함하는 5개의 플라스크 각각에 50밀리리터의 EMS 용액을 추가합니다. 75 RPM 및 실온에서 16 시간 동안 플라스크를 흔들어보십시오.이제 EMS 용액을 빈 폐기물 병에 넣고 처리된 씨앗을 빈 폐기물 병에 넣은 치즈 천에 부어 각 처리에 대해 별도로 수집합니다. 씨앗을 붓는 데 도움이 여분의 물을 사용합니다. 또한 오염된 플라스크 벽에 EMS 비활성화 용액을 여러 밀리리터로 분사합니다.또한 24시간 동안 사용된 파이펫 팁을 솔루션에 담그십시오. 24시간 동안 치료할 EMS 비활성화 솔루션 의 1부량을 추가하여 사용된 EMS 솔루션을 비활성 상태로 처리합니다. 트위스트 넥타이를 사용하여 EMS 처리 씨앗을 치즈 보안에 들고 흐르는 수돗물 아래에서 2 시간 동안 씻습니다.세척 후 각 씨앗을 포팅 토양을 포함하는 루트 트레이너로 개별적으로 이식합니다. 16 시간 광 기간 동안 20 ~ 25도에서 식물을 성장. 이식 15 일 후, 식물을 확인하고 발아에 실패 씨앗의 수를 계산합니다.식물 생존의 기록을 기록합니다. 생존율이 40~60% 이내인 경우 돌연변이 발생 실험 후 40~60%의 바람직한 치사율을 달성하기 전까지 수정된 농도로 제2투여 최적화를 실시하면 96개의 잘 조직 수집 상자에서 M2 식물의 잎 조직을 수집한다. 조직은 자아 M1 식물에서 재배 된 M2 식물에서 수집됩니다.각 M1 공장에서 하나의 M2 플랜트가 표시됩니다. 제조업체의 권고에 따라 DNA 정제 시스템을 갖춘 식물 DNA 추출 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다. 그런 다음 16개의 슬롯이 있는 LV 플레이트에 DNA 추출물의 마이크로리터 2개를 적재합니다.260 나노미터및 280 나노미터의 파장에서 분광계를 사용하여 DNA를 정량화합니다. 핵증이 없는 물로 마이크로리터당 DNA 농도를 25나노그램으로 희석시킵니다. 각 샘플의 행 및 컬럼 ID를 유지하면서 4개의 96웰 블록에서 각 우물의 DNA를 풀 플레이트로 결합하여 200 마이크로리터의 4배 의 DNA 풀을 만듭니다.다음으로, 원고에 따라 각 튜브 PCR 버퍼, 전방 및 역 프라이머 및 DNA 폴리머라제에 첨가하여 유전자 특이적 프라이머에 대한 PCR 마스터 믹스 튜브를 준비한다. 96 잘 PCR 플레이트의 우물에 마스터 믹스를 알리 쿼트. 그런 다음 풀이 된 DNA 템플릿을 추가합니다.PCR 튜브를 열 사이클러에 로드하고 터치 다운 프로파일을 사용하여 열 사이클러에서 PCR 반응을 실행합니다. 일치하지 않는 DN사이에 이테로두플렉스를 생성하려면 다른 프로그램에서 열 사이클러에서 PCR 제품을 배양합니다. 그런 다음 각 헤테로두플렉스 PCR 제품에 2.5 마이크로리터의 수제 Cel-1 엔도누셀을 추가합니다.섭씨 45도에서 45분 동안 배양하세요. 그 후, pH 8에서 0.5 어어 EDTA의 2.5 마이크로리터를 추가하여 Cel-1 반응을 종료합니다. 각 Cel-1 처리 된 제품의 30.5 마이크로 리터를 3 % 아가로즈 젤에 5 마이크로 리터와 혼합하고 2 시간 반 동안 100 볼트에서 실행합니다.돌연변이 풀을 감소시키기 위해, 첫 번째 반응이 M2 DNA의 2.5 마이크로리터와 2.5 마이크로리터의 야생 형 DNA를 포함하고 두 번째 반응이 M2 DNA의 5 마이크로 리터를 포함하는 개별 M2 DNA에 대한 두 개의 PCR 반응을 실행하여 돌연변이의 zygosity를 결정한다. 이 프로토콜은 작은 곡물 작물의 EMS 돌연변이와 돌연변이의 특성을 보여줍니다. 투여 곡선은 밀의 세 가지 다른 종에 대한 원하는 50 %의 생존율에 대한 최적의 EMS 용량을 나타냅니다.M2 인구에서 쉽게 식별 가능한 표현형의 존재는 작은 곡물 인구에서 돌연변이 발생의 효과를 확인합니다. 다음은 M2 틸링 인구에서 돌연변이 표현형의 네 가지 예, 보리 M2 인구의 알비노 돌연변이, 보리 M2 인구의 염소 돌연변이, Aegilops tauschii M2 인구에서 분홍색 변색을 가진 변종 돌연변이, 그리고 트리코 모집단에서 낮은 틸러 돌연변이의 네 가지 예입니다. 아가로즈 젤 플랫폼에서 Cel-1을 사용하는 돌연변이 식별은 독특한 절단 밴드에 의해 12개의 돌연변이 풀 중에서 확인된 잠재적인 돌연변이 풀을 보여줍니다.돌연변이 풀의 감소는 돌연변이의 zygosity를 결정하고 개별 견본에 돌연변이를 추적하는 것을 도왔습니다. A4 풀은 상자 4와 상자 4 야생 형 DNA 샘플 모두에서 칼 밴드로 표시된 이종성 돌연변이를 가지고 있었습니다. H5 풀은 독특한 칼 밴드가 Box 5 H5 야생 형 DNA 샘플에만 존재했기 때문에 동종 가성 돌연변이를 포함했다.가장 중요한 단계는 40~60%의 치사율을 달성하기 위해 EMS의 최적 농도를 결정하는 것입니다. 일단 높은 돌연변이 주파수를 가진 틸링 인구가 개발되면 관심있는 임의의 유전자의 기능적 특성화에 사용될 수 있다. 추가적으로, 인구는 작물 개선을 위한 유용한 유전 변이의 근원일 수 있습니다.틸링은 모델 및 작물 식물의 기능적 게놈 연구에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 얻어진 돌연변이의 범위는 오해의 소지가 있을 수 있습니다, 녹아웃, 침묵, 또는 심지어 놓친 양식. EMS는 돌연변이원입니다.따라서 EMS를 취급하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다. 남은 용액을 오염 제거하고 파이펫 팁을 사용했습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

연구

발생학

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Zebrafish의에서 에탄올에 의한 섬유 성 간 모델의 개발은 전구 세포 매개 간세포의 재생을 연구하는

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (NEPTUNE)에 의한 뮤린 신경 판 표적화

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...