Name: development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA, el proyecto Hatch 1016879 y la Estación Experimental Agrícola de Maryland a través de la Subvención MAES No. 2956952.

1. Preparación de la curva dosis para la mutagénesis efectiva
<ol><li>Remoje 100 semillas con el genotipo de interés en seis matraces de vidrio de 250 ml (100 en cada matraz) que contengan 50 ml de agua destilada. Agitar a 100 rpm durante 8 h a temperatura ambiente (RT) para la imbibición por las semillas.</li>
	<li>En una campana de humos, prepare 50 ml de 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% y 1,2% (p/v) solución de metanoesulfonato de etil (EMS) disolviendo 0,167, 0,249, 0,331, 0,415 y 0,498 ml de EMS en agua destilada, resp...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+screening+for+induced+mutations.">Targeted screening for induced mutations.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).</li><li>Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Recovery+of+Mutations+in+Drosophila.">Targeted Recovery of Mutations in Drosophila.</a> Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rare+Mutations+in+Populations:+TILLING+by+Sequencing.">Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing.</a> Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).</li><li>Caldwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structured+mutant+population+for+forward+and+reverse+genetics+in+Barley+(Hordeum+vulgare+L.).">A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.).</a> The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).</li><li>Hazard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Mutations+in+the+Starch+Branching+Enzyme+II+(+SBEII+)+Genes+Increase+Amylose+and+Resistant+Starch+Content+in+Durum+Wheat.">Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat.</a> Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diploid+wheat+TILLING+resource+for+wheat+functional+genomics.">A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics.</a> BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILL-D:+An+Aegilops+tauschii+TILLING+Resource+for+Wheat+Improvement.">TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Fhb1+encodes+a+chimeric+lectin+with+agglutinin+domains+and+a+pore-forming+toxin-like+domain+conferring+resistance+to+Fusarium+head+blight.">Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight.</a> Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).</li><li>Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+spring+hexaploid+wheat+line+with+no+functional+VRN2+genes.">Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).</li><li>Greene, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Chemically+Induced+Mutations+From+a+Large-Scale+Reverse-Genetic+Screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).</li><li>Harwood, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+remaining+challenges+in+the+transformation+of+barley+and+wheat.">Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).</li><li>Henikoff, S., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Nucleotide+Mutations+for+Plant+Functional+Genomics.">Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics.</a> Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).</li><li>Uauy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+TILLING+approach+to+detect+induced+mutations+in+tetraploid+and+hexaploid+wheat.">A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).</li><li>Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Traditional+Mutagenesis+with+New+High-Throughput+Sequencing+and+Genome+Editing+to+Reveal+Hidden+Variation+in+Polyploid+Wheat.">Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat.</a> Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequences+of+1504+Mutants+in+the+Model+Rice+Variety+Kitaake+Facilitate+Rapid+Functional+Genomic+Studies.">The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies.</a> The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+Mutant+Resource+as+an+Efficient+Platform+for+Gene+Discovery+in+Grasses.">A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses.</a> The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).</li><li>Krasileva, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+hidden+variation+in+polyploid+wheat.">Uncovering hidden variation in polyploid wheat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).</li><li>Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+TILLING+Method+for+Wheat+Breeding.">A Modified TILLING Method for Wheat Breeding.</a> The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).</li><li>Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+TILLING+and+Ecotilling+in+plants+and+animals.">A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).</li><li>Wu, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-+and+Irradiation-induced+Mutants+of+Indica+Rice+IR64+for+Forward+and+Reverse+Genetics.">Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics.</a> Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).</li><li>Feldman, M., Levy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Evolution+Due+to+Allopolyploidization+in+Wheat.">Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat.</a> Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).</li><li>Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+and+disadvantages+of+being+polyploid.">The advantages and disadvantages of being polyploid.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Efficient+Mutation+Resource+with+Phenotypic+Variation+in+Hexaploid+Winter+Wheat+and+Identification+of+Novel+Alleles+in+the+TaAGP.L-B1+Gene.">Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li><li>Rakszegi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+agronomic+and+morphological+traits+in+a+mutant+population+of+bread+wheat+studied+in+the+Healthgrain+program.">Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program.</a> Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).</li><li>Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilling+by+Sequencing.">Tilling by Sequencing.</a> Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).</li></ol>

TILLING es una herramienta genética inversa muy valiosa para la validación de genes, especialmente para granos pequeños donde los enfoques basados en la transformación tienen serios cuellos de botella11. El desarrollo de una población mutageneizada con una alta frecuencia de mutación es uno de los pasos críticos en la realización de estudios de genómica funcional. El paso más importante en el desarrollo de una población robusta de TILLING es determinar la concentración óptima de EMS. ...

Las mutaciones puntuales en los genomas pueden servir para muchos propósitos útiles para los investigadores. Dependiendo de su naturaleza y ubicación, estas mutaciones se pueden utilizar para asignar funciones a genes o incluso dominios distintos de proteínas de interés. Por otro lado, como fuente de nueva variación genética, se pueden seleccionar mutaciones útiles para los rasgos deseados utilizando pantallas de fenotipado y se pueden seguir utilizando en la mejora de los cultivos. TILLING es una poderosa herramienta de genética inversa que incluye mutagénesis química y detección de variación de secuencia en el gen objetivo. Desarrollado por primera vez en Arabidopsis1 y Drosophilia melanogaster2, las poblaciones de TILLING se han desarrollado y utilizado en muchos cultivos de grano pequeño como el trigo de pan hexaploide (Triticum aestivum)3, cebada (Hordeum vulgare)4, tetraploide de trigo duro (T. dicoccoides durum)5, trigo diploide (T. monococcum)6 y el genitor genoma "D" de trigo Aegilops tauschii7 . Estos recursos se han utilizado para validar las funciones de los genes en la regulación de la tolerancia al estrés abiótico y biótico8, la regulación del tiempo de floración9,y el desarrollo de variedades de cultivos nutricionalmente superiores5.
TILLING, junto con el uso de agentes mutagénicos altiladores como el metanoesulfonato etílico (EMS), azida sódica, N-metil-N-nitrosourea (MNU) y metanoesulfonato de metilo (MMS), tiene ventajas sobre otras herramientas genéticas inversas por varias razones. En primer lugar, la mutagénesis se puede llevar a cabo en prácticamente cualquier especie o variedad de la planta10 y es independiente del cuello de botella de transformación, que es particularmente difícil en el caso de los granos pequeños11. En segundo lugar, además de generar mutaciones noqueantes que pueden obtenerse mediante otros enfoques de validación genética, se puede inducir una serie de mutaciones erróneas y de empalme, que pueden discernir las funciones de los dominios individuales de las proteínas de interés12. Además, TILLING genera una colección inmortal de mutaciones a lo largo del genoma; por lo tanto, una sola población se puede utilizar para la validación funcional de múltiples genes. Por el contrario, otras herramientas de genética inversa generan recursos específicos sólo del gen en estudio13. Las mutaciones útiles identificadas a través de TILLING pueden desplegarse con fines de reproducción y no están sujetas a regulación, a diferencia de la edición genética, cuya clasificación no transgénica sigue siendo incierta en muchos países. Esto se vuelve especialmente relevante para los granos pequeños que se comercializan internacionalmente14.
TILLING es una estrategia de validación de genes simple y eficiente y requiere que se desarrollen poblaciones mutagenéticas para investigar genes de interés. El desarrollo de una población mutageneizada eficaz es clave para determinar la eficiencia de un estudio de validación de genes basado en TILLING. Una población de TILLING con una frecuencia de mutación global baja indica que una población imprácticamente grande debe ser examinada para detectar las mutaciones deseadas, mientras que una alta concentración de mutágenos conduce a una alta mortalidad en la población y un número insuficiente de individuos mutagenizados. Una vez que se desarrolla una buena población, hay múltiples maneras de detectar mutaciones en los genes de interés, y la elección de la plataforma depende de la escala experimental y la disponibilidad de recursos. La secuenciación del genoma entero y la secuenciación del exónima se ha utilizado para caracterizar todas las mutaciones en las poblaciones de TILLING en plantas con pequeños genomas15,16. La secuenciación de exomas de dos poblaciones DE TILLING se ha realizado en pan y trigo duro y está a disposición del público para identificar mutaciones deseables y ordenar líneas mutantes de interés17. Es un gran recurso público en términos de disponibilidad de mutaciones deseables; sin embargo, en los estudios de validación de genes, la línea de tipo silvestre debe poseer el gen candidato de interés. Desafortunadamente, sigue siendo prohibitivo secuenciar el exóme de toda la población de TILLING para la validación inversa basada en genética de unos pocos genes candidatos en otro contexto. La secuenciación de Amplicon y los ensayos basados en Cel-1 se han utilizado para detectar mutaciones en poblaciones específicas en trigo, y los ensayos Cel-1 son más simples, no requieren conocimientos computacionales, y son especialmente adecuados para la validación de un pequeño número de genes con equipo de laboratorio6,18.
En el presente artículo, se describen métodos para el desarrollo de una buena población TILLING, incluyendo la preparación de la curva de dosificación, mutagénesis y mantenimiento de la población mutante, y la detección de la población mutante utilizando el ensayo Cel-1 basado en PCR . Este protocolo ya se ha implementado con éxito en el desarrollo y la utilización de poblaciones mutagenizadas de Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, cebada, Aegilops tauchii7,y varios Otros. Se incluyen detalles explícitos de estos métodos junto con consejos útiles que ayudarán a los investigadores a desarrollar poblaciones de TILLING, utilizando EMS como mutágeno en cualquier planta de grano pequeño de elección.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well 1.1 ml microtubes in microracks</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>TN0946-08R</td>
			<td>For collecting leaf tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0710-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosprint 96 DNA Plant Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>941558</td>
			<td>Kit for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-1 endonuclease</td>
			<td>Extracted as described by Till et al 2006</td>
			<td></td>
			<td>Single strand specific endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-0880-25G</td>
			<td>EMS, Chemical mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry/Shell freeze system</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>For lyophilization of leaf tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kingfisher Flex purification system</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>5400610</td>
			<td>High throughput DNA extraction robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius gel imaging system</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbit Environ-shaker</td>
			<td>Lab-line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROstar Nano</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Nano drop for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis

La orientación de lesiones locales inducidas en genomas (TILLING) es una poderosa herramienta genética inversa que incluye mutagénesis química y detección de variación de secuencia en genes diana. TILLING es una herramienta de genómica funcional muy valiosa para la validación de genes, especialmente en granos pequeños en los que los enfoques basados en la transformación tienen serias limitaciones. Desarrollar una población mutageneizada robusta es clave para determinar la eficiencia de un estudio de validación de genes basado en TILLING. Una población de TILLING con una frecuencia de mutación general baja indica que se debe examinar una población imprácticamente grande para encontrar las mutaciones deseadas, mientras que una alta concentración de mutágenos conduce a una alta mortalidad en la población, lo que conduce a una número de individuos mutagenizados. Una vez que se desarrolla una población eficaz, hay múltiples maneras de detectar mutaciones en un gen de interés, y la elección de la plataforma depende de la escala experimental y la disponibilidad de recursos. El ensayo Cel-1 y el enfoque basado en gel de agarosa para la identificación de mutantes es conveniente, reproducible y una plataforma menos intensiva en recursos. Es ventajoso porque es simple, no requiere conocimientos computacionales, y es especialmente adecuado para la validación de un pequeño número de genes con equipos básicos de laboratorio. En el presente artículo, se describen los métodos para el desarrollo de una buena población TILLING, incluyendo la preparación de la curva de dosificación, mutagénesis y mantenimiento de la población mutante, y la detección de la población mutante utilizando el ensayo Cel-1 basado en PCR .

La Figura 2 muestra la curva de dosificación del cultivar de trigo de pan hexaploide Jagger, trigo diploide Triticum monococcum6, y un donante genoma de trigo Aegilops tauschii7. Las dosis de EMS para las tasas deseadas de supervivencia del 50% fueron de aproximadamente 0,25%, 0,6% y 0,7% para T. monococcum, Ae. tauschiiy T. aestivum, respectivamente. La mayor tolera...

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Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Descrito es un protocolo para el desarrollo de una población de lesiones locales inducidas dirigidas en genomas (TILLING) en cultivos de grano pequeño con el uso de metanoesulfonato etílico (EMS) como mutágeno. También se proporciona un protocolo para la detección de mutaciones utilizando el ensayo Cel-1.

Desarrollo de lesiones locales inducidas dirigidas en las poblaciones de genomas (TILLING) en cultivos de granos pequeños por mutagénesis etnometametanada

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Este protocolo detalla el desarrollo de poblaciones robustas de TILLING con alta frecuencia de mutación por ems mutagénesis en cultivos de grano pequeño. Las poblaciones de TILLING se pueden utilizar para la genómica funcional, así como para el descubrimiento de genes del espacio genético hacia adelante en cultivos de granos pequeños. Las poblaciones DE TILLING desarrolladas con esta técnica tienen altas frecuencias de mutación, y este protocolo se puede aplicar a cualquier genotipo.La detección de mutaciones basada en el ensayo Cel-1 se puede llevar a cabo utilizando equipos básicos de laboratorio. El paso más importante es determinar la concentración óptima de EMS. Por lo tanto, una curva de dosificación EMS debe hacerse específicamente para la población individual.Para empezar, remoja 100 semillas con el genotipo de interés en cada uno de los seis matraces de vidrio de 250 mililitros, que contienen 50 mililitros de agua destilada. Agitar a 100 RPM durante ocho horas a temperatura ambiente para la imbibición. A continuación, en una campana de humo, preparar 50 mililitros de soluciones EMS de cinco concentraciones diferentes mediante la mezcla de líquido EMS y agua destilada.Después de la inbibición, decantar el agua de cinco matraces. Añadir 50 mililitros de solución EMS en cada uno de los cinco matraces que contienen semillas impregnadas. Agitar los matraces durante 16 horas a 75 RPM y temperatura ambiente.Ahora, decantar la solución emS en una botella de desecho vacía y verter las semillas tratadas en la tela de queso colocadas en una botella de desecho vacía para recogerlas por separado para cada tratamiento. Use agua extra para ayudar a verter las semillas. Además, rocíe varios mililitros de solución inactivadora de EMS en la pared de los matraces contaminados.Y sumerja las puntas de pipeta usadas en la solución durante 24 horas. Inactivar la solución EMS utilizada mediante la adición de un volumen de solución de inactivación de EMS para tratar durante 24 horas. Con una corbata de torsión, sostenga las semillas tratadas con EMS dentro de la tela de queso y lave con agua corriente del grifo durante dos horas.Después del lavado, trasplantar cada semilla individualmente en entrenadores de raíces que contengan tierra para macetas. Cultivar plantas a 20 a 25 grados centígrados durante un período de luz de 16 horas. Después de 15 días de trasplante, revise las plantas y cuente el número de semillas que no germinaron.Registrar datos de supervivencia vegetal. Si la tasa de supervivencia no está dentro de 40 a 60%realizar una segunda ronda de optimización de dosificación con una concentración modificada hasta lograr la tasa de letalidad deseada de 40 Para 60%Después del experimento de mutagénesis, recoger el tejido de la hoja de las plantas M2 en una caja de recolección de tejido de 96 pozos. El tejido se recoge de plantas M2 que fueron cultivadas a partir de plantas de M1 autoatadas.Se muestra una planta M2 de cada planta M1. Extraiga ADN utilizando un kit de extracción de ADN vegetal con un sistema de purificación de ADN siguiendo las recomendaciones del fabricante. A continuación, cargue dos microlitros del extracto de ADN en placas LV con 16 ranuras.Cuantifique el ADN utilizando un espectrofotómetro a longitudes de onda de 260 y 280 nanómetros. Diluir la concentración de ADN a 25 nanogramos por microlitro con agua libre de nucleasas. Cree cuatro acumulaciones de ADN de 200 microlitros combinando el ADN de cada pozo en los cuatro bloques de pozos 96 en una placa de piscina mientras mantiene la identidad de fila y columna de cada muestra.A continuación, prepare un tubo de mezcla maestro de PCR para imprimaciones específicas genéticas añadiendo en cada tampón de PCR de tubo, imprimaciones hacia adelante y hacia atrás, y ADN polimerasa según el manuscrito. Aliquot la mezcla maestra en los pozos de una placa PCR de 96 pozos. A continuación, agregue la plantilla de ADN agrupada.Cargue los tubos PCR en un ciclor térmico y utilice un perfil de touchdown para ejecutar la reacción PCR en el ciclor térmico. Para generar heteroduplexes entre DNAs no coincidentes, incubar productos de PCR en el ciclo térmico en un programa diferente. A continuación, agregue 2,5 microlitros de endonucleasa Cel-1 casera a cada uno de los productos de PCR heteroduplexed.Incubar durante 45 minutos a 45 grados centígrados. Después de eso, terminar la reacción Cel-1 mediante la adición de 2,5 microlitros de 0,5 molar EDTA a pH ocho. Cargue 30,5 microlitros de cada producto tratado Con Cel-1 mezclado con cinco microlitros de tinte en un gel de 3% agarosa y corra a 100 voltios durante dos horas y media.Para desconvoluntar piscinas mutantes, determinar la cigosidad de los mutantes mediante la ejecución de dos reacciones PCR para el ADN M2 individual en el que la primera reacción contiene 2,5 microlitros de ADN M2 y 2,5 microlitros de ADN de tipo salvaje y la segunda reacción contiene sólo cinco microlitros de ADN M2. Este protocolo muestra la mutagenización del SME de los cultivos de granos pequeños y la caracterización de mutantes. La curva de dosificación indica dosis óptimas de EMS para las tasas de supervivencia deseadas del 50% para tres especies diferentes de trigo.La presencia de fenotipos fácilmente identificables en la población M2 confirma la eficacia de la mutagénesis en poblaciones de granos pequeños. Aquí hay cuatro ejemplos de los fenotipos mutantes en las poblaciones M2 TILLING, un mutante albino en una población de cebada M2, un mutante de cloro en una población de cebada M2, un mutante variado con decoloración rosa en una población de Aegilops tauschii M2, y un mutante de baja labranza en una población de Triticum monococcum M2. Una identificación mutante usando Cel-1 en plataformas de gel de agarosa muestra una posible piscina mutante identificada de 12 piscinas mutantes por bandas únicas.La desconvolución de las piscinas mutantes determinó la cigosidad de la mutación y ayudó a rastrear la mutación hasta muestras individuales. La piscina A4 tenía mutaciones heterocigotas, indicadas por bandas cortadas en muestras de ADN de tipo salvaje de la caja 4 y de la caja 4. La piscina H5 contenía mutaciones homocigotas, ya que las bandas únicas de corte sólo estaban presentes en la muestra de ADN de tipo salvaje de la caja 5 H5.El paso más importante es determinar la concentración óptima de EMS para lograr una tasa de letalidad de 40 a 60%. Una vez que se ha desarrollado una población TILLING con una alta frecuencia de mutación, se puede utilizar para la caracterización funcional de cualquier gen de interés. Además, la población puede ser una fuente de variación genética útil para la mejora de los cultivos.TILLING se ha utilizado ampliamente para estudios genómicos funcionales en plantas modelo y de cultivo. La gama de mutaciones obtenidas puede ser missents, knockouts, silent, o incluso misspliced forms. El SME es un mutágeno.Por lo tanto, utilice el equipo de protección personal adecuado mientras manipula el EMS. Descontamine las soluciones sobrantes y las puntas de pipeta usadas.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

La regeneración renal en adultos de pez cebra por gentamicina lesión inducida

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Desarrollo de un Modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el Estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Modelo de impacto cortical controlado de lesión cerebral de ratón con trasplante terapéutico de células neuronales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

Focalización de la placa neural murina mediante nanoinyección in utero (NEPTUNE) en el día embrionario 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...