Name: development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

Bu çalışma USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, Hatch proje 1016879 ve Maryland tarım deney Istasyonu tarafından MAES Grant No 2956952 tarafından desteklenmektedir.

1. etkili mutagenez için dozaj eğrisi hazırlanması
<ol><li>6 250 ml cam flsorlara (her Flask içinde 100) olan 50 ml distile su içeren ilgi genotip ile 100 tohumları ıslatın. Tohum tarafından imbiyon için oda sıcaklığında (RT) 8 h için 100 RPM at sallamak.</li>
	<li>Bir duman kaput, hazırlamak 50 mL 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0%, ve 1,2% (w/v) etil methanesulfonate (EMS) çözelti tarafından 0,167, 0,249, 0,331, 0,415, ve 0,498 mL distile su içinde EMS, sırasıyla. Not: EMS 1,206 g/mL yoğunluğu ile RT ...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+screening+for+induced+mutations.">Targeted screening for induced mutations.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).</li><li>Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Recovery+of+Mutations+in+Drosophila.">Targeted Recovery of Mutations in Drosophila.</a> Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rare+Mutations+in+Populations:+TILLING+by+Sequencing.">Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing.</a> Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).</li><li>Caldwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structured+mutant+population+for+forward+and+reverse+genetics+in+Barley+(Hordeum+vulgare+L.).">A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.).</a> The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).</li><li>Hazard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Mutations+in+the+Starch+Branching+Enzyme+II+(+SBEII+)+Genes+Increase+Amylose+and+Resistant+Starch+Content+in+Durum+Wheat.">Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat.</a> Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diploid+wheat+TILLING+resource+for+wheat+functional+genomics.">A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics.</a> BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILL-D:+An+Aegilops+tauschii+TILLING+Resource+for+Wheat+Improvement.">TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Fhb1+encodes+a+chimeric+lectin+with+agglutinin+domains+and+a+pore-forming+toxin-like+domain+conferring+resistance+to+Fusarium+head+blight.">Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight.</a> Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).</li><li>Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+spring+hexaploid+wheat+line+with+no+functional+VRN2+genes.">Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).</li><li>Greene, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Chemically+Induced+Mutations+From+a+Large-Scale+Reverse-Genetic+Screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).</li><li>Harwood, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+remaining+challenges+in+the+transformation+of+barley+and+wheat.">Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).</li><li>Henikoff, S., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Nucleotide+Mutations+for+Plant+Functional+Genomics.">Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics.</a> Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).</li><li>Uauy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+TILLING+approach+to+detect+induced+mutations+in+tetraploid+and+hexaploid+wheat.">A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).</li><li>Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Traditional+Mutagenesis+with+New+High-Throughput+Sequencing+and+Genome+Editing+to+Reveal+Hidden+Variation+in+Polyploid+Wheat.">Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat.</a> Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequences+of+1504+Mutants+in+the+Model+Rice+Variety+Kitaake+Facilitate+Rapid+Functional+Genomic+Studies.">The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies.</a> The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+Mutant+Resource+as+an+Efficient+Platform+for+Gene+Discovery+in+Grasses.">A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses.</a> The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).</li><li>Krasileva, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+hidden+variation+in+polyploid+wheat.">Uncovering hidden variation in polyploid wheat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).</li><li>Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+TILLING+Method+for+Wheat+Breeding.">A Modified TILLING Method for Wheat Breeding.</a> The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).</li><li>Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+TILLING+and+Ecotilling+in+plants+and+animals.">A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).</li><li>Wu, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-+and+Irradiation-induced+Mutants+of+Indica+Rice+IR64+for+Forward+and+Reverse+Genetics.">Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics.</a> Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).</li><li>Feldman, M., Levy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Evolution+Due+to+Allopolyploidization+in+Wheat.">Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat.</a> Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).</li><li>Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+and+disadvantages+of+being+polyploid.">The advantages and disadvantages of being polyploid.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Efficient+Mutation+Resource+with+Phenotypic+Variation+in+Hexaploid+Winter+Wheat+and+Identification+of+Novel+Alleles+in+the+TaAGP.L-B1+Gene.">Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li><li>Rakszegi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+agronomic+and+morphological+traits+in+a+mutant+population+of+bread+wheat+studied+in+the+Healthgrain+program.">Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program.</a> Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).</li><li>Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilling+by+Sequencing.">Tilling by Sequencing.</a> Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).</li></ol>

TILLING, özellikle dönüşüm tabanlı yaklaşımların ciddi darboğazlara sahip olduğu küçük tahıllar için gen doğrulama için son derece değerli bir tersgenetik araçtır. Yüksek mutasyon frekansı ile mutajize edilmiş bir nüfus geliştirmek fonksiyonel genomik etütler yürütmenin önemli adımlardan biridir. Güçlü bir TILLING nüfus geliştirme en önemli adım EMS optimum konsantrasyon belirlemektir. M1 ' de% 40-60% hayatta kalma oranı, buğday ve arpa<sup class=...

Genomlarda nokta mutasyonları araştırmacılar için birçok yararlı amaca hizmet edebilir. Kendi doğası ve konuma bağlı olarak, Bu mutasyonlar genler ve hatta ilgi proteinlerinin farklı etki alanları için işlevler atamak için kullanılabilir. Öte yandan, yeni genetik varyasyonun kaynağı olarak, fenotipleme ekranları kullanılarak istenilen özellikler için yararlı mutasyonlar seçilebilir ve daha fazla ürün iyileştirmesinde kullanılır. Tilling, kimyasal mutagenez ve hedef geni sıralı varyasyon tespiti içeren güçlü bir ters genetik araçtır. İlk Arabidopsis1 ve drosophilia melanogaster2' de geliştirilen, eğme nüfusu geliştirilen ve Hexaploid ekmek buğday (Triticum aestivum) gibi birçok küçük tahıl bitkileri kullanılan3, arpa (Hordeum vulgare)4, tetraploidlerin durum buğday (t. Triticumdicoccoides durum)5, diploid buğday (t. bağlantılar)6 ve buğday aegilops tauschii7 "D" genom progenitör . Bu kaynaklar Abiotik ve biyotik stres toleransı8düzenleyen genlerin rollerini doğrulamak için kullanılan, çiçekli zaman düzenleyen9, ve beslenme üstün ürün çeşitleri geliştirmek5.
Eğriltme, etil methanesulfonate (EMS), sodyum azid, n-metil-n-nitrosourea (MNU) ve metil methanesulfonate (MMS) gibi alkilleyici mutajenik ajanlar kullanımı ile birlikte, çeşitli nedenlerle diğer ters genetik araçlar üzerinde avantajları vardır. İlk olarak, mutagenez neredeyse herhangi bir tür veya tesis10 çeşitli yapılabilir ve dönüşüm darboğazından bağımsızdır, özellikle küçük tahıllar durumunda zorlu11. İkincisi, diğer gen doğrulama yaklaşımlar tarafından elde edilebilir nakavt mutasyonlar üreten ek olarak, yanlış ve yapıştırma mutasyonlar bir dizi indüklenen olabilir, hangi faiz proteinlerinin bireysel etki fonksiyonları ayırt edebilir12. Ayrıca, TILLING genom boyunca mutasyonlar ölümsüz bir koleksiyon üretir; Böylece, tek bir nüfus birden fazla genlerin işlevsel doğrulama için kullanılabilir. Buna karşılık, diğer ters genetik Araçları çalışma13altında sadece geni spesifik kaynaklar üretir. TILLING ile tanımlanan yararlı mutasyonlar üreme amaçları için dağıtılabilir ve transjenik olmayan sınıflandırma birçok ülkede hala belirsiz olan gen düzenlemesinin aksine yönetmeliğe tabi değildir. Bu, özellikle uluslararası işlem gören küçük taneler ile ilgilidir14.
TILLING basit ve verimli bir gen doğrulama stratejisidir ve ilgi genlerini araştırmak için mutagenized nüfusun geliştirilmesini gerektirir. Etkili bir mutajize nüfus geliştirmek, bir TILLING bazlı gen doğrulama çalışmasının verimliliğini belirlemenin anahtarıdır. Düşük genel mutasyon frekansına sahip bir eğme nüfusu, istenilen mutasyonlar için pratik olmayan büyük bir nüfusun gösterildiğini gösterir, ancak yüksek mutajen konsantrasyonu nüfusun yüksek mortaliteye yol açan ve yetersiz sayıda mutajize bireyler. İyi bir nüfus geliştirdikten sonra, ilgi genlerinde mutasyonları algılamak için birden fazla yol vardır ve platform seçimi, kaynakların deneysel ölçekte ve kullanılabilirliği üzerine bağlıdır. Tüm genom sıralamaları ve ekzom sıralaması, küçük genomlar15,16ile bitkilerin içinde yer alan tüm mutasyonları karakterize etmek için kullanılmıştır. Ekmek ve durum buğday ve arzu mutasyonlar tanımlamak ve ilgi mutant hatları sipariş için kamu için kullanılabilir iki TILLING nüfus exome sıralamaları yapılmıştır17. Bu arzu mutasyonların kullanılabilirliği açısından büyük bir kamu kaynağıdır; Ancak, gen doğrulama çalışmalarında, vahşi tip hattı faiz aday geni sahip olmalıdır. Ne yazık ki, hala maliyet-başka bir arka planda birkaç aday genlerin ters genetik tabanlı doğrulama için tüm Tilling nüfusun ekzom dizisi için yasak. Amplicon sıralaması ve cel-1 tabanlı bilgiler, buğday içinde hedeflenen nüfuslarda mutasyonları tespit etmek için kullanılmıştır ve cel-1 uygulamaları basit, hiçbir Hesaplamalı bilgi gerektiren, ve özellikle temel ile genlerin az sayıda doğrulama için uygundur Laboratuar Ekipmanları6,18.
Bu yazıda, açıklanan iyi bir Tilling nüfus gelişimi için yöntemler, doz eğrisi hazırlanması dahil, mutagenez ve mutant nüfusun bakımı, ve mutant nüfusun tarama PCR tabanlı cel-1 tahlil kullanarak . Bu protokol zaten gelişen ve Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, arpa, aegilops tauchii7ve çeşitli mutagenized nüfusu kullanan başarıyla uygulandı Diğer. Dahil bu yöntemlerin açık detayları ile birlikte araştırmacılar, seçim herhangi bir küçük tahıl bitkisinde bir mutajen olarak EMS kullanarak TILLING nüfus geliştirmek yardımcı olacaktır yararlı ipuçları vardır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well 1.1 ml microtubes in microracks</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>TN0946-08R</td>
			<td>For collecting leaf tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0710-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosprint 96 DNA Plant Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>941558</td>
			<td>Kit for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-1 endonuclease</td>
			<td>Extracted as described by Till et al 2006</td>
			<td></td>
			<td>Single strand specific endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-0880-25G</td>
			<td>EMS, Chemical mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry/Shell freeze system</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>For lyophilization of leaf tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kingfisher Flex purification system</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>5400610</td>
			<td>High throughput DNA extraction robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius gel imaging system</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbit Environ-shaker</td>
			<td>Lab-line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROstar Nano</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Nano drop for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis

Genomlarda indüklenen yerel lezyonlar hedefleme (Tilling) kimyasal mutagenez ve hedef genlerde sıra varyasyonu tespiti içeren güçlü bir ters genetik araçtır. TILLING, özellikle dönüşüm tabanlı yaklaşımların ciddi sınırlamalar tutacağı küçük tahıllarda gen doğrulama için son derece değerli işlevsel bir genomik aracıdır. Sağlam bir mutajize nüfus geliştirmek, bir TILLING bazlı gen doğrulama çalışmasının verimliliğini belirlemenin anahtarıdır. Düşük bir genel mutasyon frekansına sahip bir toprak popülasyon, istenilen mutasyonları bulmak için pratik olmayan büyük bir nüfusun taranması gerektiğini gösterir, ancak yüksek mutajen konsantrasyonu nüfusun yüksek mortaliteye yol açmasına karşın, yetersiz bir mutajize edilen bireylerin sayısı. Etkili bir nüfus geliştirildikten sonra, ilgi bir geni içinde mutasyonları algılamak için birden fazla yol vardır ve platform seçimi, kaynakların deneysel ölçekte ve kullanılabilirliği üzerine bağlıdır. Cel-1 tahlil ve mutant tanımlama için agaroz jel tabanlı yaklaşım, uygun, reproducible ve daha az kaynak yoğun bir platformdur. Bu basit, hiçbir Hesaplamalı bilgi gerektiren, ve özellikle temel Laboratuar donanımları ile genlerin az sayıda doğrulama için uygundur avantajlıdır. Bu yazıda, açıklanan iyi bir Tilling nüfusun geliştirilmesi için yöntemler, doz eğrisi hazırlanması dahil, mutagenez ve mutant nüfusun bakımı, ve mutant nüfusun tarama PCR tabanlı cel-1 tahlil kullanarak .

Şekil 2 hexaploid ekmek buğday organtivar dozaj eğrisi gösterir Jagger, diploid buğday Triticum monokokum6, ve buğday aegilops tauschii7bir genom donör. EMS dozlarda istenen 50% hayatta kalma oranları yaklaşık% 0,25,% 0,6 ve% 0,7 t. bağlantılar, AE. tauschiive t. aestivumiçin sırasıyla. Hexaploid buğday yüksek EMS toleransı, genom tampon kapasitesi n...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Açıklanan bir mutajen olarak etil methanesulfonate (EMS) kullanımı ile küçük tahıl bitkileri nüfus (TILLING) nüfusun hedefleme kaynaklı yerel lezyonlar geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca sağlanan cel-1 tahlil kullanarak mutasyon algılama için bir protokoldür.

Genomlarda (TILLING) küçük tahıl bitkilerinin etil methanesulfonate Mutagenezinde kaynaklı lokal lezyonların hedeflemesinin geliştirilmesi

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Bu protokol, küçük tahıl ürünlerinde EMS mutagenezi ile yüksek mutasyon sıklığına sahip sağlam TILLING popülasyonlarının gelişimini ayrıntılarıyla anlatır. TILLING popülasyonları fonksiyonel genomik lerin yanı sıra küçük tahıl ürünlerinde ileri genetik uzay geni keşfi için de kullanılabilir. Bu teknik kullanılarak geliştirilen TILLING popülasyonları yüksek mutasyon frekanslarına sahiptir ve bu protokol herhangi bir genotipiçin uygulanabilir.Cel-1 test bazlı mutasyon tespiti temel laboratuvar ekipmanları kullanılarak yapılabilir. En önemli adım optimal EMS konsantrasyonu belirlemektir. Bu nedenle, bir EMS doz eğrisi bireysel nüfus için özel olarak yapılmalıdır.Başlamak için, her altı 250 mililitre cam şişeleri ilgi genotip ile 100 tohum ıslatın, distile su 50 mililitre içeren. Imbibition için oda sıcaklığında sekiz saat boyunca 100 RPM çalkalayın. Daha sonra, bir duman kaputunda, EMS sıvı ve distile su karıştırarak beş farklı konsantrasyonlarda EMS çözeltileri 50 mililitre hazırlamak.Imbibition sonra, beş şişesu dışarı decant. Imbibed tohumiçeren beş şişenin her birine 50 mililitre EMS çözeltisi ekleyin. 75 RPM ve oda sıcaklığında 16 saat boyunca şişeleri sallayın.Şimdi, EMS çözeltisini boş bir atık şişesine boşaltın ve her işlem için ayrı ayrı toplamak için boş bir atık şişesine yerleştirilen işlenmiş tohumları peynir bezine dökün. Tohumların dökülmesine yardımcı olmak için ekstra su kullanın. Ayrıca, kirlenmiş şişelerin duvarına eMS inaktive çözeltibirkaç mililitre sprey.Kullanılmış pipet uçlarını 24 saat boyunca çözeltiye batırın. 24 saat boyunca tedavi etmek için bir hacim EMS inactivating çözeltisi ekleyerek kullanılan EMS çözeltisini devre dışı. Bir büküm kravat kullanarak, cheesecloth içinde EMS tedavi tohumları tutun ve iki saat boyunca çalışan musluk suyu altında yıkayın.Yıkadıktan sonra, her tohumu ayrı ayrı çömlekçilik toprağı içeren kök eğitmenlere nakledin. 16 saatlik bir ışık süresi için 20 ila 25 santigrat derecede bitki büyütün. 15 günlük ekimden sonra bitkileri kontrol edin ve çimlenmeyi başaramayan tohum sayısını sayın.Bitki hayatta kalma verilerini kaydedin. Eğer sağkalım oranı %40-60 arasında değilse, istenilen öldürücülük oranına ulaşana kadar modifiye konsantrasyonile ikinci bir doz optimizasyonu turu yapın ve mutagenez deneyinden sonra M2 bitkilerinin yaprak dokusunu 96 kuyudoku toplama kutusunda toplayın. Doku, kendine özgü M1 bitkilerinden yetiştirilen M2 bitkilerinden toplanır.Her M1 tesisinden bir M2 tesisi gösterilmektedir. Üreticinin tavsiyelerini izleyerek DNA arıtma sistemi ile bir bitki DNA çıkarma kiti kullanarak DNA ayıklayın. Daha sonra, 16 yuva ile LV plakaları içine DNA ekstresi iki mikrolitre yükleyin.260 ve 280 nanometre dalga boylarında bir spektrofotometre kullanarak DNA'yı ölçün. DNA konsantrasyonu mikrolitre başına 25 nanogram çekirdeksiz su ile seyreltin. Her numunenin satır ve sütun kimliğini korurken, dört 96 kuyu bloğundaki her kuyudaki DNA'yı bir havuz plakasına birleştirerek 200 mikrolitreden oluşan dört kez DNA havuzu oluşturun.Daha sonra, her tüp PCR tampon, ileri ve ters astarlar ve DNA polimeraz el yazmasına göre ekleyerek gen özel astarlar için bir PCR ana karışım tüp hazırlayın. Aliquot bir 96 iyi PCR plaka kuyuları içine ana karışımı. Ardından, havuza girilen DNA şablonu ekleyin.PCR tüplerini bir termal döngüce yükleyin ve TERMAL döngücün üzerindeki PCR reaksiyonu çalıştırmak için bir touchdown profili kullanın. Uyumsuz NA'lar arasında heterodupleksoluşturmak için, PCR ürünlerini farklı bir programda termal döngüye kuluçkaya yatırın. Daha sonra, heteroduplexed PCR ürünlerinin her birine ev yapımı Cel-1 ensoneklease 2,5 mikrolitre ekleyin.45 santigrat derecede 45 dakika kuluçkaya yat. Bundan sonra, pH sekiz 0,5 molar EDTA 2.5 mikrolitre ekleyerek Cel-1 reaksiyonu sona erdirmek. Yük 30.5 her Cel-1 işlenmiş ürün boya beş mikrolitre ile karışık 3% agarose jel üzerine ve iki buçuk saat boyunca 100 volt çalıştırın.Mutant havuzları deconvolute için, ilk reaksiyon M2 DNA 2.5 mikrolitre ve yabani tip DNA 2.5 mikrolitre ve ikinci reaksiyon m2 DNA sadece beş mikrolitre içeren bireysel M2 DNA için iki PCR reaksiyonları çalıştırarak mutantların zigositlik belirlemek. Bu protokol, EMS'nin küçük tahıl ürünlerinin mutagenize ve mutant karakterizasyonu gösterir. Doz eğrisi buğday üç farklı tür için istenen% 50 sağkalım oranları için optimal EMS dozları gösterir.M2 popülasyonunda kolayca tanımlanabilir fenotiplerin varlığı küçük tane popülasyonlarında mutagenezin etkinliğini doğrular. Burada M2 TILLING popülasyonlarında mutant fenomenlerin dört örneği, arpa M2 popülasyonundaki bir albino mutant, arpa M2 popülasyonunda klormutantı, Aegilops tauschii M2 popülasyonunda pembe renk değişikliği olan bir değişkenli mutant ve Triticum monococcum M2 popülasyonunda düşük çapalayan bir mutant verilebilir. Agarose jel platformlarında Cel-1 kullanılarak yapılan bir mutant tanımlama, 12 mutant havuzundan benzersiz yarık bantlarla tanımlanan potansiyel bir mutant havuzu gösteriyor.Mutant havuzlarının dekonvolution mutasyon un zigosititliliğini belirledi ve mutasyonun tek tek örneklere kadar izini sürmeye yardımcı oldu. A4 havuzunda Box 4 ve Box 4 yabani tip DNA örneklerinde cleaved bantlarla endike heterozigot mutasyonlar vardı. H5 havuzunda homozigot mutasyonlar vardı çünkü sadece Box 5 H5 yabani tip DNA örneğinde benzersiz bölünmüş bantlar mevcuttu.En önemli adım% 40-60 öldürücülük oranı elde etmek için EMS optimal konsantrasyonu belirlemektir. Mutasyon sıklığı yüksek bir TILLING popülasyonu geliştirildikten sonra herhangi bir genin fonksiyonel karakterizasyonu için kullanılabilir. Ayrıca, nüfus ürün geliştirme için yararlı genetik varyasyon kaynağı olabilir.TILLING, model ve ekin bitkilerinde fonksiyonel genomik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Elde edilen mutasyonların aralığı yanlış, nakavt, sessiz, hatta yanlış formları olabilir. EMS bir mutajendir.Bu nedenle, EMS'yi kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. Artık çözeltileri ve kullanılan pipet uçlarını dezenfekte edin.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Gelişim Biyolojisi

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Insan kaynaklı pluripotent kök hücre türetilen nöral hücrelerin terapötik transplantasyonu ile fare beyin yaralanması kontrollü Kortiik darbe modeli

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

Embriyonik Gün 7.5'te In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...