Alpha-Synuclein Preformed Fibril model bliver brugt af laboratorier over hele verden til at studere synucleinopatier. Selv om modellen er blevet brugt med succes af mange laboratorier, har nogle grupper oplevet uoverensstemmelser generere fibrils og producerer konsekvent alfa-synuclein patologi. Vi håber, at denne protokol, som beskriver generering af fibriler fra alfa-synuclein monomerer og brugen af præ-formede fibrils in vivo, kan besvare spørgsmål, som forskerne har om brugen af modellen.
Alpha-Synuclein Preformed Fibril model opsummerer centrale funktioner i Parkinsons sygdom, såsom alfa-synuclein patologi og neurodegeneration. Og det har vist sig at føre til beskedne motoriske funktionsnedsættelser i nogle dyremodeller. Dannelsen af indeslutninger, der indeholder fosforyleret alfa-synuclein og langvarig tidsforløb mod neurodegeneration, giver forskerne forskellige stadier i hele udviklingen af synucleinopatien, til at studere og målrette for potentielle terapeutiske indgreb.
Demonstration af fremstilling af brugerdefinerede glas nåle, er vores lab tekniker, Christopher Kemp. For at begynde denne procedure, tø alpha-synuclein monomerer på is. Re-suspened de optøede monomerer ved forsigtigt at svippe på røret.
Og centrifuge ved 15, 000 g og fire grader Celsius i 10 minutter. Derefter overføres supernatanten til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør, og ler det overførte beløb. Monomererne fortyndes med 1x dPBS til en endelig koncentration på 5 mg pr. ml.
Kort vortex at blande, og kort centrifuge at indsamle alle væsken i bunden af røret. Brug derefter selvklæbende film til at fastgøre mikrocentrifugerørslåget lukket. Placer røret i en orbital termo mixer med et låg i syv dage ved 37 grader Celsius, mens omrystning på 1,000 rpm.
Ved udgangen af syv dage, bør indholdet af røret synes uklart. Først don alle nødvendige personlige værnemidler, herunder handsker, en laboratoriekittel, og et ansigtsskjold. Derefter fastgøres en sonde med en diameter på 3,2 mm i en cellekulturhætte til konverteren.
Indstil sonikatorer amplitude til 30%, og puls til et sekund på og et sekund ud og tiden til et minut. Tø fibrils ved stuetemperatur, og mens du stadig er i kulturhætten, fortyndes fibrils med sterile dPBS. Dernæst dæmpe et lab væv med 70% ethanol og bruge dette til at tørre sonden af sonikatoren til at rense den.
Hæld spidsen af sonden i dobbelt destilleret vand og puls 10 gange for at rengøre sonden yderligere. Efter dette, tør sonden tør med et laboratorievæv. Placer den rensede sondespids i røret af fortyndede fibriler, og placer spidsen i bunden af røret.
Sonikere de fortyndede fibriler ved hjælp af de tidligere indstillede parametre, mens sonden flyttes op og ned under hver puls for at sikre, at alle fibrils i væsken er sonikeret. Efter sonikering, kortvarigt centrifuge i et sekund ved 2, 000 g for at indsamle al væsken fra siderne af røret. Hæld sondespidsen i 1%SDS og puls 10 gange for at rengøre sonden.
Fjern derefter spidsen fra SDS, og nedsænk det i dobbelt destilleret vand, og puls 10 gange. Tør sonden af med et laboratorievæv, der er fugtet med 70 % ethanol, og tør den af med et tørt laboratorievæv. Fjern sonden fra konverteren og opbevar den.
Derefter tørres alle overflader i emhætten af med 1% SDS efterfulgt af 70% ethanol. Til at begynde, placere en siliconiseret glas kapillær rør i et glas nål puller. Tænd for varmeelementet, og lad de vedlagte vægte strække det opvarmede glas kapillærrør.
Brug derefter en saks til at skære det trak glaskapillærrør på det tyndeste punkt i midten og fjern glasnålen fra glasnålens puller. Brug derefter en saks til at skære en længde af krympe wrap slanger til ca 40 mm. Skub krympepakningen over metalnålen på en 10 mikroliter skrå sprøjte.
Brug en åben flamme til at opvarme og holde krympe wrap til nålen, samtidig med at du sørge for at rotere nålen til at anvende varme jævnt. Skub den større ende af den trak glasnål forsigtigt hen over sprøjtens metalnål. Derefter skæres en længde af krympeindpakningsslangen til ca. 40 mm, og skub den forsigtigt hen over glasnålen for at overlappe glasnålens bund og sprøjtens metalnål.
Brug en åben flamme til at opvarme krympepakningen for at fastgøre glasnålen til metalnålen. For yderligere at sikre nålen og forhindre potentielle lækager, skæres en ekstra længde af krympeindpakningsslangen til ca. 40 mm, og skub den forsigtigt hen over glasnålen for at overlappe vinkanlens bund og sprøjtens metalnål. Brug en åben flamme til at opvarme krympepakningen for at fastgøre glasnålen til metalnålen.
Brug derefter en saks til at trimme glasnålen, så spidsen er ca. 8 mm lang. For at teste nålen fyldes en 1 ml sprøjte med en vedhæftet 26 gauge nål med destilleret vand. Fjern metalstemplen fra den brugerdefinerede glasnålesprøjte, og stik kanylen på den vandfyldte sprøjte ind i bunden af den brugerdefinerede sprøjte.
Undersøg grænsefladen af glasnålen og metalnålen for utætheder og for at bekræfte en jævn strøm af vand. Derefter fyldes et mikrocentrifugerør med destilleret vand. Brug den brugerdefinerede glasnålesprøjte til at trække i det destilleret vand.
Undersøg nålen for at bekræfte, at der tages væske ind i sprøjten, og at der ikke er nogen bobler. Hvis der er bobler, eller hvis vandet ikke trækkes op i nålen, kan trimning af nålen hjælpe med at lette trykket. Derefter opbevares sprøjten forsigtigt med de påsatte glasnåle i sprøjtekasserne, indtil det er nødvendigt for operationer.
Undersøgelse med transmission elektron mikroskopi bekræfter tilstedeværelsen af lange fibrils. Til sammenligning er alfa-synuclein monomerer byg synlige og har ingen mærkbar form. Analoid bekræftelse af fibrils bekræftes derefter ved hjælp af en Thioflavin T Assay.
En repræsentativ analyse viser dPBS og mus monomerer producere et lavere signal i relative flouresent enheder i forhold til mus PFFs. Human alpha-synuclein monomer producerer et lignende signal til mus monomer. Mens de menneskelige PFF'er ligeledes producere et højere signal end monomerer.
For at æsler tilstedeværelsen af pelitible fibrils, en sedimentering assay udføres. I både mus og humane PFF prøver, bør supernate overtrædelse have mere protein i pellet end supernatant. I modsætning hertil er størstedelen af proteinet fra musen og menneskelige monomerer til stede i supernatanten med lidt til stede i pellet.
Både mus og humane PFF'er er sonikeret til at producere PFF'er af passende længder til såning alpha synuclein indeslutninger. En omfattende undersøgelse af ca. 500 fibrils afslører, at den gennemsnitlige længde af musefibrils er ca. 44 nanometer. Med 86,6% af PFF'erne, der måler 60 nanometer eller derunder.
Humane PF'er har imidlertid en gennemsnitlig længde på ca. 55,9 nanometer med 69,6 % af PFF'erne, der måler 60 nanometer eller derunder. In vivo-undersøgelse af PFF-effekten bekræftes ved hjælp af immunhisekemi. Indeslutninger dannet i substantia nigra, deler lignende egenskaber til Lewy organer i, at de indeholder fosforyleret alpha synuclein, indeholder aminloyed strukturer, og plet med thioflavin S, og er resistente over for Proteinase K fordøjelsen.
Sonikering kan udsætte den enkelte sonikering til aerosoliserede præfabrikerede fibriler. Som sådan bør korrekt sikkerhedspåklædning bæres og sonikering udføres i en hætte for at minimere risikoen for eksponering.
