Het Alpha-Synuclein Preformed Fibril model wordt door laboratoria wereldwijd gebruikt om synucleinopathieën te bestuderen. Hoewel het model met succes is gebruikt door vele laboratoria, hebben sommige groepen inconsistenties ervaren die fibrils genereren en consistente alfa-synuclein pathologie produceren. We hopen dat dit protocol, dat de generatie fibrils van alfa-synuclein monomeren en het gebruik van voorgevormde fibrils in vivo beschrijft, vragen kan beantwoorden die onderzoekers hebben over het gebruik van het model.
Het Alpha-Synuclein Preformed Fibril-model vat de belangrijkste kenmerken van de ziekte van Parkinson samen, zoals alfa-synucleinpathologie en neurodegeneratie. En het is aangetoond dat het leidt tot bescheiden motorische beperkingen in sommige dierlijke modellen. De vorming van insluitsels die fosforyleerde alfa-synuclein en langdurige tijdskoers naar neurodegeneratie bevatten, biedt onderzoekers verschillende stadia gedurende de progressie van de synucleinopathie, om te bestuderen en te targeten voor potentiële therapeutische interventies.
Demonstreren van de voorbereiding van aangepaste glazen naalden, is onze lab technicus, Christopher Kemp. Om deze procedure te beginnen, ontdooien alpha-synuclein monomeren op ijs. Opnieuw suspened de ontdooide monomeren door zachtjes flicking op de buis.
En centrifuge op 15,000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng vervolgens de supernatant over naar een schone 1,5 mL microcentrifugebuis en neem het overgedragen bedrag. Verdun de monomeren met 1x dPBS tot een uiteindelijke concentratie van 5 mg per mL.
Kort vortex te mengen, en kort centrifuge om alle vloeistof te verzamelen op de bodem van de buis. Gebruik vervolgens lijmfolie om het deksel van de microcentrifugebuis gesloten te maken. Plaats de buis in een orbitale thermo mixer met een deksel gedurende zeven dagen op 37 graden Celsius tijdens het schudden op 1.000 rpm.
Aan het einde van zeven dagen moet de inhoud van de buis troebel lijken. Ten eerste, don alle nodige persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, een lab jas, en een gezichtsschild. Bevestig vervolgens in een celkweekkap een sonde met een diameter van 3,2 mm aan de converter.
Stel de sonicators amplitude op 30%en puls op een seconde op en een seconde uit en de tijd op een minuut. Ontdooi de fibrils bij kamertemperatuur, en terwijl nog in de kweekkap, verdun de fibrils met steriele dPBS. Demp vervolgens een laboratoriumweefsel met 70% ethanol en gebruik dit om de sonde van de sonicator af te vegen om het schoon te maken.
Dompel het puntje van de sonde onder in dubbel gedestilleerd water en pulseer 10 keer om de sonde verder schoon te maken. Daarna veeg je de sonde droog met een laboratoriumweefsel. Plaats de gereinigde sondepunt in de buis van verdunde fibrils en plaats de punt aan de onderkant van de buis.
Sonicate de verdunde fibrils met behulp van de eerder ingestelde parameters tijdens het verplaatsen van de sonde op en neer tijdens elke puls om ervoor te zorgen dat alle fibrils in de vloeistof worden gesoniceerd. Na de sonicatie, kort centrifugeren voor een seconde op 2,000 g om alle vloeistof te verzamelen van de zijkanten van de buis. Dompel de sondepunt onder in 1%SDS en pulseer 10 keer om de sonde schoon te maken.
Verwijder vervolgens de punt van de SDS en dompel deze onder in dubbel gedestilleerd water en pulseer 10 keer. Veeg de sonde met een lab weefsel gedempt met 70%ethanol en veeg het droog met een droog lab weefsel. Maak de sonde los van de converter en sla op.
Daarna veeg je alle oppervlakken in de kap weg met 1%SDS, gevolgd door 70% ethanol. Om te beginnen, plaats een siliconen glazen capillaire buis in een glazen naald trekker. Zet het verwarmingselement aan en laat de bijgevoegde gewichten de verwarmde glazen capillaire buis strekken.
Gebruik vervolgens een schaar om de getrokken glazen bolletje op het dunste punt in het midden te snijden en de glazen naald uit de glazen naaldtrekker te verwijderen. Gebruik vervolgens een schaar om een lengte van krimpfolie buizen te snijden tot ongeveer 40 mm. Schuif de krimpfolie over de metalen naald van een 10 microliter schuine spuit.
Gebruik een open vlam om de krimpfolie op de naald te verwarmen en vast te houden, terwijl u ervoor zorgt dat de naald wordt gedraaid om de warmte gelijkmatig toe te passen. Schuif het grotere uiteinde van de getrokken glazen naald voorzichtig over de metalen naald van de spuit. Snijd hierna een lengte van krimpfolie tot ongeveer 40 mm en schuif deze voorzichtig over de glazen naald om de basis van de glasnaald en de metalen naald van de spuit te overlappen.
Gebruik een open vlam om de krimpfolie te verwarmen om de glazen naald aan de metalen naald te beveiligen. Om de naald verder te beveiligen en mogelijke lekken te voorkomen, snijdt u een extra lengte van krimpfolie tot ongeveer 40 mm en schuift u deze voorzichtig over de glazen naald om de basis van de glazen naald en de metalen naald van de spuit te overlappen. Gebruik een open vlam om de krimpfolie te verwarmen om de glazen naald aan de metalen naald te beveiligen.
Gebruik vervolgens een schaar om de glazen naald te trimmen, zodat de punt ongeveer 8 mm lang is. Om de naald te testen, vul een 1 mL spuit met een bijgevoegde 26 meter naald met gedestilleerd water. Verwijder de metalen zuiger van de aangepaste glasnaalspuit en steek de naald van de met water gevulde spuit in de basis van de aangepaste spuit.
Inspecteer de interface van de glazen naald en de metalen naald op lekken en bevestig een gestage waterstroom. Vul vervolgens een microcentrifugebuis met gedestilleerd water. Gebruik de aangepaste glazen naaldspuit om het gedestilleerde water in te trekken.
Inspecteer de naald om te bevestigen vloeistof wordt genomen in de spuit en dat er geen bubbels. Als er bubbels zijn, of als het water niet in de naald wordt opgesteld, kan het trimmen van de naald helpen de druk te verlichten. Bewaar hierna de spuit voorzichtig met de bijgevoegde glazen naalden, in de spuitdozen tot het nodig is voor operaties.
Onderzoek met transmissieelektronenmicroscopie bevestigt de aanwezigheid van lange fibrils. Ter vergelijking, alpha-synuclein monomeren zijn gerst zichtbaar en hebben geen waarneembare vorm. Analoïde bevestiging van de fibrils wordt vervolgens bevestigd met behulp van een Thioflavine T Assay.
Een representatieve test toont de dPBS en muis monomeren produceren een lager signaal in relatieve flouresent eenheden in vergelijking met muis PFFs. Menselijke alfa-synuclein monomeer produceert een vergelijkbaar signaal aan muis monomeer. Terwijl de menselijke PFFs eveneens een hoger signaal dan monomeren produceren.
Om de aanwezigheid van pelitible fibrils te bespepen, wordt een sedimentatietest uitgevoerd. In zowel de muis en de menselijke PFF monsters, de supernate overtreding moet meer eiwit in de pellet dan de supernatant. Daarentegen is het grootste deel van het eiwit van de muis en menselijke monomeren aanwezig in de supernatant met weinig aanwezig in de pellet.
Zowel muis als menselijke PFF's zijn gesoniceerd om PFF's van de juiste lengtes te produceren voor het zaaien van alfa synuclein insluitsels. Een uitgebreid onderzoek van ongeveer 500 fibrils toont aan dat de gemiddelde lengte van muisfibrils ongeveer 44 nanometer is. Met 86,6% van de PFF's van 60 nanometer of minder.
Menselijke PFF's hebben echter een gemiddelde lengte van ongeveer 55,9 nanometer met 69,6% van de PFF's van 60 nanometer of minder. In vivo wordt onderzoek naar de werkzaamheid van PFF bevestigd met behulp van immunohistochemie. Insluitsels gevormd in de substantia nigra, delen vergelijkbare eigenschappen als Lewy lichamen in dat ze fosforyleerde alfa synuclein bevatten, bevatten aminloyed structuren, en vlek met thioflavine S, en zijn resistent tegen Proteinase K spijsvertering.
Sonicatie kan het individuele soniceren blootstellen aan aerosolized voorgevormde fibrils. Als zodanig moet de juiste veiligheidskleding worden gedragen en sonicatie uitgevoerd in een kap om het risico van blootstelling te minimaliseren.
