अल्फा-सिन्यूक्लिन प्रीफॉर्मेड फिब्रिल मॉडल का इस्तेमाल दुनिया भर में लैब्स द्वारा सिन्यूक्लिनोपैथी का अध्ययन करने के लिए किया जा रहा है । यद्यपि मॉडल का उपयोग कई प्रयोगशालाओं द्वारा सफलतापूर्वक किया गया है, कुछ समूहों ने फाइब्रिल पैदा करने और लगातार अल्फा-सिन्यूक्लिन पैथोलॉजी का उत्पादन करने वाली विसंगतियों का अनुभव किया है। हमें उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल, जो अल्फा-सिन्यूक्लिन मोनोमर से फाइब्रिल्स की पीढ़ी और वीवो में पूर्व-गठित फाइब्रिल्स के उपयोग का विवरण देता है, उन सवालों का जवाब दे सकता है जो शोधकर्ताओं के पास मॉडल के उपयोग के बारे में हैं ।
अल्फा-सिन्यूक्लिन प्रीफॉर्मेड फिब्रिल मॉडल पार्किंसंस रोग की प्रमुख विशेषताओं, जैसे अल्फा-सिन्यूक्लिन पैथोलॉजी और न्यूरोडिजेनरेशन को फिर से अपडेट करता है । और यह कुछ पशु मॉडल में मामूली मोटर हानि के लिए नेतृत्व करने के लिए दिखाया गया है । फॉस्फोरिलेटेड अल्फा-सिन्यूक्लिन और न्यूरोडिजेनरेशन की दिशा में लंबे समय तक चलने वाले समावेशन का गठन शोधकर्ताओं को संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेपों के अध्ययन और लक्ष्य के लिए सिन्यूक्लिनोपैथी की प्रगति के दौरान विभिन्न चरण प्रदान करता है।
कस्टम ग्लास सुइयों की तैयारी का प्रदर्शन, हमारे प्रयोगशाला तकनीशियन, क्रिस्टोफर Kemp है । इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, बर्फ पर अल्फा-सिन्यूक्लिन मोनोमर गल जाएं। ट्यूब पर धीरे-धीरे फ्लिकिंग करके गल गए मोनोमर को फिर से सुस्कर दिया।
और 15, 000 ग्राम और 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र। फिर, सुपरनेट को एक साफ 1.5 एमएल माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और स्थानांतरित राशि को रिकॉर्ड करें। 1x dPBS के साथ मोनोमर को 5 मिलीग्राम प्रति एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला करें।
संक्षेप में भंवर मिश्रण करने के लिए, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र ट्यूब के तल पर तरल के सभी इकट्ठा करने के लिए । इसके बाद, माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब ढक्कन बंद सुरक्षित करने के लिए चिपकने वाली फिल्म का उपयोग करें। ट्यूब को 1, 000 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर सात दिनों के लिए ढक्कन के साथ एक कक्षीय थर्मो मिक्सर में रखें।
सात दिनों के अंत में, ट्यूब की सामग्री टर्बिड दिखाई नी चाहिए। सबसे पहले, दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, और एक चेहरा ढाल सहित सभी आवश्यक व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण डॉन । फिर, सेल कल्चर हुड में, कनवर्टर में 3.2 मिमी व्यास की जांच करें।
सोनिकेटर्स आयाम को 30% और पल्स को एक सेकंड पर और एक सेकंड ऑफ और समय को एक मिनट के लिए सेट करें। कमरे के तापमान पर fibrils गल, और जबकि अभी भी संस्कृति हुड में, बाँझ dPBS के साथ fibrils पतला । इसके बाद, 70% इथेनॉल के साथ एक प्रयोगशाला ऊतक को गीला करें और इसे साफ करने के लिए सोनिकेटर की जांच को मिटाने के लिए इसका उपयोग करें।
जांच को और साफ करने के लिए 10 बार डबल डिस्टर्ब पानी और नाड़ी में जांच की नोक को जलमग्न करें । इसके बाद लैब टिश्यू से जांच को ड्राई कर पोंछ लें। पतला फाइब्रिल की ट्यूब में साफ जांच टिप रखें और ट्यूब के नीचे टिप की स्थिति।
प्रत्येक नाड़ी के दौरान जांच को ऊपर और नीचे ले जाते समय पहले निर्धारित मापदंडों का उपयोग करके पतला फाइब्रिल्स को सोनिकेट करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि तरल में सभी फाइब्रिल सोनिकेटेड हैं। सोनीफिकेशन के बाद, ट्यूब के किनारों से सभी तरल इकट्ठा करने के लिए 2, 000 ग्राम पर एक सेकंड के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें। जांच को साफ करने के लिए 1% एसडीएस और पल्स में 10 बार जांच टिप को जलमग्न करें ।
फिर, एसडीएस से टिप निकालें, और इसे डबल आसुत पानी में डूबे, और 10 बार नाड़ी। 70% इथेनॉल के साथ घटा एक प्रयोगशाला ऊतक के साथ जांच पोंछ और यह एक सूखी प्रयोगशाला ऊतक के साथ सूखी पोंछ। कनवर्टर और स्टोर से जांच अलग करें।
इसके बाद, 1% एसडीएस के साथ हुड में सभी सतहों को मिटा दें और इसके बाद 70% इथेनॉल। शुरू करने के लिए, एक सिलिकॉनाइज्ड ग्लास केशिका ट्यूब को ग्लास सुई खींचने वाले में रखें। हीटिंग तत्व को चालू करें, और संलग्न वजन को गर्म ग्लास केशिका ट्यूब को फैलाने की अनुमति दें।
इसके बाद, बीच में सबसे पतले बिंदु पर खींचा ग्लास केशिका ट्यूब को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें और ग्लास सुई खींचने वाले से ग्लास सुई को हटा दें। फिर, लगभग 40 मिमी तक सिकुड़ने वाली रैप ट्यूबिंग की लंबाई काटने के लिए कैंची का उपयोग करें। एक 10 माइक्रोलीटर beveled सिरिंज की धातु सुई पर हटना लपेटो स्लाइड ।
गर्मी के लिए एक खुली लौ का उपयोग करें और सुई के लिए हटना लपेटो का पालन करें, जबकि सुई को घुमाने के लिए समान रूप से गर्मी लागू करने के लिए सुनिश्चित कर रही है । सिरिंज की धातु सुई पर ध्यान से खींचा कांच सुई के बड़े अंत स्लाइड। इसके बाद, लगभग 40 मिमी तक सिकोड़ने की लंबाई काटें और ग्लास सुई के आधार और सिरिंज की धातु सुई को ओवरलैप करने के लिए इसे कांच की सुई पर सावधानी से स्लाइड करें।
धातु सुई के लिए कांच सुई सुरक्षित करने के लिए हटना लपेटें गर्म करने के लिए एक खुली लौ का प्रयोग करें। सुई को और अधिक सुरक्षित करने और संभावित लीक को रोकने के लिए, लगभग 40 मिमी तक सिकुड़ने वाले रैप ट्यूबिंग की एक अतिरिक्त लंबाई में कटौती करें, और ग्लास सुई के आधार और सिरिंज की धातु सुई को ओवरलैप करने के लिए इसे ध्यान से स्लाइड करें। धातु सुई के लिए कांच सुई सुरक्षित करने के लिए हटना लपेटें गर्म करने के लिए एक खुली लौ का प्रयोग करें।
फिर, कांच की सुई को ट्रिम करने के लिए कैंची का उपयोग करें ताकि टिप लगभग 8 मिमी लंबी हो। सुई का परीक्षण करने के लिए, आसुत पानी के साथ एक संलग्न 26 गेज सुई के साथ एक 1 एमएल सिरिंज भरें। कस्टम ग्लास सुई सिरिंज से धातु प्लंजर निकालें और कस्टम सिरिंज के आधार में पानी से भरी सिरिंज की सुई डालें।
कांच की सुई और लीक के लिए धातु सुई के इंटरफेस का निरीक्षण और पानी के एक सतत प्रवाह की पुष्टि करने के लिए। इसके बाद आसुत पानी से एक माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब भरें। आसुत पानी में आकर्षित करने के लिए कस्टम ग्लास सुई सिरिंज का उपयोग करें।
पुष्टि करने के लिए सुई का निरीक्षण करें सिरिंज में तरल लिया जा रहा है और कोई बुलबुले नहीं हैं। यदि बुलबुले हैं, या यदि पानी सुई में तैयार नहीं किया जा रहा है, तो सुई को ट्रिम करने से दबाव को कम करने में मदद मिल सकती है। इसके बाद, सिरिंज को सर्जरी के लिए आवश्यक होने तक सिरिंज बक्से में संलग्न ग्लास सुइयों के साथ सावधानी से स्टोर करें।
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ परीक्षा लंबी फाइब्रिल की उपस्थिति की पुष्टि करती है। इसकी तुलना में, अल्फा-सिन्यूक्लिन मोनोमर जौ दिखाई देते हैं और उनका कोई प्रत्यक्ष आकार नहीं होता है। इसके बाद थिओफ्लेविन टी परख का उपयोग करके फाइब्रिल्स की एनालाइड पुष्टि की जाती है।
एक प्रतिनिधि परख से पता चलता है कि dPBS और माउस मोनोमर माउस पीएफएफ की तुलना में सापेक्ष आटा इकाइयों में कम संकेत का उत्पादन करते हैं । मानव अल्फा-सिन्यूक्लिन मोनोमर माउस मोनोमर के लिए एक समान संकेत पैदा करता है । जबकि मानव पीएफएफ इसी तरह मोनोमर की तुलना में अधिक संकेत पैदा करते हैं।
पेलिटेबल फिब्रिल्स की उपस्थिति को गधे के लिए, एक तलछट परख की जाती है। माउस और ह्यूमन पीएफएफ दोनों के नमूनों में सुपरनेट उल्लंघन में सुपरनेट के नमूनों की तुलना में पैलेट में अधिक प्रोटीन होना चाहिए। इसके विपरीत, माउस और मानव मोनोमर से प्रोटीन का अधिकांश हिस्सा गोली में थोड़ा मौजूद होने के साथ सुपरनैंट में मौजूद होता है।
माउस और मानव पीएफएफ दोनों को अल्फा सिन्यूक्लिन समावेशन बोने के लिए उचित लंबाई के पीएफएफ का उत्पादन करने के लिए सोनिकेट किया जाता है। लगभग 500 फाइब्रिल्स की एक व्यापक परीक्षा से पता चलता है कि माउस फाइब्रिल्स की औसत लंबाई लगभग 44 नैनोमीटर है। 86.6% पीएफएफ के साथ 60 नैनोमीटर या उससे कम मापने के साथ।
हालांकि, मानव पीएफएफ की औसत लंबाई लगभग 55.9 नैनोमीटर है, जिसमें 60 नैनोमीटर या उससे कम मापने वाले पीएफएफ का 69.6% है। पीएफएफ प्रभावकारिता की वीवो परीक्षा में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके पुष्टि की जाती है। सब्स्तान्टिया निगरा में गठित समावेशन, लेवी निकायों के समान गुणों को साझा करते हैं जिसमें वे फॉस्फोरिलेटेड अल्फा सिन्यूक्लिन होते हैं, इसमें अमीनलॉयड संरचनाएं होती हैं, और थिओफ्लेविन एस के साथ दाग होते हैं, और प्रोटीनेज के पाचन के लिए प्रतिरोधी होते हैं।
सोनीशन व्यक्तिगत सोनिकिंग को एयरोसोलाइज्ड प्रीफॉर्म्ड फिब्रिल्स के लिए बेनकाब कर सकता है। जैसे, उचित सुरक्षा पोशाक पहना जाना चाहिए और जोखिम के जोखिम को कम करने के लिए एक हुड में किया गया सोनिकेशन।
