Name: generation of alpha-synuclein preformed fibrils from monomers and use in vivo
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra Michael J. Fox Foundation, National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke (NS099416) og Weston Brain Institute.

<ol>
	<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice.">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity.">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).</li><li>Paumier, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastriatal+injection+of+pre-formed+mouse+alpha-synuclein+fibrils+into+rats+triggers+alpha-synuclein+pathology+and+bilateral+nigrostriatal+degeneration.">Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration.</a> Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).</li><li>Abdelmotilib, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Synuclein+fibril-induced+inclusion+spread+in+rats+and+mice+correlates+with+dopaminergic+Neurodegeneration.">alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration.</a> Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).</li><li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration.">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129 (2018).</li><li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+Over+Quantity:+Advantages+of+Using+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibril+Triggered+Synucleinopathy+to+Model+Idiopathic+Parkinson's+Disease.">Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 621 (2018).</li><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells.">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li><li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death.">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li><li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates.">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li><li>Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+protein+p62+is+present+in+neuronal+and+glial+inclusions+in+human+tauopathies+and+synucleinopathies.">Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies.</a> Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies.">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li><li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson's+disease.">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li><li>Shimozawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+pathological+alpha-synuclein+in+marmoset+brain.">Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 12 (2017).</li><li>Polinski, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+Practices+for+Generating+and+Using+Alpha-Synuclein+Pre-Formed+Fibrils+to+Model+Parkinson's+Disease+in+Rodents.">Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents.</a> Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).</li><li>Fares, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+de+novo+alpha-synuclein+fibrillization+in+a+neuronal+model+for+Parkinson's+disease.">Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).</li><li>Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+efficacy+of+different+procedures+that+remove+and+disassemble+alpha-synuclein,+tau+and+A-beta+fibrils+from+laboratory+material+and+surfaces.">Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces.</a> Scientific Reports. 8, 10788 (2018).</li><li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents.">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2008).</li><li>Tarutani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Fragmented+Pathogenic+alpha-Synuclein+Seeds+on+Prion-like+Propagation.">The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).</li><li>Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+innervation+of+direct-+and+indirect-pathway+striatal+projection+neurons.">Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons.</a> Neuron. 79, 347-360 (2013).</li></ol>

Joseph Patterson, Kelvin Luk, og Caryl Sortwell er for tiden involvert i kontraktsmessige ordninger med Michael J. Fox Foundation til kvalitetskontroll α-syn materiale generert av Proteos, Inc. medforfatter Nicole Polinski, er en ansatt i Michael J. Fox Foundation, som har kontrakt Proteos, Inc. for å produsere α-syn monomer. Medforfattere Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley, og Nicholas Kanaan har ingenting å avsløre.

Produksjon av α-syn PFFs i stand til seeding neurons og fører til Lewy kropp-lignende inkluderinger er avhengig av flere faktorer og trinn. En kritisk faktor er at monomerer som brukes til å generere fibrils må være spesielt formulert for fibrilization4,9,14,15. Hvis monomerer ikke er formulert for fibrilization, fibrils kan ikke danne eller fibrils som gjør skjemaet kan ikke produsere α-syn patologi. Likeledes, buffer som monomerer er i også påvirke fibrilization. Som sådan, for de beste resultatene, bør salt konsentrasjonen være ca 100 mM NaCl og pH mellom 7,0 og 7,3. Et første skritt som introduserer variasjon er metoden der første proteininnhold bestemmes, med måling på A280 sannsynlig å produsere mer nøyaktige resultater, og derfor er den foretrukne metoden. Avviket i proteinkonsentrasjon kan redusere effekten av fibrilization prosessen, samt endre antatt PFF konsentrasjon som brukes i eksperimenter. Begge kan føre til en nedgang i seeding effektivitet og batch variasjon mellom eksperimenter.
Initial kvalitetskontroll trinn vil bekrefte kritiske funksjoner i PFFs, spesielt at de har en fibrillary konformasjon (elektron mikroskopi), inneholder amyloid strukturer (thioflavin T-analysen), og er pelletable (sedimentering analysen). Det er viktig å merke seg at resultatene av thioflavin T-analysen vil svinge med tiden og er ikke et direkte mål på mengden av amyloid strukturer stede, heller, thioflavin T-analysen bør bare brukes som en indikator på amyloid strukturer tilstedeværelse innen prøven. Thioflavin T brukes vanligvis i in vitro-analyser, slik som den nevnte analysen for å vise fibrils inneholde amyloid strukturer. Alternativt er thioflavin S brukt i vev for å detektere amyloid strukturer, som vist i figur 7. I forhold til sedimentering analysen, resultatene viser bare at PFFs er funnet hovedsakelig i pelletable brøkdel. Som prøvene er kjørt i denaturering forhold, en enkelt fremtredende band på ca 14 kDa, størrelsen på α-syn monomerer, er til stede på gels. Dette er ulikt flere band til stede ved høyere molekyl vekter som ville bli forventet med PFFs hvis en innfødt eller ikke-denaturering gel ble brukt. Til slutt, vellykket bestått av alle disse første kvalitetskontroll trinnene garanterer ikke α-syn inkludering seeding aktivitet. Av denne grunn, cellekultur eksperimenter eller en liten kohort av kirurgisk-injisert dyr bør brukes til å teste effekten av PFFs før bruk i større eksperimenter.
Sonikering er et avgjørende skritt i prosessen og parametrene vil variere avhengig av modell av sonicator som brukes. Sonikering parametere må brukes og verifiseres for å vise at korte PFF fragmenter har blitt produsert. Fibril størrelse har peiling på seeding, med kortere fibrils seeding mer effektivt. Selv om kortere fibrils frø mer effektivt, denne effekten vidder og den optimale PFF lengden er ca 50 NM4,18. Det er også viktig å ikke sonikere prøvene og utsette PFFs for overdreven varme, da dette kan redusere seeding effektivitet. Disse sonikert PFFs skal testes for effekt i små cellekultur eller in vivo eksperimenter før bruk i større skala eksperimenter. Som ulike sonikering økter har potensial til å innføre variasjon, eksperimentell behandling grupper bør planlegges tilsvarende.
Når du leverer PFFs in vivo, kan lokaliseringen av injeksjonsstedet (e) og den totale mengden PFFs som brukes, påvirke antallet neurons som vil utvikle inkluderinger, samt omfanget av neurodegeneration7,14. Koordinatene i protokollen gir et sted å starte, men bør testes i laboratoriet for å sikre den ønskede målregionen utvikler α-syn patologi før bruk i stor skala eksperimenter. Hvis ønskelig, kan spore fargestoff eller fluorescerende perler brukes som en måte å teste regional målretting før du bruker PFFs. Mengden PFFs som brukes i vivo varierer mellom grupper, og de fleste grupper bruker totalt mellom 5 og 20 mikrogram PFFs på ett eller delt mellom to injeksjonssteder1,2,3,4,5 , 6 andre priser , 7 andre er , 14. ettersom antall injeksjonssteder, plassering av injeksjonssteder, og mengden av PFFs injisert kan påvirke resultater og progresjon av synucleinopathy, bør nedstrøms utfall av parametrene karakteriseres før du bruker modellen til å teste potensielle intervensjoner eller undersøke timelige trekk ved modellen.
Når du velger en modell som skal brukes til testing legemiddel selskap eller studere sykdomsprogresjon, bør modellen velges for å best svare på spørsmålet spurt. Ikke alle modeller vil ha visse sykdoms funksjoner av PD, eller tilby den tidsrammen som trengs for å teste potensielle intervensjoner. PFF modellen viser viktige funksjoner i PD, som α-syn patologi og neurodegeneration, og kan føre til beskjedne motoriske hemninger. Modellen tilbyr en forutsigbar og langvarig tid-kurs, der inkluderinger skjema måneder før neurodegeneration. Dette gjør at forskerne kan undersøke og utnytte de ulike fasene gjennom den langvarige utviklingen av synucleinopathy. Den nåværende og fremtidig bruk av modellen generelt er forventet å være fordelaktig i studiet av sykdomsprogresjon og utvikling av romanen terapier.

Parkinsons sykdom (PD) er primært preget postmortem av to store patologiske funksjoner: utbredt og progressiv Alpha-synuclein (α-syn) patologi, og nigrostriatal degenerasjon. Etter injeksjon i wildtype mus eller rotter, α-syn preformed fibrils (PFFs) induserer progressiv akkumulering av patologisk α-syn, noe som kan resultere i langvarige degenerasjon av substantia Nigra Pars compacta (SNpc) dopamin neurons i løpet av mange måneder, samt Sensorimotor underskudd1,2,3,4,5,6. Neurons er eksponert for α-syn fibrils, enten via direkte intracerebrale injeksjon eller lagt til Media av kulturperler neurons. Når PFFs er tatt inn i neurons, den PFFs handle for å "Seed" dannelsen av inkluderinger gjennom templating, og akkumulering av endogene α-syn i fosforylert inkluderinger1,7,8, 9i. Inkluderinger dele lignende egenskaper til Lewy organer: inneholder α-syn fosforylert på Serine 129 (pSyn), ubiquitin, og p62; besitter amyloid kvartær strukturer som vist med positiv thioflavin farging; og er motstandsdyktig mot proteinase K fordøyelse1,3,5,7,8,9,10,11, det er 12. PFF eksponering fører til α-syn inkludering formasjon i primær og noen udødeliggjort neurons i kultur, så vel som mus, rotter, og ikke-menneskelige primater i vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Det er viktig å merke seg at PFFs ikke vil føre til α-syn inkludering formasjon i alle cellekultur modeller og noen kultivert neurons vil frø bedre enn andre.
En annen viktig funksjon i in vivo α-syn PFF modellen er den distinkte sekvensielle patologiske faser som dukker opp over flere måneder. I gnagere, etter intrastriatal injeksjon, α-syn inkludering formasjon generelt topper i SNpc og mange kortikale regioner innen 1-2 måneder. Denne aggregering peak etterfølges av nigrostriatal degenerasjon ≈ 2-4 måneder senere1,3,5. Disse distinkte patologiske stadier gir forskere plattformen som å studere og utvikle strategier som 1) redusere α-syn aggregering, 2) klart allerede dannet α-syn inkluderinger, og/eller 3) hindre påfølgende neurodegeneration. PFF modellen tilbyr distinkte fordeler og ulemper i forhold til neurotoxicant, transgene, og viral vektor mediert α-syn overuttrykte modeller som tidligere gjennomgått6. Valget av hvilken modell eller tilnærming til å ta bør bestemmes av hvilken modell som passer best til spørsmålet etterforskerne spør.
Selv om PFF modellen har blitt utnyttet av mange laboratorier, er det fortsatt grupper som har opplevd uoverensstemmelser med å generere fibrils og produsere konsistent α-syn patologi14. Eksempler på inkonsekvenser spenner fra PFFs som produserer lite eller ingen α-syn patologi, batch til batch seeding effektivitet, og selv svikt i fibrils å danne. Dermed er standardisering av α-syn PFF generasjon og in vivo søknad avgjørende for å muliggjøre nøyaktige tolkninger om virkningen av romanen terapeutiske intervensjoner. Følgende protokoll skisserer trinnene som kreves for generering av PFFs fra α-syn-monomerer, kvalitetskontroll av PFFs-en gang dannet, sonikering og måling av PFFs før bruk, og forslag for å muliggjøre vellykket in vivo-injeksjon av PFFs til rotter eller mus.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >1x Dulbecco's phosphate buffered saline</td>
			<td >Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >AB184674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-alpha-synuclein antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >AB15530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bicinchonic acid</td>
			<td >Thermo Fisher (Pierce)</td>
			<td >PI23228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Medical Shrink Tubing (0.036" inner diameter)</td>
			<td >Nordson Medical</td>
			<td >103-0143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Medical Shrink Tubing (0.044" inner diameter)</td>
			<td >Nordson Medical</td>
			<td >103-0296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Copper sulfate</td>
			<td >Thermo Fisher (Pierce)</td>
			<td >PI23224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >2231000574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Eppendorf ThermoTop heated lid</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5308000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formvar/Carbon coated electron microscopy grids</td>
			<td >Eletron Microscopy Sciences</td>
			<td >FCF300-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length)</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >22-326223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass needle puller</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hamilton syringe</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td >80000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils</td>
			<td >Proteos</td>
			<td >RP-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils</td>
			<td >Proteos</td>
			<td >RP-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orange Medical Shrink Tubing (0.021" inner diameter)</td>
			<td >Nordson Medical</td>
			<td >103-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm M</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P7543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >25530015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Qsonica 3.2 mm tip</td>
			<td >Qsonica</td>
			<td >4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Qsonica Q125 sonicator</td>
			<td >Qsonica</td>
			<td >Q125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thioflavin S</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >T1892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Thioflavin T</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >596200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit</td>
			<td >Genscript</td>
			<td >L00350C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uranyl acetate</td>
			<td >Eletron Microscopy Sciences</td>
			<td >22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of alpha-synuclein preformed fibrils from monomers and use in vivo

Bruk av in vivo Alpha-synuclein preformed fibril (α-syn PFF) modell av synucleinopathy blir stadig mer populært blant forskere som mål å modellere Parkinsons sykdom synucleinopathy og nigrostriatal degenerasjon. Standardisering av α-syn PFF generasjon og in vivo-programmet er avgjørende for å sikre konsistent, robust α-syn patologi. Her presenterer vi en detaljert protokoll for generering av fibrils fra monomere α-syn, post-fibrilization kvalitetskontroll trinn, og foreslåtte parametre for vellykket nevrokirurgisk injeksjon av α-syn PFFs til rotter eller mus. Fra og med monomere α-syn oppstår fibrilization over en 7-dagers inkubasjonsperiode mens risting ved optimale buffer forhold, konsentrasjon og temperatur. Post-fibrilization kvalitetskontroll er vurdert av tilstedeværelsen av pelletable fibrils via sedimentering analysen, dannelsen av amyloid konformasjon i fibrils med en thioflavin T-analysen, og elektron mikroskopisk visualisering av fibrils. Mens vellykket validering ved hjelp av disse analysene er nødvendig for å lykkes, er de ikke tilstrekkelig til å garantere PFFs vil frø α-syn inkluderinger i neurons, slik aggregering aktivitet av hver PFF batch bør testes i cellekultur eller pilot dyr kohorter. Før bruk, PFFs må sonikert under nøyaktig standardiserte forhold, etterfulgt av undersøkelse ved hjelp av elektron mikroskopi eller dynamisk lysspredning for å bekrefte fibril lengder er innenfor optimal størrelse rekkevidde, med en gjennomsnittlig lengde på 50 NM. PFFs kan deretter legges til cellekultur medier eller brukes i dyr. Patologi oppdages av immunostaining for fosforylert α-syn (psyn; Serine 129) er åpenbare dager eller uker senere i cellekultur og gnager modeller.

Generering av fibrils fra α-syn-monomerer begynner med å bestemme konsentrasjonen av monomerer. Både BCA-analysen og måling av absorbansen ved 280 NM (A280) kan brukes til å måle proteininnhold; den BCA analysen resultatene, men foreslo en høyere konsentrasjon enn A280 metoden. PFFs avledet fra mus α-syn monomer hadde en BCA-verdi på 14,05 ± 0,22 og en A280 på 8,05 ± 0,03 μg/μL (figur 1). Likeledes, PFFs avledet fra menneskelige α-syn monomer også ut til å være på en høyere konsentrasjon, med en BCA verdi på 12,95 ± 0,38 og en A280 på 7,83 ± 0,05 μg/μL (figur 1). Den A280 målingene er spesifikke for α-syn basert på inkludering av utryddelse koeffisienter og disse resultatene ble brukt til å fortynne monomerer før 7-dagers inkubasjons.
Før inkubasjons, væsken som inneholder α-syn monomerer var klar, men skal vises grumsete etter fibril formasjon. Undersøkelse med overføring elektron mikroskopi bekreftet tilstedeværelsen av lange fibrils, måling 10-20 NM bred (Figur 4). Til sammenligning var α-syn-monomerer knapt synlige uten merkbar form (Figur 4). Med visuell bekreftelse av fibrillær strukturer, amyloid konformasjon av fibrils er neste trekk ved PFFs som skal bekreftes ved hjelp av en thioflavin T-analysen. Thioflavin T utstillinger forbedret fluorescens ved binding til amyloid; Dermed, økt fluorescerende signal fra prøvene indikerer tilstedeværelsen av amyloid. Som et eksempel, thioflavin i dPBS produsert et signal på 3 287 ± 580 relative fluorescerende enheter (RFU), mus α-syn monomer produserte et signal på 4 174 ± 158 RFU, og musen PFFs produsert et signal på 59 754 ± 6 224 RFU (figur 5). Til sammenligning menneskelige α-syn monomer produsert et lignende signal på 4 158 ± 105 RFU til mus monomer, og menneskelig PFFs produsert et høyere signal på 1 235 967 ± 113 747 RFU sammenlignet med musen PFFs (figur 5). For å vurdere tilstedeværelsen av pelletable fibrils, en sedimentering analysen ble utført. Fibrils vil pellet med sentrifugering. I både mus og menneskelige PFF prøver, bør supernatanten fraksjonen har mer protein i pellet enn supernatanten (figur 6). I kontrast, flertallet av proteinet fra musen og menneskelige monomerer var til stede i supernatanten, med liten til stede i pellet (figur 6). Med PFFs synlig tilstede av elektron mikroskopi, amyloid strukturer tilstede, og fibrils pelletable, PFFs bestått alle in vitro kvalitetskontroll trinn.
Både mus og menneskelig PFFs var sonikert å produsere PFFs av passende lengder for seeding α-syn inkluderinger4,18. PFFs ble fortynnet til den ønskede konsentrasjonen av 4 μg/μL og sonikert. Umiddelbart før kirurgi, 25 representative fibrils ble avbildet av elektron mikroskopi og målt til spot sjekke fibril størrelse. Den sonikert musen PFFs målt 48,8 ± 3,1 NM, mens den menneskelige PFFs målt 52,1 ± 4,4 NM i lengde; PFFs av begge artene var derfor passende lengde (50 NM eller mindre) for å indusere seeding aktivitet. Mer omfattende undersøkelse av ca 500 fibrils avslørte gjennomsnittlig lengde og lengde distribusjon av sonikert musen fibrils. Den gjennomsnittlige lengden var 44,4 ± 0,6 NM, med 86,6% av PFFs måling 60 nm eller mindre (Figur 4). Til sammenligning menneskelige PFFs gjennomsnitt 55,9 ± 1,1 NM med 69,6% av PFFs måling 60 nm eller mindre (Figur 4).
Etter intrastriatal injeksjon av sonikert mus PFFs til rotter som tidligere beskrevet3,5, en rekke vev seksjoner ble behandlet på 2 måneder etter operasjonen, når antall inkludering inneholder neurons er kjent for å Peak i SNpc, for bekreftelse av fosforylert α-syn inkluderinger5. Inkludering av neurons, som indikert av immunhistokjemiske farging for pSyn (antistoff i tabell av materialer) er til stede innenfor SNpc (figur 7), samt andre regioner i hele hjernen som innervate striatum (fremre olfactory nucleus, motor, cingulum, Piriform, prelimbic, somatosensory, entorhinal, og Insular barken, amygdala, striatum)1,3,4,5,19. Disse inkluderinger dele lignende eiendommer med Lewy organer, for eksempel binding thioflavin S, og motstanden av totalt α-syn til proteinase K (figur 7), som vist ved immunhistokjemiske farging (antistoff og proteinase K i tabell over materialer) . Bekreftelse av seeding i hjernen indikerer at in vivo kvalitetskontroll er passert, og alikvoter av PFFs tidligere frosset og reddet fra samme batch kan være sonikert under identiske parametre, med lengder validert, i større eksperimenter.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> Figur 1 . Metoder for generering av α-syn fibrils. Omriss av trinnene som kreves for å produsere fibrils fra α-syn-monomerer. Monomerer er sentrifugert i 10 min (15 000 x g, ved 4 ° c). Supernatanten overføres til et rent rør og protein konsentrasjonen bestemmes av enten absorbansen ved 280 NM, eller en BCA analysen. Grafen viser konsentrasjoner fra menneske-og mus α-syn-monomerer. Kolonner indikerer gruppe betyr, feilfelt representerer ± 1 standard feil av gjennomsnittet. Etter at protein konsentrasjonen er fastslått, er α-syn-monomerer fortynnet, kort blåste og inkubert for 37 ° c i 7 dager, mens risting på en orbital mikser satt til 1 000 RPM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> Figur 2 . Farging metoder for overføring elektron mikroskopi. Diagram av negative flekker for elektron mikroskopi. A) bilder som viser elektron mikroskopi prøve nett. Rutenettet har en kjedelig eller lett side og en skinnende eller mørk side. Den blanke/mørke siden er belagt med en formbar/Carbon støtte film. B) illustrasjon av farge prosedyre. Rutenettet er fløt skinnende/mørk side ned på den første dråpe ddH2O for 1 min og det overskytende er onde unna med filter papir. Prosessen gjentas med den andre dråpe ddH2o, utvannet PFFs eller monomerer, to dråper uranylnitratet acetate, og to ekstra dråper ddH2O. rutenett kan lagres i en rutenett boks til avbildet. Scale bar = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> Figur 3 . Montering av tilpassede glass nål sprøyter. Diagram over trinnene som kreves for å montere glass nål vedlagte sprøyter. Silikonbehandlet glass kapillærrør trekkes og kuttes i midten for å produsere glass nåler. Krympe wrap slangen brukes til å forberede metall nålen og danner en indre forsegling når glass nålen er gled på metall nålen. To ekstra lag av krympe-wrap slange som overlapper bunnen av glass nålen og metall nålen er fortløpende lagt til og varme brukes til å feste glass nålen og danner en vann-tett forsegling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> Figur 4 . Visualisering av α-syn monomerer og α-syn fibrils via overføring elektron mikroskopi. Representative micrographs av α-syn monomerer og fibrils. Top paneler: mus og menneskelig α-syn monomer. Midtre paneler: full lengde mus og menneske α-syn PFFs. bunnplater: mus og menneske α-syn PFFs etter sonikering. Bottom graf: fordeling av sonikert mus og menneskelige α-syn PFF lengder. Scale bar = 500 NM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> Figur 5 . Bekreftelse av amyloid strukturer av thioflavin T-analysen. Måling av fluorescerende signal fra mus og menneskelige α-syn monomer og PFF prøver. Venstre: resultater fra mus α-syn monomerer og α-syn PFFs. Høyre: resultater fra menneske α-syn-monomerer og α-syn PFFs. En dPBS negativ kontroll vises i hver graf. Alle målinger uttrykkes som relative fluorescerende enheter (RFU). Kolonner indikerer gruppe betyr, feilfelt representerer ± 1 standard feil av gjennomsnittet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> Figur 6 . Sedimentering-analysen for pelletable α-syn. bilder fra Coomassie beiset gels. Bandene som vises er på ca 14 kDa basert på protein stigen. Venstre: mus monomer og PFFs. Høyre: Human monomerer og PFFs. For alle monomer og PFF prøver, blir resuspendert pellet (P) og supernatanten (S) vist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> Figur 7 . Funksjoner av inkluderinger i rotte modellen bekrefter α-syn patologi. Representative micrographs fra substantia Nigra Pars compacta ved 2 måneder etter injeksjon. Venstre: nevroner som inneholder pSyn og counterstained med cresyl fiolett. Middle: Thioflavin S positive neurons. Høyre: α-syn-inneholdende inkluderinger motstandsdyktig mot proteinase K. Scale bar = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo at JoVE.com

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Generering av Alpha-Synuclein preformed fibrils fra monomerer og bruk in vivo

Målet med denne artikkelen er å skissere trinnene som kreves for generering av fibrils fra monomere Alpha-synuclein, påfølgende kvalitetskontroll, og bruk av preformed fibrils in vivo.

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Alpha-Synuclein Preformed Fibril modellen brukes av laboratorier over hele verden for å studere synucleinopathies. Selv om modellen har blitt brukt med hell av mange laboratorier, har noen grupper opplevd uoverensstemmelser som genererer fibriller og produserer konsekvent alfa-synuclein patologi. Vi håper at denne protokollen, som beskriver genereringen av fibriller fra alfa-synuclein monomerer og bruk av forhåndsdannede fibriller in vivo, kan svare på spørsmål som forskere har om bruken av modellen.Alpha-Synuclein Preformed Fibril-modellen rekafulerer viktige trekk ved Parkinsons sykdom, som alfa-synuclein patologi og nevrodegenerasjon. Og det har vist seg å føre til beskjedne motoriske forringelser i noen dyremodeller. Dannelsen av inneslutninger som inneholder fosforylert alfasynuclein og langvarig tidsforløpet mot nevrodegenerasjon gir forskere ulike stadier gjennom hele synucleinopatiens progresjon, for å studere og målrette for potensielle terapeutiske inngrep.Viser utarbeidelsen av tilpassede glassnåler, er vår lab tekniker, Christopher Kemp. For å begynne denne prosedyren, tine alfa-synuclein monomerer på is. Re-suspened de tinte monomerer ved å forsiktig knipse på røret.Og sentrifuge på 15, 000 g og fire grader Celsius i 10 minutter. Deretter overfører du supernatanten til et rent 1,5 ml mikro sentrifugerør og registrerer mengden som overføres. Fortynn monomerene med 1x dPBS til en endelig konsentrasjon på 5 mg per ml.Kort virvel å blande, og kort sentrifuge å samle all væsken på bunnen av røret. Deretter bruker du klebefilm for å feste mikrosentridrifugerørlokket lukket. Plasser røret i en orbital termomikser med et lokk i syv dager ved 37 grader Celsius mens du rister ved 1000 o/min.På slutten av syv dager skal innholdet i røret virke uklart. Først må du først ha alt nødvendig personlig verneutstyr, inkludert hansker, en laboratoriefrakk og et ansiktsskjold. Deretter, i en cellekultur hette, fest en 3,2 mm diameter sonde til omformeren.Sett sonicators amplitude til 30%og puls til ett sekund på og ett sekund av og tiden til ett minutt. Tin fibrillene ved romtemperatur, og mens de fortsatt er i kulturhetten, fortynne fibrillene med sterile dPBS. Deretter fukter du et laboratorievev med 70% etanol og bruker dette til å tørke sonden på sonicatoren for å rengjøre den.Senk spissen av sonden i dobbelt distilert vann og puls 10 ganger for å rengjøre sonden ytterligere. Etter dette tørker du sonden tørr med et laboratorievev. Plasser den rengjorte probespissen i røret av fortynnede fibriller og plasser spissen nederst på røret.Sonicate de fortynnede fibrillene ved hjelp av de tidligere innstilte parametrene mens du flytter sonden opp og ned under hver puls for å sikre at alle fibrillene i væsken blir sonikert. Etter sonikering sentrifuger du i ett sekund ved 2 000 g for å samle all væsken fra sidene av røret. Senk probespissen ned i 1% SDS og puls 10 ganger for å rengjøre sonden.Deretter fjerner du spissen fra SDS, og senker den ned i dobbelt destillert vann, og pulserer 10 ganger. Tørk sonden med et laboratorievev fuktet med 70% etanol og tørk den tørr med et tørt laboratorievev. Koble sonden fra omformeren og oppbevar.Etter dette tørker du ned alle overflater i hetten med 1% SDS etterfulgt av 70% etanol. For å begynne, legg et silikonisert glasskapillærrør i en glassnåltrekker. Slå på varmeelementet, og la de vedlagte vektene strekke det oppvarmede glasskapillærrøret.Deretter bruker du saks til å kutte det trukket glasskapillærrøret på det tynneste punktet i midten og fjerne glassnålen fra glassnåltrekkeren. Deretter bruker du saks til å kutte en lengde på krympeplastrør til ca. 40 mm. Skyv krympewraen over metallnålen på en 10 mikroliter skråsprøyte.Bruk en åpen flamme til å varme og feste krympeplastet til nålen, samtidig som du må rotere nålen for å bruke varmen jevnt. Skyv den større enden av den trukket glassnålen forsiktig over sprøytens metallnål. Etter dette, kutt en lengde av krympe wrap rør til ca 40 mm og forsiktig skyve den over glass nålen for å overlappe bunnen av glass nålen og metall nålen av sprøyten.Bruk en åpen flamme til å varme krympeplastet for å feste glassnålen til metallnålen. For å sikre nålen ytterligere og forhindre potensielle lekkasjer, kutt en ekstra lengde med krympeinnpakningsrør til ca. 40 mm, og skyv den forsiktig over glassnålen for å overlappe bunnen av glassnålen og sprøytens metallnål. Bruk en åpen flamme til å varme krympeplastet for å feste glassnålen til metallnålen.Deretter bruker du saks til å trimme glassnålen slik at spissen er ca. 8 mm lang. For å teste nålen, fyll en 1 ml sprøyte med en vedlagt 26 gauge kanyle med destillert vann. Fjern metallstempelet fra den tilpassede glassnålesprøyten og sett nålen på den vannfylte sprøyten inn i bunnen av den tilpassede sprøyten.Inspiser grensesnittet til glassnålen og metallnålen for lekkasjer og for å bekrefte en jevn strøm av vann. Fyll deretter et mikrosentrigerrør med destillert vann. Bruk den tilpassede glassnålesprøyten til å tegne i det destillerte vannet.Inspiser nålen for å bekrefte at væske blir tatt inn i sprøyten og at det ikke er noen bobler. Hvis det er bobler, eller hvis vannet ikke blir trukket opp i nålen, kan trimming av nålen bidra til å lindre trykket. Etter dette, oppbevar sprøyten forsiktig med de vedlagte glassnålene, i sprøyteboksene til det er nødvendig for operasjoner.Undersøkelse med transmisjonselektronmikroskopi bekrefter tilstedeværelsen av lange fibriller. Til sammenligning er alfa-synuclein monomerer bygg synlig og har ingen merkbar form. Analoid bekreftelse av fibrillene blir deretter bekreftet ved hjelp av en Thioflavin T-analyse.En representativ analyse viser dPBS og mus monomerer produsere et lavere signal i relative flouresent enheter sammenlignet med mus PFFs. Human alfa-synuclein monomer produserer et lignende signal til mus monomer. Mens de menneskelige PFFs også produsere et høyere signal enn monomerer.For å esel tilstedeværelsen av pelitible fibrils, utføres en sedimenteringsanalyse. I både mus og menneskelige PFF-prøver bør den overnave bruddet ha mer protein i pellet enn det overnaturlige. I motsetning er flertallet av proteinet fra musen og menneskelige monomerer tilstede i det overnaturlige med lite tilstede i pelleten.Både mus og menneskelige PFFs er sonikert for å produsere PFFs av passende lengder for seeding alfa synuclein inneslutninger. En omfattende undersøkelse av ca 500 fibriller avslører at den gjennomsnittlige lengden på musfibriller er ca 44 nanometer. Med 86,6 % av PFF-ene som måler 60 nanometer eller mindre.Menneskelige PFFs har imidlertid en gjennomsnittlig lengde på ca. 55,9 nanometer med 69,6 % av PFF-ene som måler 60 nanometer eller mindre. In vivo undersøkelse av PFF effekt er bekreftet ved hjelp av immunohistochemistry. Inneslutninger dannet i substantia nigra, deler lignende egenskaper til Lewy-legemer ved at de inneholder fosforylert alfasynuclein, inneholder aminloyed strukturer og flekk med thioflavin S, og er motstandsdyktige mot Proteinase K fordøyelsen.Sonikering kan utsette den enkelte sonikering for aerosoliserte preformede fibriller. Som sådan bør riktig sikkerhetsantrekk brukes og sonikering utføres i en hette for å minimere risikoen for eksponering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Merking Tillater målrettet Ekstracellulær Single-enhet Opptak fra Identifiserte Nerveceller<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generering av Topically Transgene Rats etter<em&gt; I utero</em&gt; Electroporation og<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminesens Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo tilbe Intakt Vomeronasal orgel og tilbehør luktelappen

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funksjonell testing av to netthinne etter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Sekvensiell Utvinning av løselig og uløselig Alpha-synuclein fra Parkinson Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminesens Imaging av nevroinflammasjon i transgene mus etter Peripheral Inokulering av Alfa synukleinfibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Eksogene administrasjon av Microsomes-assosiert Alpha-synuclein-aggregater til primære Neurons som kraftig celle modell Fibrils formasjonen

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...