Alpha-Synuclein Preformed Fibril modellen brukes av laboratorier over hele verden for å studere synucleinopathies. Selv om modellen har blitt brukt med hell av mange laboratorier, har noen grupper opplevd uoverensstemmelser som genererer fibriller og produserer konsekvent alfa-synuclein patologi. Vi håper at denne protokollen, som beskriver genereringen av fibriller fra alfa-synuclein monomerer og bruk av forhåndsdannede fibriller in vivo, kan svare på spørsmål som forskere har om bruken av modellen.
Alpha-Synuclein Preformed Fibril-modellen rekafulerer viktige trekk ved Parkinsons sykdom, som alfa-synuclein patologi og nevrodegenerasjon. Og det har vist seg å føre til beskjedne motoriske forringelser i noen dyremodeller. Dannelsen av inneslutninger som inneholder fosforylert alfasynuclein og langvarig tidsforløpet mot nevrodegenerasjon gir forskere ulike stadier gjennom hele synucleinopatiens progresjon, for å studere og målrette for potensielle terapeutiske inngrep.
Viser utarbeidelsen av tilpassede glassnåler, er vår lab tekniker, Christopher Kemp. For å begynne denne prosedyren, tine alfa-synuclein monomerer på is. Re-suspened de tinte monomerer ved å forsiktig knipse på røret.
Og sentrifuge på 15, 000 g og fire grader Celsius i 10 minutter. Deretter overfører du supernatanten til et rent 1,5 ml mikro sentrifugerør og registrerer mengden som overføres. Fortynn monomerene med 1x dPBS til en endelig konsentrasjon på 5 mg per ml.
Kort virvel å blande, og kort sentrifuge å samle all væsken på bunnen av røret. Deretter bruker du klebefilm for å feste mikrosentridrifugerørlokket lukket. Plasser røret i en orbital termomikser med et lokk i syv dager ved 37 grader Celsius mens du rister ved 1000 o/min.
På slutten av syv dager skal innholdet i røret virke uklart. Først må du først ha alt nødvendig personlig verneutstyr, inkludert hansker, en laboratoriefrakk og et ansiktsskjold. Deretter, i en cellekultur hette, fest en 3,2 mm diameter sonde til omformeren.
Sett sonicators amplitude til 30%og puls til ett sekund på og ett sekund av og tiden til ett minutt. Tin fibrillene ved romtemperatur, og mens de fortsatt er i kulturhetten, fortynne fibrillene med sterile dPBS. Deretter fukter du et laboratorievev med 70% etanol og bruker dette til å tørke sonden på sonicatoren for å rengjøre den.
Senk spissen av sonden i dobbelt distilert vann og puls 10 ganger for å rengjøre sonden ytterligere. Etter dette tørker du sonden tørr med et laboratorievev. Plasser den rengjorte probespissen i røret av fortynnede fibriller og plasser spissen nederst på røret.
Sonicate de fortynnede fibrillene ved hjelp av de tidligere innstilte parametrene mens du flytter sonden opp og ned under hver puls for å sikre at alle fibrillene i væsken blir sonikert. Etter sonikering sentrifuger du i ett sekund ved 2 000 g for å samle all væsken fra sidene av røret. Senk probespissen ned i 1% SDS og puls 10 ganger for å rengjøre sonden.
Deretter fjerner du spissen fra SDS, og senker den ned i dobbelt destillert vann, og pulserer 10 ganger. Tørk sonden med et laboratorievev fuktet med 70% etanol og tørk den tørr med et tørt laboratorievev. Koble sonden fra omformeren og oppbevar.
Etter dette tørker du ned alle overflater i hetten med 1% SDS etterfulgt av 70% etanol. For å begynne, legg et silikonisert glasskapillærrør i en glassnåltrekker. Slå på varmeelementet, og la de vedlagte vektene strekke det oppvarmede glasskapillærrøret.
Deretter bruker du saks til å kutte det trukket glasskapillærrøret på det tynneste punktet i midten og fjerne glassnålen fra glassnåltrekkeren. Deretter bruker du saks til å kutte en lengde på krympeplastrør til ca. 40 mm. Skyv krympewraen over metallnålen på en 10 mikroliter skråsprøyte.
Bruk en åpen flamme til å varme og feste krympeplastet til nålen, samtidig som du må rotere nålen for å bruke varmen jevnt. Skyv den større enden av den trukket glassnålen forsiktig over sprøytens metallnål. Etter dette, kutt en lengde av krympe wrap rør til ca 40 mm og forsiktig skyve den over glass nålen for å overlappe bunnen av glass nålen og metall nålen av sprøyten.
Bruk en åpen flamme til å varme krympeplastet for å feste glassnålen til metallnålen. For å sikre nålen ytterligere og forhindre potensielle lekkasjer, kutt en ekstra lengde med krympeinnpakningsrør til ca. 40 mm, og skyv den forsiktig over glassnålen for å overlappe bunnen av glassnålen og sprøytens metallnål. Bruk en åpen flamme til å varme krympeplastet for å feste glassnålen til metallnålen.
Deretter bruker du saks til å trimme glassnålen slik at spissen er ca. 8 mm lang. For å teste nålen, fyll en 1 ml sprøyte med en vedlagt 26 gauge kanyle med destillert vann. Fjern metallstempelet fra den tilpassede glassnålesprøyten og sett nålen på den vannfylte sprøyten inn i bunnen av den tilpassede sprøyten.
Inspiser grensesnittet til glassnålen og metallnålen for lekkasjer og for å bekrefte en jevn strøm av vann. Fyll deretter et mikrosentrigerrør med destillert vann. Bruk den tilpassede glassnålesprøyten til å tegne i det destillerte vannet.
Inspiser nålen for å bekrefte at væske blir tatt inn i sprøyten og at det ikke er noen bobler. Hvis det er bobler, eller hvis vannet ikke blir trukket opp i nålen, kan trimming av nålen bidra til å lindre trykket. Etter dette, oppbevar sprøyten forsiktig med de vedlagte glassnålene, i sprøyteboksene til det er nødvendig for operasjoner.
Undersøkelse med transmisjonselektronmikroskopi bekrefter tilstedeværelsen av lange fibriller. Til sammenligning er alfa-synuclein monomerer bygg synlig og har ingen merkbar form. Analoid bekreftelse av fibrillene blir deretter bekreftet ved hjelp av en Thioflavin T-analyse.
En representativ analyse viser dPBS og mus monomerer produsere et lavere signal i relative flouresent enheter sammenlignet med mus PFFs. Human alfa-synuclein monomer produserer et lignende signal til mus monomer. Mens de menneskelige PFFs også produsere et høyere signal enn monomerer.
For å esel tilstedeværelsen av pelitible fibrils, utføres en sedimenteringsanalyse. I både mus og menneskelige PFF-prøver bør den overnave bruddet ha mer protein i pellet enn det overnaturlige. I motsetning er flertallet av proteinet fra musen og menneskelige monomerer tilstede i det overnaturlige med lite tilstede i pelleten.
Både mus og menneskelige PFFs er sonikert for å produsere PFFs av passende lengder for seeding alfa synuclein inneslutninger. En omfattende undersøkelse av ca 500 fibriller avslører at den gjennomsnittlige lengden på musfibriller er ca 44 nanometer. Med 86,6 % av PFF-ene som måler 60 nanometer eller mindre.
Menneskelige PFFs har imidlertid en gjennomsnittlig lengde på ca. 55,9 nanometer med 69,6 % av PFF-ene som måler 60 nanometer eller mindre. In vivo undersøkelse av PFF effekt er bekreftet ved hjelp av immunohistochemistry. Inneslutninger dannet i substantia nigra, deler lignende egenskaper til Lewy-legemer ved at de inneholder fosforylert alfasynuclein, inneholder aminloyed strukturer og flekk med thioflavin S, og er motstandsdyktige mot Proteinase K fordøyelsen.
Sonikering kan utsette den enkelte sonikering for aerosoliserte preformede fibriller. Som sådan bør riktig sikkerhetsantrekk brukes og sonikering utføres i en hette for å minimere risikoen for eksponering.
