Alpha-Synuclein Preformed Fibril modellen används av laboratorier över hela världen för att studera synucleinopathies. Även om modellen har använts framgångsrikt av många labs, vissa grupper har upplevt inkonsekvenser genererar fibriller och producerar konsekvent alfa-synuclein patologi. Vi hoppas att detta protokoll, som beskriver generering av fibriller från alfa-synukleinmonomerer och användningen av färdigformade fibriller in vivo, kan svara på frågor som forskare har om användningen av modellen.
Alpha-Synuclein Preformed Fibril modellen rekapitulerar viktiga funktioner i Parkinsons sjukdom, såsom alfa-synuklein patologi och neurodegeneration. Och det har visat sig leda till blygsamma motoriska funktionsnedsättningar i vissa djurmodeller. Bildandet av inneslutningar som innehåller fosforylerat alfa-synuklein och utdragen tidsförlopp mot neurodegeneration erbjuder forskare olika stadier under hela utvecklingen av synucleinopatin, att studera och rikta för potentiella terapeutiska interventioner.
Demonstrerar utarbetandet av anpassade glas nålar, är vår lab tekniker, Christopher Kemp. För att börja detta förfarande, tina alfa-synuklein monomerer på is. Re-suspened de tinade monomers genom att försiktigt snärta på röret.
Och centrifug vid 15, 000 g och fyra grader Celsius i 10 minuter. Sedan överför du supernatanten till ett rent 1,5 mL mikrocentrifugrör och registrerar den överförda mängden. Späd monomererna med 1x dPBS till en slutkoncentration på 5 mg per mL.
Kort virvel att blanda, och kort centrifug att samla in all vätska i botten av röret. Därefter använder självhäftande film för att säkra locket mikro centrifugrör stängd. Placera röret i en orbital termo mixer med lock i sju dagar på 37 grader Celsius medan skakar på 1, 000 rpm.
Vid slutet av sju dagar, bör innehållet i röret visas grumligt. Först, don alla nödvändiga personlig skyddsutrustning inklusive handskar, en labbrock, och ett ansikte sköld. Sedan, i en cellkultur huva, bifoga en 3,2 mm diameter sond till omvandlaren.
Ställ in sonicators amplituden till 30%och puls till en sekund på och en sekund av och tiden till en minut. Tina fibrillerna i rumstemperatur, och medan du fortfarande är i kulturhuven, späd fibrillerna med steril dPBS. Därefter dämpa en labbvävnad med 70%etanol och använd detta för att torka av sonden av sonicator för att rengöra den.
Dränk sondens spets i dubbelt destillerat vatten och puls 10 gånger för att rengöra sonden ytterligare. Efter detta torkar du sonden torr med en labbvävnad. Placera den rengjorda sondspetsen i tuben med utspädda fibriller och placera spetsen längst ned på röret.
Sonikera de utspädda fibrillerna med hjälp av de tidigare inställda parametrarna medan du flyttar sonden uppåt och nedåt under varje puls för att säkerställa att alla fibrillerna i vätskan är sonicated. Efter ultraljudsbehandling, kort centrifug för en sekund på 2, 000 g att samla all vätska från sidorna av röret. Dränk sondspetsen i 1%SDS och puls 10 gånger för att rengöra sonden.
Ta sedan bort spetsen från SDS, och dränka den i dubbeldestillerat vatten, och puls 10 gånger. Torka av sonden med en labvävnad dämpad med 70%etanol och torka den torr med en torr labbvävnad. Lossa sonden från omvandlaren och förvara.
Efter detta torkar du av alla ytor i huven med 1%SDS följt av 70%etanol. Till att börja placera en silikoniserad glas kapillärrör i ett glas nål puller. Sätt på värmeelementet, och låt de bifogade vikterna sträcka det uppvärmda glas kapillärröret.
Därefter använder sax för att skära det dragna glas kapillärröret på den tunnaste punkten i mitten och ta bort glasnålen från glasnålsdragaren. Använd sedan sax för att skära en längd av krympplaströr till cirka 40 mm. Skjut krymplinan över metallnålen på en 10 mikroliter avfasad spruta.
Använd en öppen låga för att värma och följ krymplinan till nålen, samtidigt som du ser till att rotera nålen för att applicera värme jämnt. Skjut den större änden av den dragna glasnålen försiktigt över sprutans metallnål. Efter detta, skär en längd av krymp wrap slangar till cirka 40 mm och försiktigt skjut den över glaset nålen att överlappa basen av glas nålen och metall nålen av sprutan.
Använd en öppen låga för att värma krymplinan för att säkra glasnålen till metallnålen. För att ytterligare säkra nålen och förhindra potentiella läckor, skär en ytterligare längd av krympplaströr till cirka 40 mm, och skjut den försiktigt över glasnålen för att överlappa basen av glasnålen och sprutans metallnål. Använd en öppen låga för att värma krymplinan för att säkra glasnålen till metallnålen.
Använd sedan sax för att trimma glasnålen så att spetsen är cirka 8 mm lång. För att testa nålen, fyll en 1 mL spruta med en bifogad 26 gauge nål med destillerat vatten. Ta bort metallkolven från den anpassade glasnålsprutan och stick in nålen på den vattenfyllda sprutan i den anpassade sprutans bas.
Inspektera glasnålens och metallnålens gränssnitt för läckor och för att bekräfta ett stadigt vattenflöde. Fyll sedan ett mikrocentrifugrör med destillerat vatten. Använd den anpassade glasnålssprutan för att dra in det destillerade vattnet.
Inspektera nålen för att bekräfta att vätska tas in i sprutan och att det inte finns några bubblor. Om det finns bubblor, eller om vattnet inte dras upp i nålen, kan trimning av nålen bidra till att lindra trycket. Efter detta förvara försiktigt sprutan med de bifogade glasnålarna, i sprutlådorna tills det behövs för operationer.
Undersökning med transmissionselektronmikroskopi bekräftar förekomsten av långa fibriller. I jämförelse, alfa-synuklein monomerer är korn synliga och har ingen urskiljbar form. Analoid bekräftelse av fibrillerna bekräftas sedan med hjälp av en Thioflavin T Assay.
En representativ analys visar dPBS och mus monomerer producera en lägre signal i relativa flouresent enheter jämfört med mus PFFs. Mänskliga alfa-synuclein monomer producerar en liknande signal som mus monomer. Fördriva människan PFFs jämväl jordbruksprodukter som en högre signalerar än monomers.
För att åsna närvaron av pelitible fibriller utförs en sedimentationsanalys. I både mus och mänskliga PFF prover, den supernate överträdelsen bör ha mer protein i pelleten än supernatanten. Däremot är majoriteten av proteinet från mus och mänskliga monomerer närvarande i supernatanten med lite närvarande i pelleten.
Både mus och mänskliga PFFs är sonicated att producera PFFs av lämpliga längder för seedning alfa synuclein inneslutningar. En omfattande undersökning av cirka 500 fibriller visar att den genomsnittliga längden på musfibriller är cirka 44 nanometer. Med 86,6 %av PFF:s som mäter 60 nanometer eller mindre.
Mänskliga PFFs har dock en genomsnittlig längd på cirka 55,9 nanometer med 69,6% av PFFs mäter 60 nanometer eller mindre. In vivo-undersökning av PFF-effekt bekräftas med hjälp av immunohistokemi. Inneslutningar som bildas i substantia nigra, dela liknande egenskaper som Lewy organ i att de innehåller fosforylerat alfa synuklein, innehåller aminloyed strukturer, och fläck med thioflavin S, och är resistenta mot Proteinase K matsmältning.
Ultraljudsbehandling kan utsätta de enskilda sonicating till aerosolized förformade fibriller. Som sådan bör korrekt säkerhets klädsel bäras och ultraljudsbehandling utförs i en huva för att minimera risken för exponering.
