Name: generation of alpha-synuclein preformed fibrils from monomers and use in vivo
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo at JoVE.com

Denna forskning stöddes av bidrag från Michael J. Fox Foundation, National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (NS099416) och Weston Brain Institute.

<ol>
	<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice.">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity.">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).</li><li>Paumier, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastriatal+injection+of+pre-formed+mouse+alpha-synuclein+fibrils+into+rats+triggers+alpha-synuclein+pathology+and+bilateral+nigrostriatal+degeneration.">Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration.</a> Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).</li><li>Abdelmotilib, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Synuclein+fibril-induced+inclusion+spread+in+rats+and+mice+correlates+with+dopaminergic+Neurodegeneration.">alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration.</a> Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).</li><li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration.">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129 (2018).</li><li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+Over+Quantity:+Advantages+of+Using+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibril+Triggered+Synucleinopathy+to+Model+Idiopathic+Parkinson's+Disease.">Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 621 (2018).</li><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells.">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li><li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death.">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li><li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates.">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li><li>Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+protein+p62+is+present+in+neuronal+and+glial+inclusions+in+human+tauopathies+and+synucleinopathies.">Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies.</a> Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies.">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li><li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson's+disease.">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li><li>Shimozawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+pathological+alpha-synuclein+in+marmoset+brain.">Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 12 (2017).</li><li>Polinski, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+Practices+for+Generating+and+Using+Alpha-Synuclein+Pre-Formed+Fibrils+to+Model+Parkinson's+Disease+in+Rodents.">Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents.</a> Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).</li><li>Fares, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+de+novo+alpha-synuclein+fibrillization+in+a+neuronal+model+for+Parkinson's+disease.">Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).</li><li>Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+efficacy+of+different+procedures+that+remove+and+disassemble+alpha-synuclein,+tau+and+A-beta+fibrils+from+laboratory+material+and+surfaces.">Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces.</a> Scientific Reports. 8, 10788 (2018).</li><li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents.">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2008).</li><li>Tarutani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Fragmented+Pathogenic+alpha-Synuclein+Seeds+on+Prion-like+Propagation.">The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).</li><li>Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+innervation+of+direct-+and+indirect-pathway+striatal+projection+neurons.">Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons.</a> Neuron. 79, 347-360 (2013).</li></ol>

Joseph Patterson, Kelvin Luk, och Caryl Sortwell är för närvarande inblandade i avtals arrangemang med Michael J. Fox stiftelsen för kvalitets kontroll α-syn material som genereras av Proteos, Inc. Coauthor Nicole Polinski, är anställd av Michael J. Fox Stiftelsen, som har kontrakterat Proteos, Inc. för att producera α-syn monomer. Medförfattare Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley, och Nicholas Kanaan har inget att avslöja.

Produktion av α-syn PFFs kan sådd neuroner och leder till Lewy Body-liknande inne slutningar är beroende av flera faktorer och steg. En kritisk faktor är att monomerer som används för att generera fibriller måste vara specifikt formulerade för fibrilization4,9,14,15. Om monomererna inte är formulerade för fibrilization, fibriller kan inte bildas eller fibriller som gör form får inte producera α-syn patologi. Likaså, den buffert som monomererna är i också påverka fibrilization. Som sådan, för bästa resultat, salt koncentrationen bör vara cirka 100 mM NaCl och pH mellan 7,0 och 7,3. Ett första steg som introducerar variation är den metod där initial protein halt bestäms, med mätning på A280 sannolikt att producera mer exakta resultat och därför är den föredragna metoden. Skillnaden i protein koncentration kan minska effekten av fibrilization processen, samt ändra den antagna PFF koncentrationen används i experiment. Båda kan leda till en minskning av sådd effektivitet och batchvariation mellan experiment.
Inledande kvalitets kontroll steg kommer att bekräfta kritiska egenskaper hos PFFs, särskilt att de har en fibrillär kon formation (elektronmikroskopi), innehåller amyloid strukturer (tioflavin T-analys), och är pelletable (sedimentation analys). Det är viktigt att notera att resultaten av thioflavin T-analysen kommer att fluktuera med tiden och är inte ett direkt mått på mängden av amyloid strukturer närvarande, snarare, thioflavin T-analysen bör endast användas som en indikator på amyloid strukturer närvaro inom provet. Thioflavin T används vanligt vis i in vitro-analyser, såsom den ovan nämnda analysen för att Visa fibriller innehåller amyloid strukturer. Alternativt, tioflavin S används i vävnad för att upptäcka amyloid strukturer, som visas i figur 7. När det gäller sedimenteringstest, visar resultaten endast att PFFs finns huvudsakligen i pelletable fraktion. Eftersom proverna körs i denaturering villkor, en enda framstående band av cirka 14 kDa, storleken på α-syn monomerer, finns på gelerna. Detta är till skillnad från de flera band som finns på högre molekyl vikter som skulle förväntas med PFFs om en infödd eller icke-denaturering gel användes. Slutligen garanterar lyckad överföring av alla dessa inledande kvalitets kontroll steg inte α-syn inkludering aktivitet. Av denna anledning, cell kultur experiment eller en liten kohort av kirurgiskt injicerade djur bör användas för att testa effekten av PFFs före användning i större experiment.
Ultraljudsbehandling är ett avgörande steg i processen och parametrarna kommer att variera beroende på modell av någon sonikator används. Ultraljudsbehandling parametrar måste tillämpas och verifieras för att visa att korta PFF fragment har producerats. Fibril storlek har betydelse för seedning, med kortare fibriller seedning mer effektivt. Även kortare fibriller utsäde mer effektivt, denna effekt platåer och den optimala PFF längd är cirka 50 nm4,18. Det är också viktigt att inte över-Sonikera proverna och exponera PFFs till överdriven värme, eftersom detta kan minska seedning effektivitet. Dessa sonicated PFFs bör testas för effekt i liten cell kultur eller in vivo experiment före användning i större skala experiment. Som olika ultraljudsbehandling sessioner har potential att införa variation, experimentella behandlings grupper bör planeras i enlighet med detta.
Vid leverans av PFFS in vivo, lokalisering av injektions stället (s) och den totala mängden PFFS används kan påverka antalet nerv celler som kommer att utveckla inne slutningar samt omfattningen av neurodegeneration7,14. Koordinaterna i protokollet ger en plats att starta, men bör testas i labbet för att säkerställa att önskad mål region utvecklar α-syn patologi före användning i storskaliga experiment. Om så önskas kan spårnings färg eller fluorescerande pärlor användas som ett sätt att testa regional inriktning innan du använder PFFs. Mängden PFFS som används i vivo varierar mellan grupperna, där de flesta grupper använder en total summa mellan 5 och 20 μg PFFS på en eller uppdelad mellan två injektions ställen1,2,3,4,5 , 6 att ha , 7 för att , 14. eftersom antalet injektions ställen, placeringen av injektions ställena och mängden PFFS som injicerats kan leda till resultat och progression av synucleinopati, bör resultaten av de parametrar som används i efterföljande led karakteriseras före användning av modellen för att testa potentiella interventioner eller undersöka tidsmässiga särdrag i modellen.
När man väljer en modell som ska användas för att testa terapier eller studera sjukdomsprogression, bör den modell som används väljas för att bäst besvara frågan. Inte alla modeller kommer att ha vissa sjukdoms egenskaper hos PD, eller erbjuda den tidsram som behövs för att testa potentiella interventioner. Den PFF modell recapitulates nyckel dragen av PD, sådan som α-syn patologi och neurodegeneration, och kanna leda till blygsam motor försämringar. Modellen erbjuder en förutsägbar och utdragen tid-kurs, där inne slutningar form månader före neurodegeneration. Detta gör det möjligt för forskare att undersöka och utnyttja de olika faserna under den långvariga utvecklingen av synucleinopati. Den nuvarande och framtida användningen av modellen övergripande förväntas vara fördelaktigt i studiet av sjukdomsprogression och utveckling av nya terapier.

Parkinsons sjukdom (PD) kännetecknas främst efter döden av två stora patologiska egenskaper: utbredd och progressiv alfa-Synuclein (α-syn) patologi, och nigrostriatala degeneration. Efter injektion i wildtyp möss eller råttor, α-syn förformade fibriller (PFFs) inducera progressiv ansamling av patologiskt α-syn, vilket kan resultera i utdragen degeneration av substantia nigra pars compacta (SNpc) dopamin nerv celler under loppet av många samt sensorimotoriska underskott1,2,3,4,5,6. Neuroner utsätts för α-syn fibriller, antingen via direkt Intracerebral injektion eller läggas till media av odlade nerv celler. När PFFS tas in i nerv celler, den PFFS agera för att "frö" bildandet av inne slutningar genom Templating, och ackumulering av endogena α-syn till fosforylerade inne slutningar1,7,8, och 9. Inne slutningar har liknande egenskaper som Lewy organ: innehåll ande α-syn fosforylerat vid serin 129 (pSyn), ubiquitin och P62; inneha aamyloida Kvartära strukturer som visas med positiv färgning av tioflavin; och är resistenta mot proteinas K mat smältning1,3,5,7,8,9,10,11, med 12. PFF exponering leder till α-syn inkludering bildandet i primär och några förevigas nerv celler i kulturen, samt möss, råttor och icke-mänskliga primater in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Det är viktigt att notera att PFFs inte kommer att leda till α-syn inkludering formation i alla cell kulturer modeller och vissa odlade nerv celler kommer utsäde bättre än andra.
En annan viktig egenskap hos in vivo α-syn PFF-modellen är de distinkta sekventiella patologiska faser som uppstår under flera månader. I gnagare, efter intrastriatal injektion, α-syn inklusion bildas generellt inom SNpc och många kortikala regioner inom 1-2 månader. Denna agg regering topp följs av nigrostriatala degeneration ≈ 2-4 månader senare1,3,5. Dessa distinkta patologiska stadier ger forskarna den plattform som man kan studera och utveckla strategier som 1) minska α-syn aggregation, 2) klart redan bildade α-syn inne slutningar, och/eller 3) förhindra efterföljande neurodegeneration. Den PFF modellen erbjuder distinkta fördelar och nack delar jämfört med neurotoxicant, transgena, och viral vektor medierad α-syn överuttryck modeller som tidigare granskat6. Valet av vilken modell eller metod att ta bör bestämmas av vilken modell som bäst passar den fråga som utredarna efterfrågar.
Även om PFF-modellen har framgångs rikt använts av många laboratorier, det finns fortfarande grupper som har upplevt inkonsekvenser med att generera fibriller och producerar konsekvent α-syn patologi14. Exempel på inkonsekvenser varierar från PFFs som producerar liten eller ingen α-syn patologi, batch till batch seedning effektivitet, och även fel i fibriller att bilda. Därför är standardiseringen av α-syn PFF-generationen och in vivo-applicering kritisk för att möjliggöra korrekta tolkningar av effekten av nya terapeutiska ingrepp. Följande protokoll beskriver de steg som krävs för generering av PFFs från α-syn monomerer, in vitro kvalitets kontroll av PFFs en gång bildades, ultraljudsbehandling och mätning av PFFs före användning, och förslag för att under lätta framgångs rik in vivo injektion av PFFs till råttor eller möss.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >1x Dulbecco's phosphate buffered saline</td>
			<td >Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >AB184674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-alpha-synuclein antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >AB15530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bicinchonic acid</td>
			<td >Thermo Fisher (Pierce)</td>
			<td >PI23228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Medical Shrink Tubing (0.036" inner diameter)</td>
			<td >Nordson Medical</td>
			<td >103-0143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Medical Shrink Tubing (0.044" inner diameter)</td>
			<td >Nordson Medical</td>
			<td >103-0296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Copper sulfate</td>
			<td >Thermo Fisher (Pierce)</td>
			<td >PI23224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >2231000574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Eppendorf ThermoTop heated lid</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5308000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formvar/Carbon coated electron microscopy grids</td>
			<td >Eletron Microscopy Sciences</td>
			<td >FCF300-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length)</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >22-326223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass needle puller</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hamilton syringe</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td >80000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils</td>
			<td >Proteos</td>
			<td >RP-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils</td>
			<td >Proteos</td>
			<td >RP-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orange Medical Shrink Tubing (0.021" inner diameter)</td>
			<td >Nordson Medical</td>
			<td >103-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm M</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P7543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >25530015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Qsonica 3.2 mm tip</td>
			<td >Qsonica</td>
			<td >4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Qsonica Q125 sonicator</td>
			<td >Qsonica</td>
			<td >Q125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thioflavin S</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >T1892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Thioflavin T</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >596200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit</td>
			<td >Genscript</td>
			<td >L00350C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uranyl acetate</td>
			<td >Eletron Microscopy Sciences</td>
			<td >22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of alpha-synuclein preformed fibrils from monomers and use in vivo

Användning av in vivo alfa-Synuclein förformade fibrillcellulosa (α-syn PFF) modell av synucleinopati ökar i popularitet bland forskare som syftar till att modellera Parkinsons sjukdom synucleinopati och nigrostriatala degeneration. Standardiseringen av α-syn PFF-generering och in vivo-applicering är kritisk för att säkerställa en konsekvent, robust α-syn-patologi. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för generering av fibriller från monomer α-syn, post-fibrilization kvalitets kontroll steg, och föreslog parametrar för framgångs rik Neurokirurgisk injektion av α-syn PFFs till råttor eller möss. Från och med monomer α-syn sker fibrillering under en 7-dagars inkubations tid under skakningen vid optimala buffertförhållanden, koncentration och temperatur. Efter fibrilization kvalitets kontroll bedöms av närvaron av pelletable fibriller via sedimentering assay, bildandet av amyloid kon formation i fibriller med en tioflavin T-analys, och elektron mikroskopisk visualisering av fibriller. En lyckad validering med hjälp av dessa analyser är nödvändig för att lyckas, de är inte tillräckliga för att garantera att PFFs kommer att frön α-syn inne slutningar i nerv celler, eftersom sådan agg regering aktivitet av varje PFF parti bör testas i cell kultur eller i pilot djur kohorter. Före användning måste PFFs vara sonicated under exakt standardiserade förhållanden, följt av undersökning med elektronmikroskopi eller dynamisk ljus spridning för att bekräfta fibrillcellulosa längder är inom optimal storleks intervall, med en genomsnittlig längd på 50 nm. PFFs kan sedan tillsättas till cell odlings medier eller användas i djur. Patologi detekterbar genom immuninfärgning för fosforylerat α-syn (psyn; serin 129) är uppenbara dagar eller veckor senare i cell kulturer respektive gnagare.

Generering av fibriller från α-syn monomerer börjar med bestämning av koncentrationen av monomerer. Både BCA-analysen och mätningen av absorbansen vid 280 nm (A280) kan användas för att mäta proteinhalten. BCA-analysresultaten föreslog dock en högre koncentration än A280-metoden. PFFs som härrör från mus α-syn monomer hade ett BCA-värde på 14,05 ± 0,22 och en A280 på 8,05 ± 0,03 μg/μL (figur 1). Likaså verkade PFFs som härrör från humana α-syn monomer också ha en högre koncentration, med ett BCA-värde på 12,95 ± 0,38 och en A280 på 7,83 ± 0,05 μg/μL (figur 1). A280-mätningarna är specifika för α-syn baserat på inkluderingen av utdöningskoefficienterna och dessa resultat användes för att späda ut monomererna före 7-dagars inkubation.
Före inkubation var vätskan som innehåller α-syn monomererna klar, men den bör verka grumlig efter fibrilbildningen. Undersökning med transmission elektronmikroskopi bekräftade närvaron av långa fibriller, mätning 10-20 nm bred (figur 4). I jämförelse var α-syn monomerer knappt synlig utan märkbar form (figur 4). Med visuell bekräftelse av fibrillar strukturer, amyloid kon formation av fibriller är nästa inslag i PFFs som bör bekräftas med hjälp av en thioflavin T-analys. Thioflavin T uppvisar förbättrad fluorescens vid bindning till amyloid; Därför indikerar ökad fluorescerande signal från proverna förekomst av amyloid. Som ett exempel, gav tioflavin i dPBS en signal på 3 287 ± 580 relativa fluorescerande enheter (RFU), mus α-syn monomer producerade en signal på 4 174 ± 158 RFU, och mus PFFs producerade en signal på 59 754 ± 6 224 RFU (figur 5). I jämförelse, humana α-syn monomer producerade en liknande signal på 4 158 ± 105 RFU till mus monomer, och mänskliga PFFs producerade en högre signal på 1 235 967 ± 113 747 RFU jämfört med mus PFFs (figur 5). För att bedöma förekomsten av pelletable fibriller, en sedimentering assay utfördes. Fibriller kommer pellet med centrifugering. I både mus och humana PFF-prover bör supernatanten ha mer protein i pelleten än supernatanten (figur 6). Däremot var majoriteten av proteinet från mus och mänskliga monomerer närvarande i supernatanten, med liten present i pelleten (figur 6). Med PFFs synligt närvarande genom elektronmikroskopi, amyloid strukturer närvarande, och fibriller pelletable, passerade PFFs alla in vitro kvalitets kontroll steg.
Både mus och mänskliga PFFS var sonicated att producera PFFS av lämpliga längder för sådd α-syn inne slutningar4,18. PFFs späddes till önskad koncentration av 4 μg/μL och sonicated. Omedelbart före operationen, 25 representativa fibriller var avbildad av elektronmikroskopi och mätt för att upptäcka kontrol lera fibrillcellulosa storlek. Sonicated mus PFFs mätt 48,8 ± 3,1 Nm, medan de mänskliga PFFs mätt 52,1 ± 4,4 Nm i längd; PFFs av båda arterna var därför lämplig längd (50 nm eller mindre) för att inducera sådd aktivitet. Mer omfattande undersökning av cirka 500 fibriller avslöjade den genomsnittliga längden och längden fördelningen av sonicated mus fibriller. Den genomsnittliga längden var 44,4 ± 0,6 Nm, med 86,6% av PFFs som mäter 60 nm eller mindre (figur 4). I jämförelse var de humana PFFs i genomsnitt 55,9 ± 1,1 Nm med 69,6% av PFFs som mäter 60 nm eller mindre (figur 4).
Efter intrastriatal injektion av sonicated mus PFFS till råttor som tidigare beskrivits3,5, en serie av vävnad sektioner behandlades vid 2 månader efter operationen, när antalet inklusion som innehåller nerv celler är känd för att topp i SNpc, för bekräftelse av fosforylerade α-syn inne slutningar5. Inklusion bärande neuroner, som indikeras av immunhistokemisk färgning för pSyn (anti kropp i tabell över material) finns inom SNPC (figur 7), liksom andra regioner i hela hjärnan som innerverar striatum (främre lukt Nucleus, motor, cingulate, Piriform, prelimbic, somatosensorisk, entorhinal, och Insular cortices, amygdala, striatum)1,3,4,5,19. Dessa inkluderingar har likartade egenskaper hos Lewy organ, såsom bindande tioflavin S, och resistens av total α-syn till proteinas K (figur 7), som visas av immunohistokemisk färgning (anti kropp och proteinas K i tabell över material) . Bekräftelse av seedning i hjärnan visar in vivo kvalitets kontroll har passerat, och Ali kvoter av PFFs tidigare fryst och sparas från samma parti kan vara sonicated under identiska parametrar, med längder validerade, i större experiment.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> Figur 1 . Metoder för generering av α-syn fibriller. Översikt över de steg som krävs för att framställa fibriller från α-syn monomerer. Monomerer centrifugeras i 10 min (15 000 x gvid 4 ° c). Supernatanten överförs till ett rent rör och protein koncentrationen bestäms antingen av absorbansen vid 280 nm eller en BCA-analys. Grafen visar koncentrationer av α-syn monomerer från människa och mus. Kolumnerna anger grupp medel, felstaplar representerar ± 1 standard fel av medelvärdet. Efter att protein koncentrationen är fastställd, späds α-syn monomerer, kort viras och inkuberas för 37 ° c i 7 dagar, medan skakningar på en orbital mixer inställd på 1 000 RPM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> Figur 2 . Infärgnings metoder för transmissionens elektronmikroskopi. Diagram över negativ färgning för elektronmikroskopi. A) bilder som föreställer elektronmikroskopi preparat rutnät. Rutnätet har en tråkig eller ljus sida och en glänsande eller mörk sida. Den blanka/mörka sidan är belagd med en formvar/Carbon stöd film. B) illustration av Färgnings proceduren. Rutnätet är flöt glänsande/mörk sida ner på den första droppen av ddH2O för 1 min och överskottet är ogudaktiga bort med filter papper. Processen upprepas med den andra droppen av ddH2o, utspädda PFFS eller monomerer, två droppar uranyl acetat, och två ytterligare droppar DDH2o. gridteknik kan lagras i en rutnätslåda tills avbildas. Scale bar = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> Figur 3 . Montering av anpassade sprutor av glas nål. Diagram över de steg som krävs för att montera glasnålsmonterade sprutor. Silikoniserat glas kapillärrör dras och skärs i mitten för att producera glasnålar. Shrink wrap slang används för att förbereda metallnålen och bildar en inre tätning när glaset nålen skjuts på metallnålen. Två ytterligare lager av krympslang som överlappar basen av glasnålen och metallnålen är i följd tillsätts och värme appliceras för att säkra glasnålen och bildar en vatten tät tätning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> Figur 4 . Visualisering av α-syn monomerer och α-syn fibriller via transmissionselektronmikroskopi. Representativa mikrografer över α-syn monomerer och fibriller. Topp paneler: mus och människa α-syn monomer. Mellersta paneler: full längd mus och mänskliga α-syn PFFs. botten paneler: mus och mänskliga α-syn PFFs efter ultraljudsbehandling. Nedre grafen: distribution av sonicated mus och mänskliga α-syn PFF längder. Skalbar = 500 Nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> Figur 5 . Bekräftelse av amyloid strukturer av tioflavin T-analys. Mätning av fluorescerande signal från mus och humana α-syn monomer och PFF-prover. Vänster: resultat från mus α-syn monomerer och α-syn PFFs. Höger: resultat från humana α-syn monomerer och α-syn PFFs. En dPBS negativ kontroll visas i varje graf. Alla mätningar uttrycks som relativa fluorescerande enheter (RFU). Kolumnerna anger grupp medel, felstaplar representerar ± 1 standard fel av medelvärdet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> Figur 6 . Sedimenteringstest för pelletable α-syn. bilder från Coomassie färgade geler. Band som visas är på cirka 14 kDa baserat på protein stege. Vänster: mus monomer och PFFs. Höger: mänskliga monomerer och PFFs. För alla monomer-och PFF-prover visas den återsuspenderade pelleten (P) och supernatanten (S). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> Figur 7 . Dragen av inne slutningar i råtta modell som bekräftar α-syn patologi. Representativa elektronmikrografier från substantia nigra pars compacta på 2 månader efter injektionen. Vänster: neuroner som innehåller psyn och motfärgas med tolyloxi violett. Mitten: Thioflavin S positiva nerv celler. Höger: α-syn-innehållande inne slutningar resistenta mot proteinas K. skalbar = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo at JoVE.com

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Generering av alfa-Synuclein förformade fibriller från monomerer och användning in vivo

Målet med denna artikel är att beskriva de steg som krävs för generering av fibriller från monomer alfa-Synuclein, efterföljande kvalitets kontroll, och användning av de förformade fibriller in vivo.

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Alpha-Synuclein Preformed Fibril modellen används av laboratorier över hela världen för att studera synucleinopathies. Även om modellen har använts framgångsrikt av många labs, vissa grupper har upplevt inkonsekvenser genererar fibriller och producerar konsekvent alfa-synuclein patologi. Vi hoppas att detta protokoll, som beskriver generering av fibriller från alfa-synukleinmonomerer och användningen av färdigformade fibriller in vivo, kan svara på frågor som forskare har om användningen av modellen.Alpha-Synuclein Preformed Fibril modellen rekapitulerar viktiga funktioner i Parkinsons sjukdom, såsom alfa-synuklein patologi och neurodegeneration. Och det har visat sig leda till blygsamma motoriska funktionsnedsättningar i vissa djurmodeller. Bildandet av inneslutningar som innehåller fosforylerat alfa-synuklein och utdragen tidsförlopp mot neurodegeneration erbjuder forskare olika stadier under hela utvecklingen av synucleinopatin, att studera och rikta för potentiella terapeutiska interventioner.Demonstrerar utarbetandet av anpassade glas nålar, är vår lab tekniker, Christopher Kemp. För att börja detta förfarande, tina alfa-synuklein monomerer på is. Re-suspened de tinade monomers genom att försiktigt snärta på röret.Och centrifug vid 15, 000 g och fyra grader Celsius i 10 minuter. Sedan överför du supernatanten till ett rent 1,5 mL mikrocentrifugrör och registrerar den överförda mängden. Späd monomererna med 1x dPBS till en slutkoncentration på 5 mg per mL.Kort virvel att blanda, och kort centrifug att samla in all vätska i botten av röret. Därefter använder självhäftande film för att säkra locket mikro centrifugrör stängd. Placera röret i en orbital termo mixer med lock i sju dagar på 37 grader Celsius medan skakar på 1, 000 rpm.Vid slutet av sju dagar, bör innehållet i röret visas grumligt. Först, don alla nödvändiga personlig skyddsutrustning inklusive handskar, en labbrock, och ett ansikte sköld. Sedan, i en cellkultur huva, bifoga en 3,2 mm diameter sond till omvandlaren.Ställ in sonicators amplituden till 30%och puls till en sekund på och en sekund av och tiden till en minut. Tina fibrillerna i rumstemperatur, och medan du fortfarande är i kulturhuven, späd fibrillerna med steril dPBS. Därefter dämpa en labbvävnad med 70%etanol och använd detta för att torka av sonden av sonicator för att rengöra den.Dränk sondens spets i dubbelt destillerat vatten och puls 10 gånger för att rengöra sonden ytterligare. Efter detta torkar du sonden torr med en labbvävnad. Placera den rengjorda sondspetsen i tuben med utspädda fibriller och placera spetsen längst ned på röret.Sonikera de utspädda fibrillerna med hjälp av de tidigare inställda parametrarna medan du flyttar sonden uppåt och nedåt under varje puls för att säkerställa att alla fibrillerna i vätskan är sonicated. Efter ultraljudsbehandling, kort centrifug för en sekund på 2, 000 g att samla all vätska från sidorna av röret. Dränk sondspetsen i 1%SDS och puls 10 gånger för att rengöra sonden.Ta sedan bort spetsen från SDS, och dränka den i dubbeldestillerat vatten, och puls 10 gånger. Torka av sonden med en labvävnad dämpad med 70%etanol och torka den torr med en torr labbvävnad. Lossa sonden från omvandlaren och förvara.Efter detta torkar du av alla ytor i huven med 1%SDS följt av 70%etanol. Till att börja placera en silikoniserad glas kapillärrör i ett glas nål puller. Sätt på värmeelementet, och låt de bifogade vikterna sträcka det uppvärmda glas kapillärröret.Därefter använder sax för att skära det dragna glas kapillärröret på den tunnaste punkten i mitten och ta bort glasnålen från glasnålsdragaren. Använd sedan sax för att skära en längd av krympplaströr till cirka 40 mm. Skjut krymplinan över metallnålen på en 10 mikroliter avfasad spruta.Använd en öppen låga för att värma och följ krymplinan till nålen, samtidigt som du ser till att rotera nålen för att applicera värme jämnt. Skjut den större änden av den dragna glasnålen försiktigt över sprutans metallnål. Efter detta, skär en längd av krymp wrap slangar till cirka 40 mm och försiktigt skjut den över glaset nålen att överlappa basen av glas nålen och metall nålen av sprutan.Använd en öppen låga för att värma krymplinan för att säkra glasnålen till metallnålen. För att ytterligare säkra nålen och förhindra potentiella läckor, skär en ytterligare längd av krympplaströr till cirka 40 mm, och skjut den försiktigt över glasnålen för att överlappa basen av glasnålen och sprutans metallnål. Använd en öppen låga för att värma krymplinan för att säkra glasnålen till metallnålen.Använd sedan sax för att trimma glasnålen så att spetsen är cirka 8 mm lång. För att testa nålen, fyll en 1 mL spruta med en bifogad 26 gauge nål med destillerat vatten. Ta bort metallkolven från den anpassade glasnålsprutan och stick in nålen på den vattenfyllda sprutan i den anpassade sprutans bas.Inspektera glasnålens och metallnålens gränssnitt för läckor och för att bekräfta ett stadigt vattenflöde. Fyll sedan ett mikrocentrifugrör med destillerat vatten. Använd den anpassade glasnålssprutan för att dra in det destillerade vattnet.Inspektera nålen för att bekräfta att vätska tas in i sprutan och att det inte finns några bubblor. Om det finns bubblor, eller om vattnet inte dras upp i nålen, kan trimning av nålen bidra till att lindra trycket. Efter detta förvara försiktigt sprutan med de bifogade glasnålarna, i sprutlådorna tills det behövs för operationer.Undersökning med transmissionselektronmikroskopi bekräftar förekomsten av långa fibriller. I jämförelse, alfa-synuklein monomerer är korn synliga och har ingen urskiljbar form. Analoid bekräftelse av fibrillerna bekräftas sedan med hjälp av en Thioflavin T Assay.En representativ analys visar dPBS och mus monomerer producera en lägre signal i relativa flouresent enheter jämfört med mus PFFs. Mänskliga alfa-synuclein monomer producerar en liknande signal som mus monomer. Fördriva människan PFFs jämväl jordbruksprodukter som en högre signalerar än monomers.För att åsna närvaron av pelitible fibriller utförs en sedimentationsanalys. I både mus och mänskliga PFF prover, den supernate överträdelsen bör ha mer protein i pelleten än supernatanten. Däremot är majoriteten av proteinet från mus och mänskliga monomerer närvarande i supernatanten med lite närvarande i pelleten.Både mus och mänskliga PFFs är sonicated att producera PFFs av lämpliga längder för seedning alfa synuclein inneslutningar. En omfattande undersökning av cirka 500 fibriller visar att den genomsnittliga längden på musfibriller är cirka 44 nanometer. Med 86,6 %av PFF:s som mäter 60 nanometer eller mindre.Mänskliga PFFs har dock en genomsnittlig längd på cirka 55,9 nanometer med 69,6% av PFFs mäter 60 nanometer eller mindre. In vivo-undersökning av PFF-effekt bekräftas med hjälp av immunohistokemi. Inneslutningar som bildas i substantia nigra, dela liknande egenskaper som Lewy organ i att de innehåller fosforylerat alfa synuklein, innehåller aminloyed strukturer, och fläck med thioflavin S, och är resistenta mot Proteinase K matsmältning.Ultraljudsbehandling kan utsätta de enskilda sonicating till aerosolized förformade fibriller. Som sådan bör korrekt säkerhets klädsel bäras och ultraljudsbehandling utförs i en huva för att minimera risken för exponering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Oral administrering av Rotenon med en sondmatning och bildanalys av alfa-synuklein införanden i det enteriska nervsystemet

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy i C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Bakåtsträvande Fluorescerande märkning Tillåter Riktade Extracellular Single-enhet Inspelning från identifierade nervceller<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generering av Lokalt Transgena råttor genom<em&gt; I livmodern</em&gt; Elektroporering och<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Beredningar av den Intakt vomeronasala orgel och tillbehör luktbulben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Sekventiell Utvinning av lösliga och olösliga alfa-synuklein från Parkinson Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescence avbildning av Neuroinflammation i transgena möss efter perifer ympning av alfa-synuklein fibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Exogena administrering av mikrosomer-associerade alfa-synuklein aggregat till primära nervceller som en kraftfull Cell modell av fibriller bildas

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...