Alfa-Sinüklein Preformed Fibril modeli sinükleininopatiler çalışma dünya çapında laboratuvarlar tarafından kullanılmaktadır. Model birçok laboratuvar tarafından başarıyla kullanılmasına rağmen, bazı gruplar fibriller üreten ve tutarlı alfa-sinüklein patolojisi üreten tutarsızlıklar yaşamışlardır. Alfa-sinüklein monomerlerinden fibrül lerin oluşumunu ve önceden oluşturulmuş fibrillerin vivo kullanımını ayrıntılarıyla detaya alan bu protokolün, araştırmacıların modelin kullanımı yla ilgili sorularını yanıtlayabileceğini umuyoruz.
Alfa-Sinüklein Preblü Fibril modeli, Parkinson hastalığının alfa-sinüklein patolojisi ve nörodejenerasyon gibi temel özelliklerini özetler. Ve bazı hayvan modellerinde mütevazı motor bozukluklarına yol gösterdiği gösterilmiştir. Fosforilasyonalfa-sinüklein içeren dahil lerin oluşumu ve nörodejenerasyona doğru uzun süren zaman seyri araştırmacılara sinükleinopatinin ilerlemesi boyunca farklı aşamalar sunar, potansiyel terapötik müdahaleleri incelemek ve hedeflemek için.
Özel cam iğnelerin hazırlanmasını gösteren laboratuvar teknisyenimiz Christopher Kemp. Bu prosedüre başlamak için, buz üzerinde alfa-sinüklein monomerleri eritin. Yeniden boru üzerinde hafifçe flicking tarafından çözülmüş monomerler suspened.
Ve 15, 000 g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj. Daha sonra, supernatant temiz bir 1,5 mL mikro santrifüj tüp aktarın ve aktarılan miktarı kaydedin. ML başına 5 mg son konsantrasyona 1x dPBS ile monomerleri seyreltin.
Kısaca girdap karıştırmak ve kısaca tüpün altındaki sıvı nın tüm toplamak için santrifüj. Daha sonra, mikro santrifüj tüp kapağıkapalı güvenli yapıştırıcı film kullanın. 1, 000 rpm sallayarak sırasında 37 santigrat derece yedi gün boyunca bir kapak ile bir orbital termo mikser içine tüp yerleştirin.
Yedi günün sonunda, tüpün içeriği bulanık görünmelidir. İlk olarak, eldiven, laboratuvar önlüğü ve yüz kalkanı da dahil olmak üzere gerekli tüm kişisel koruyucu ekipmanı donatın. Daha sonra, bir hücre kültür başlık, dönüştürücü bir 3,2 mm çapında prob takın.
Sonicators genlik ayarlayın 30%ve nabız bir saniye ve bir saniye kapalı ve bir dakika için zaman. Oda sıcaklığında fibriller çözülme, ve hala kültür başlık iken, steril dPBS ile fibriller seyreltin. Sonra, %70 etanol ile bir laboratuvar dokusunemiş ve bunu sondayı silmek için kullan.
Sondanın ucunu çift distilesu suya batırın ve sondayı daha fazla temizlemek için 10 kez darbeye batırın. Bundan sonra, sondayı bir laboratuvar dokusuyla kurutun. Temizlenmiş sonda ucunu seyreltilmiş fibriller tüpüne yerleştirin ve ucu tüpün altına yerleştirin.
Sıvıdaki tüm fibrillerin sonicated olduğundan emin olmak için her darbe sırasında prob yukarı ve aşağı hareket ederken önceden ayarlanmış parametreleri kullanarak seyreltilmiş fibrils sonicate. Sonication sonra, kısaca 2 bir saniye için santrifüj, 000 g tüpün yanlarından tüm sıvı toplamak için. Sondayı temizlemek için sonda ucunu %1 SDS ve darbeye 10 kez batırın.
Daha sonra, SDS ucu çıkarın ve çift distile su batırın ve darbe 10 kez. Sondayı %70 etanolle nemlendirilmiş bir laboratuvar dokusuyla silin ve kuru bir laboratuvar dokusuyla kurulayın. Prob'u dönüştürücüden ve depodan ayırın.
Bundan sonra, % 1 SDS ve % 70 etanol ile kaputtaki tüm yüzeyleri silin. Başlamak için, bir cam iğne çekmece içine silikoncam kılcal tüp yerleştirin. Isıtma elemanını açın ve bağlı ağırlıkların ısıtılmış cam kılcal tüpü uzatmasına izin verin.
Daha sonra, ortadaki en ince noktada çekilen cam kılcal tüp kesmek ve cam iğne yiğcam iğne çekmecesinden çıkarmak için makas kullanın. Daha sonra, yaklaşık 40 mm shrink şal boru uzunluğu kesmek için makas kullanın. 10 mikrolitre yontucu şırınga metal iğne üzerinde shrink şal kaydırın.
Isı ve iğne için shrink şal yapıştırmak için açık bir alev kullanın, eşit ısı uygulamak için iğne döndürmek için emin yaparken. Çekilen cam iğnenin büyük ucunu şırınganın metal iğnesinin üzerine dikkatlice kaydırın. Bundan sonra, yaklaşık 40 mm'ye kadar shrink wrap borubir uzunluk kesmek ve dikkatle cam iğne tabanı ve şırınga metal iğne örtüşmek için cam iğne üzerinde kaydırın.
Metal iğne için cam iğne güvenli shrink şal ısıtmak için açık bir alev kullanın. İğneyi daha fazla emniyete almak ve olası sızıntıları önlemek için, yaklaşık 40 mm'ye kadar ek bir shrink sargı borusu kesin ve cam iğnenin tabanıyla ve şırınganın metal iğnesiyle örtüşmek için dikkatlice cam iğnenin üzerine kaydırın. Metal iğne için cam iğne güvenli shrink şal ısıtmak için açık bir alev kullanın.
Daha sonra, ucu yaklaşık 8 mm uzunluğunda olacak şekilde cam iğne kırpmamak için makas kullanın. İğneyi test etmek için, 1 mL'lik bir şırıngayı 26 gauge iğneile damıtılmış suyla doldurun. Metal pistonu özel cam iğne şırıngasından çıkarın ve su dolu şırınganın iğnesini özel şırınganın tabanına yerleştirin.
Sızıntılar için cam iğne ve metal iğne nin arayüzünü inceleyin ve sürekli bir su akışını onaylayın. Sonra, distile su ile bir mikro santrifüj tüp doldurun. Distile su çekmek için özel cam iğne şırınga kullanın.
Şırınganın içine sıvı alındığını ve kabarcık olmadığını doğrulamak için iğneyi inceleyin. Kabarcıklar varsa, ya da su iğne içine çizilmiş değilse, iğne kırpma basıncı hafifletmeye yardımcı olabilir. Bundan sonra, dikkatlice bağlı cam iğneler ile şırınga saklayın, ameliyatlar için gerekli olana kadar şırınga kutularında.
Transmisyon elektron mikroskobu ile yapılan inceleme uzun fibrillerin varlığını doğrular. Buna karşılık, alfa-sinüklein monomerler arpa görünür ve fark edilebilir bir şekli vardır. Fibrillerin analoid onayı daha sonra Thioflavin T Tsay kullanılarak doğrulanır.
Temsili bir teşp dPBS ve fare monomerleri göreli flouresent birimlerinde fare PFFs göre daha düşük bir sinyal üretmek gösterir. İnsan alfa-sinüklein monomer fare monomer benzer bir sinyal üretir. İnsan PFF'leri aynı şekilde monomerlerden daha yüksek bir sinyal üretirken.
Pelitible fibrils varlığını asses için, bir sedimantasyon tsay yapılır. Hem fare hem de insan PFF örneklerinde, üst üste gelen ihlalin pelette süpernatanttan daha fazla proteine sahip olması gerekir. Buna karşılık, fare ve insan monomerler protein çoğunluğu pelet çok az mevcut ile supernatant mevcuttur.
Hem fare hem de insan PFF'leri, alfa sinüklein inklütileri için uygun uzunlukta PFF'ler üretmek için sonicated edilir. Yaklaşık 500 fibrl kapsamlı bir inceleme fare fibrils ortalama uzunluğu yaklaşık 44 nanometre olduğunu ortaya koymaktadır. PFF'lerin %86,6'sı 60 nanometre veya daha az ölçülerindedir.
İnsan PfFs, ancak, 60 nanometre veya daha az ölçme PFFs% 69,6 ile yaklaşık 55,9 nanometre ortalama uzunluğu var. PFF etkinliğinin in vivo muayenesi immünohistokimya kullanılarak doğrulanmıştır. Substantia nigra'da oluşan eklemeler, fosforirik alfa sinüklein içeren Lewy cisimlerine benzer özellikleri paylaşır, aminloyed yapılar içerir ve tioflavin S ile leke içerir ve Proteinaz K sindirimine dirençlidir.
Sonication aerosolize önceden bilgili fibriller için bireysel sonicating ortaya çıkarabilir. Bu nedenle, uygun güvenlik kıyafetleri giyilmeli ve maruz kalma riskini en aza indirmek için bir başlık içinde sonication gerçekleştirilir.
