Name: use of alu element containing minigenes to analyze circular rnas
Uploaded: 2020-03-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع وزارة الدفاع منحة AZ180075. ستيفان ستام يشكر جاكلين نونان الوقف. آنا Pawluchin كان مدعوما من قبل DAAD، الألمانية برنامج التبادل الأكاديمي، جوستين R. ويلدن كان حاصلا على جائزة جامعة كنتاكي ماكس ستيكلر.

1. تصميم الهياكل
<ol><li>استخدم متصفح الجينوم UCSC24 لتحديد العناصر المتكررة اللازمة لتشكيل الحمض النووي الريبي الدائري ودمجها في الإنشاءات. الأهم من ذلك ، يجب أن تكون الالتمهيديات للتضخيم خارج العناصر المتكررة.</li>
	<li>لصق تسلسل الحمض النووي الريبي دائرية(الشكل التكميلي 1 ...

<ol>
	<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+elements:+know+the+SINEs.">Alu elements: know the SINEs.</a> Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).</li><li>Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Alu+editability.">Genome-wide analysis of Alu editability.</a> Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).</li><li>Levanon, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+abundant+A-to-I+editing+sites+in+the+human+transcriptome.">Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome.</a> Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+Skipping+Is+Correlated+with+Exon+Circularization.">Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+translation+of+circular+RNAs+driven+by+N(6)-methyladenosine.">Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine.</a> Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).</li><li>Abe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+Circle+Translation+of+Circular+RNA+in+Living+Human+Cells.">Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells.</a> Scientific Reports. 5, 16435 (2015).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).</li><li>Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Survival+Motor+Neuron+genes+generate+a+vast+repertoire+of+circular+RNAs.">Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).</li><li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing.">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).</li><li>Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+exon+sequences+in+alternative+splicing+of+the+human+fibronectin+gene.">A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene.</a> Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).</li><li>Gaildrat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+splicing+reporter+minigene+assay+to+evaluate+the+effect+on+splicing+of+unclassified+genetic+variants.">Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants.</a> Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li><li>Baralle, D., Baralle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+in+action:+assessing+disease+causing+sequence+changes.">Splicing in action: assessing disease causing sequence changes.</a> Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).</li><li>Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+throughput+analysis+of+alternative+splicing+by+fluorescently+labeled+RT-PCR.">Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).</li><li>Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+strategy+identifies+cardiotonic+steroids+as+alternative+splicing+modulators.">A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).</li><li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrvinium+pamoate+changes+alternative+splicing+of+the+serotonin+receptor+2C+by+influencing+its+RNA+structure.">Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).</li><li>Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+expressing+circular+RNAs+via+tRNA+splicing.">Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-7 (2017).</li><li>Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Expressing+and+Imaging+Abundant,+Stable,+Circular+RNAs+In+Vivo+Using+tRNA+Splicing.">A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing.</a> Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).</li><li>Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+MAPT+locus+generates+circular+RNAs.">The human MAPT locus generates circular RNAs.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).</li><li>Casper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+Genome+Browser+database:+2018+update.">The UCSC Genome Browser database: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).</li><li>Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+plasmid+vectors+expressing+FLAG-tagged+proteins+under+the+regulation+of+human+elongation+factor-1alpha+promoter+using+Gibson+assembly.">Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+to+engineer+DNA+polymerases+for+enhanced+processivity+and+improved+performance+in+vitro.">A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Conn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+quaking+regulates+formation+of+circRNAs.">The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs.</a> Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).</li><li>Jeck, W. R., Sharpless, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+characterizing+circular+RNAs.">Detecting and characterizing circular RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).</li><li>Pamudurti, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+CircRNAs.">Translation of CircRNAs.</a> Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).</li><li>Kramer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+control+of+Drosophila+circular+RNA+expression+by+intronic+repeats,+hnRNPs,+and+SR+proteins.">Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins.</a> Genes &amp; Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).</li><li>Starke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+circularization+requires+canonical+splice+signals.">Exon circularization requires canonical splice signals.</a> Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).</li><li>Suzuki, H., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+pre-mRNA+splicing+from+RNase+R+resistant+RNAs.">A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+alternative+back-splicing+and+alternative+splicing+landscape+of+circular+RNAs.">Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs.</a> Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).</li><li>Liang, D., Wilusz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+intronic+repeat+sequences+facilitate+circular+RNA+production.">Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production.</a> Genes &amp; Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).</li><li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+physiology+and+pathology.">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).</li><li>Fejes-Toth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+processing+generates+a+diversity+of+5'-modified+long+and+short+RNAs.">Post-transcriptional processing generates a diversity of 5'-modified long and short RNAs.</a> Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).</li><li>Gao, Q. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+tau+exon+10,+whose+missplicing+causes+frontotemporal+dementia.">Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia.</a> Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).</li><li>Hartmann, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alternative+splicing+of+human+tau+exon+10+by+phosphorylation+of+splicing+factors.">Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).</li><li>Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+backsplicing+produces+translatable+circular+mRNAs.">Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs.</a> RNA. 21 (2), 172-179 (2015).</li><li>Yang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+GFP-Based+Reporter+to+Study+Back+Splicing+and+Translation+of+Circular+RNA.">Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+profiling+reveals+an+abundant+circHIPK3+that+regulates+cell+growth+by+sponging+multiple+miRNAs.">Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11215 (2016).</li><li>Jia, W., Xu, B., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+expression+profiles+of+mouse+ovaries+during+postnatal+development+and+the+function+of+circular+RNA+epidermal+growth+factor+receptor+in+granulosa+cells.">Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells.</a> Metabolism. 85, 192-204 (2018).</li><li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Output+of+Protein-Coding+Genes+Shifts+to+Circular+RNAs+When+the+Pre-mRNA+Processing+Machinery+Is+Limiting.">The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting.</a> Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).</li><li>Legnini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circ-ZNF609+Is+a+Circular+RNA+that+Can+Be+Translated+and+Functions+in+Myogenesis.">Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis.</a> Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+circRNA+Biogenesis+and+Function+with+NF90/NF110+in+Viral+Infection.">Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection.</a> Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biogenesis+of+Nascent+Circular+RNAs.">The Biogenesis of Nascent Circular RNAs.</a> Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).</li></ol>

بشكل عام ، الحمض النووي الريبي الدائري منخفضة وفيرة1، مما يعقد دراسة وظيفتها وتشكيلها. على غرار RNAsالخطية 13، واستخدام minigenes مراسل يسمح لتحديد رابطة الدول المستقلة والعوامل عبر المفعول التي تنظم تشكيل الحمض النووي الريبي الدائري. وهكذا، يولد هذا النهج فرضيات يمكن ...

الحمض النووي الريبي الدائري الحمض النووي الريبي الدائري (circRNAs) هي مغلقة بشكل التكافؤ واحد RNAs الذين تقطعت بهم السبل التي يتم التعبير عنها في معظم الكائنات الحية. يتم إنشاؤها من خلال الانضمام إلى موقع لصق المصب 5 'إلى موقع لصق المنبع 3 '، وهي عملية تسمى الربط الخلفي(الشكل 1A)1. متواليات في مرحلة ما قبل مرنا التي تعرض قاعدة تكميلية قصيرة مثل 30-40 NT جلب المواقع مرة أخرى لصق في محاذاة مناسبة لتشكيل circRNA2. في البشر، عناصر ألو 1، تمثل حوالي 11٪ من الجينوم3، تشكل هياكل الحمض النووي الريبي المزدوجة واسعة في مرحلة ما قبل مرنا بسبب تكاملها الذاتي4،5 ، وبالتالي تعزيز تشكيل circRNAs1.
وفي الوقت الراهن، تم وصف ثلاث وظائف رئيسية للوظائف المتعلقة بالنُسُر. بعض circRNAs ربط microRNAs (ميرناس) ومن خلال عزل قانون مثل الإسفنج ميرنا6. وقد تورطت CircRNAs في النسخ وبعد تنظيم النسخ، من خلال المنافسة مع الربط الخطي7 أو تعديل نشاط عامل النسخ8. وأخيرا، circRNAs تحتوي على إطارات القراءة المفتوحة قصيرة وإثبات من حيث المبدأ تظهر الدراسات التي يمكن ترجمتها9،10. ومع ذلك ، فإن وظيفة معظم circRNAs لا تزال غامضة. تم الكشف عن معظم RNAs دائرية باستخدام الجيل التالي من أساليب التسلسل11. وتكشف التحليلات التفصيلية للجينات الفردية التي تستخدم نُهج RT-PCR المستهدفة أن عدداً كبيراً من الحمض النووي الريبي الدائري لا يزال يتعين اكتشافه12.
استخدام جينات المراسل لتحليل معالجة ما قبل مرنا تحليل مرنا المستمدة من الحمض النووي المراسل يبني تنتقل العدوى إلى الخلايا هو وسيلة راسخة لدراسة بديل ما قبل مرنا الربط، والتي يمكن تطبيقها على الحمض النووي الريبي دائرية. بشكل عام ، يتم تضخيم الإكسون البديل ، والإنترونالمحيط به ، والطاردين التأسيسيين واستنساخهم في متجه تعبير eukaryotic. في كثير من الأحيان، يتم تقصير الـ introns. يتم نقل الهياكل إلى خلايا eukaryotic وعادة ما يتم تحليلها من قبل RT-PCR13،14. وقد استخدم هذا النهج على نطاق واسع لرسم خريطة مواقع الربط التنظيمية والعوامل العابرة للبالنيابة في تجارب الإرسال المشترك13،15،16،17،18. وبالإضافة إلى ذلك، سمح توليد من البروتين التعبير عن الجينات الصغيرة لفحص المواد التي تغير الربط البديل19،20.
وقد تم تطبيق الأسلوب على الحمض النووي الريبي الدائري. وفي الوقت الراهن، تم وصف ما لا يقل عن 12 عموداً فقرياً صغيراً في الأدبيات وملخصة في الجدول 1. باستثناء نظام التعبير القائم على tRNA21،22، فإنهم يعتمدون جميعًا على مروجي البوليميراز الثاني. هنا ، ونحن نصف طريقة لتوليد minigenes مراسل الإنسان لتحديد رابطة الدول المستقلة والعوامل العابرة للتمثيل المشاركة في توليد الحمض النووي الريبي الدائري. يتم عرض نظرة عامة على الطريقة التي تستخدم متواليات من جين مراسل منشور23 في الشكل 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(PEI) Hydrochloride</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Builder tool</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark Reader Transilluminator.</td>
			<td>Clare Chemical Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymatic DNA assembly kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel and PCR cleanup kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyco Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 cloning site</td>
			<td>Polycloning site</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf" target="_blank">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Q5 DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 2</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1725310</td>
			<td>Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 2</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>206402</td>
			<td>Qiagen long range polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12183025</td>
			<td>Ambion by Life Technologies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td>Epicenter/Lucigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040H</td>
			<td>NEB stable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cloning bacteria</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>NEB5-alpha competent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web tool to design primers</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web-based temperature calculations</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of alu element containing minigenes to analyze circular rnas

بالإضافة إلى mRNAs الخطية، العديد من الجينات eukaryotic توليد الحمض النووي الريبي دائرية. يتم إنشاء معظم الحمض النووي الريبي الدائري عن طريق الانضمام إلى موقع لصق 5 'مع موقع لصق 3 'المنبع داخل ما قبل مرنا، وهي عملية تسمى الربط الخلفي. ومن المرجح أن يكون هذا التعميم بمساعدة الهياكل الثانوية في فترة ما قبل مرنا التي تجلب مواقع التوصيل إلى مكان قريب. في الجينات البشرية، ويعتقد أن عناصر ألو لتعزيز هذه الهياكل الحمض النووي الريبي الثانوية، وعناصر ألو وفيرة ويحمل التكامل قاعدة مع بعضها البعض عندما تكون موجودة في اتجاهات معاكسة في ما قبل مرنا. هنا، ونحن نصف توليد وتحليل كبير، Alu عنصر يحتوي على الجينات المراسل التي تشكل الحمض النووي الريبي الدائري. من خلال التحسين من بروتوكولات الاستنساخ ، يمكن إنشاء جينات المراسل مع ما يصل إلى 20 كيلوبايت طول الإدراج. ويتيح تحليلها في تجارب التعامَل المشترك تحديد العوامل التنظيمية. وهكذا، يمكن لهذه الطريقة تحديد تسلسل الحمض النووي الريبي والمكونات الخلوية المشاركة في تشكيل الحمض النووي الريبي دائرية.

تسمح جينات المراسل بتحديد العوامل التنظيمية التي تؤثر على تكوين الحمض النووي الريبي الدائري. ومع ذلك ، فإن هذه الجينات المراسلة كبيرة وتحتوي على عناصر متكررة غالباً ما تجعل الحمض النووي غير مستقر. نظرا لحجمها الكبير ، غالبا ما يكون من الضروري حذف أجزاء من الإنترونات ، وهو ما يتحقق عن طريق ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs at JoVE.com

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

نحن نسخ وتحليل الجينات مراسل توليد الحمض النووي الريبي دائرية. هذه الجينات المراسل ة أكبر من الإنشاءات لتحليل الربط الخطي وتحتوي على عناصر Alu. للتحقيق في الحمض النووي الريبي الدائري ، يتم نقل المنشئات إلى الخلايا ويتم تحليل الحمض النووي الريبي الناتج باستخدام RT-PCR بعد إزالة الحمض النووي الريبي الخطي.

استخدام عنصر Alu الذي يحتوي على جينات صغيرة لتحليل الحمض النووي الريبي الدائري

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح للمستخدم بإنشاء نظام التعبير الجينومي الذي يمكن أن يخضع للصق بديل وفي هذه الحالة شكل RNAs التعميم التي يمكن اختبارها لوظيفتها ورابطة المرض. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها ستمهد الطريق للآخرين لاستخدام هذا البروتوكول في البيولوجيا الجزيئية والاستنساخ عند دراسة الربط البديل في تشكيل الحمض النووي الريبي (RNA) ووظيفته. نصيحتي لشخص يحاول هذه التقنية للمرة الأولى سيكون لتحسين شروط PCR.تشغيل التدرجات أو تنفيذ هبوط PCR مع درجات حرارة مختلفة التلاهم وأوقات التمديد. عادةً أطول شظايا أكثر من ستة كيلو بايت سوف تمتد كيلو بايت واحد لكل دورة ودرجات حرارة مختلفة الوَرَد ستحتاج إلى اختبار للحصول على أفضل تضخيم. إن عرض هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية لأنه سيعطي المستخدمين تمثيلًا بصريًا أفضل للجوانب الأكثر صعوبة في الإجراء خاصةً توليد ال أوليات.لبدء هذا الإجراء، قم بتحميل متصفح الجينوم UCSC واستخدامه لتحديد العناصر المتكررة اللازمة لتشكيل الحمض النووي الريبي الدائري ودمجها في الانشاءات. الأهم من ذلك، يجب أن تكون ال التمهيدية للتضخيم خارج العناصر المتكررة. لصق تسلسل الجيش الملكي النيبالي الدائري في البحث BLAT الإنسان واختيار الكائن الصحيح.إرسال التسلسل، انتقل إلى طريقة عرض المستعرض، وتصغير أجهزة ضبط الوقت 1.5 أو حسب الاقتضاء. بعد ذلك، قم بالماوس فوق العناصر المتكررة لتحديد نوعها الفرعي في نافذة عائمة. عناصر Alu في خط جيب.استخدم الزر المسارات الافتراضية أسفل الإطار لإعادة تعيين المستعرض إذا تم الحصول على صورة غير صحيحة. أولا الذهاب إلى عرض، والحمض النووي على الخط العلوي من متصفح الجينوم USCS لتحميل تسلسل الحمض النووي هو مبين في النافذة. في خيار تنسيق التسلسل، حدد خيارات الحالة/اللون الموسعة.حدد الحالة الافتراضية كأدنى وحدد حالة تبديل لـ NCBI RefSeq. حدد التسطير والغامق والماتيكي لـ RepeatMasker. انقر فوق إرسال.سيكون هناك exons كأحرف كبيرة وsontrons كأحرف صغيرة. تحقق من حدود exon/intron. إذا كان المستعرض يظهر عكس تكملة، والعودة وحدد عكس مربع تكملة حتى يتم عرض حدود exon /intron الصحيح.بعد ذلك، نسخ الملف مع الاتجاه الصحيح إلى مستند معالجة النصوص وتسليط الضوء على exons. حدد الأجزاء التي سيتم تضخيمها مع التأكد من أن intron لا يبدأ أو ينتهي في منطقة متكررة حيث أن ال التمهيديات في هذه المناطق لن تضخم تسلسلات محددة. للبدء، استخدم أداة ويب لتصميم ال أوليات للاستنساخ.بالنسبة للتسلسل المتجهي، أضف موقع الإدراج كناوكليوتيد أخير ثم قم بإضافة الشظايا لاحقاً. منذ ترقيم المتجهات لا يبدأ مع موقع الإدراج معطى موقع الإدراج في المتجه يتم وضع الجزء المتلقين للانطلاق أمام تسلسل المنبع. ضبط التمهيدي إذا كانت نقاط الانصهار الخاصة بهم أكثر من أربع درجات مئوية وبصرف النظر لا تعمل في التضخيم.في هذه الدراسة، يتم استنساخ جينات المراسل التي تولد RNAs دائرية وتحليلها. يتم فصل منتجات PCR الأمثل على جل agarose 1٪ يحتوي على 1X هلام الأخضر. وتمثل الشرائط الفردية منتجات PCR التي ستستخدم في تجميع الحمض النووي الأنزيمي.ثم يتم قطع هذه العصابات من هلام وتنقية. لا يتم تشغيل المنتج PCR المنقى صحيح إلى الحجم المتوقع مع الأخضر هلام حتى يتم فصل المنتجات أيضا على 1٪ agarose هلام التي هي في وقت لاحق ملطخة بروميد الإتيهيديوم لضمان المنتجات هي الحجم الصحيح. للبدء، حدد مجموعة تجميع الحمض النووي الأنزيمية.الجمع بين المتجه وإدراج في نسبة الولي من واحد إلى اثنين. المقبل، إضافة 10 ميكرولترات من الحمض النووي الجمع ماجستير المزيج. احتضان العينات لمدة 60 دقيقة في 50 درجة.ذوبان الخلايا المختصة على الجليد أثناء الحضانة. يجب أن تكون الخلايا في حجم 50 ميكرولترات. بعد ذلك ، تحويل الخلايا المختصة مع رد فعل الجمعية الكلية.إضافة اثنين microliters من المنتج المبردة تجميعها إلى الخلايا المختصة. مزيج عن طريق نفض الغبار بلطف الأنبوب أربع إلى خمس مرات. لا دوامة.وضع الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة. سخني الخليط عند درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. ثم ضعه مرة أخرى على الجليد لمدة دقيقتين.بعد ذلك، إضافة 950 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة SOC وسائل الإعلام إلى الأنبوب. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة بينما تهتز في 300 دورة في الدقيقة. خلال هذا الحضانة، دافئة اثنين من لوحات الاختيار التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة.بعد الحضانة، الطرد المركزي أنبوب التفاعل في 10، 000 ز لمدة 30 ثانية ل بيليه الخلايا وطبقة من أصل 25٪ من الخلايا على لوحة اختيار واحد و 75٪ على الآخر. احتضان هذه اللوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. قبل أن تبدأ في عملية نقل الرضّع، تحقق من الحمض النووي الخاص بك عن طريق خلاصة التقييد.هنا، يتم قطع minigene ممثل يحتوي على exons 9 من خلال 12 مع إنزيمات تقييد المشار إليها لاستبعاد إعادة الكومبينيشنات الرئيسية. بالنسبة إلى التحلل، قم أولاً بحل هيدروكلوريد البولي إيثيلين الخطي في الماء بتركيز مليغرام واحد لكل ملليلتر عند درجة هيدروكلورية 2. استخدام هيدروكسيد الصوديوم لتحقيق درجة الحرارة تصل إلى سبعة ومعقم تصفية الحل مع مرشح ميكرومتر 0.22.تخزين الحل في أربع درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام. ثم تقسيم الخلايا إلى آبار من لوحة ستة جيدا والسماح لهم تنمو بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS. في اليوم التالي، aliquot ميكروغرام واحد من الجين المبلغ عنها في أنبوب معقمة وإضافة 200 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم معقم 150 ملليمولار.مزيج من دوامة. بعد ذلك، إضافة حل البولي إيثيلينيمين إلى هذا الخليط بنسبة ثلاثة ميكرولترات من البولي إيثيلينمينيمين لكل ميكروغرام واحد من الحمض النووي. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لجمع العينات في الجزء السفلي من الأنبوب.احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم إضافته مباشرة إلى خلايا HEK293. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في اليوم التالي، استخدم RNA عزل عدة لعزل الجيش الملكي النيبالي لRT-PCR. يتم تضخيم cDNA من عينتين مشتقتين من أنسجة الدماغ البشرية مع التمهيديات RNA دائرية تدور حول تاو إكسون 1210 عكس وظرفي تاو إكسون 1211 إلى الأمام. في حين أن الفرقة المتوقعة المقابلة لـ TAU RNA الدائرية وينظر ، والفرق القوية الأخرى هي القطع الأثرية التي لا تتطابق مع الجينوم البشري.وتُكرَّر هذه التجربة مع ظروف PCR متطابقة، ولكن تم إجراء النسخ العكسي فقط مع التمهيدي العكسي لـ tau exon 1210. يتم تضخيم النطاق المتوقع فقط والتحقق من صحته من خلال التسلسل. ثم يتم التعامل مع الجيش الملكي النيبالي RNASE الذي يزيل RNA خطي.الجيش الملكي الريبي الدائري هو الكشف بعد العلاج في حين أن الجيش الملكي النيبالي الخطي يعطي لم يعد إشارة يمكن الكشف عنها. يتم عزل الحمض النووي الريبي 24 ساعة بعد transfection وتحليلها من قبل RT-PCR. التضخيم من mRNA تاو خطي يظهر اثنين من العصابات بسبب الربط البديل من exon 10.تتغير نسبتهم إلى التعبير المفرط عن عوامل الربط. التضخيم من التعميم 1210 تاو الجيش الملكي النيبالي يظهر الاعتماد على تاو CIRC RNA التعبير على التعبير عن بعض عوامل الربط وخاصة CDC2 مثل كيناز CLK2 و بروتين ريال 9G8. أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا الإجراء هو تصميم وموقع التمهيدي عند بناء minigene.التمهيدي لا ينبغي أن تكمن في العناصر المتكررة، وسوف تحتاج إلى أن تكون الأمثل في ظل ظروف مختلفة اعتمادا على جزء يجري تضخيمها. بعد هذا الإجراء، سيتم اختبار الأساليب الأخرى التي يمكن تنفيذها وظيفة RNAs التعميم. يمكن للمستخدمين اختبار الترجمة أو عزل البروتينات لتحديد وظيفة لرنا دائري محدد يهتم المستخدم.مهدت هذه التقنية الطريق لاستخدام شظايا الجينوم في نظام minigene التي يمكن أن تعبر أكثر عن RNAs التعميم مما يسمح للمستخدم لاختبار وتحديد وظيفتها وفي بعض الجوانب ارتباطهم بالأمراض. الآثار المترتبة على هذه التقنية يمتد نحو العلاجات المحتملة والتشخيص لمرض معين، على سبيل المثال tauopathies، الأمراض العصبية المرتبطة بأمراض تاو. لقد اكتشفنا أن بروتين تاو المرتبط بالميكروتوب، والمعروف باسم MAPT، يولد RNAs دائرية التي نعتقد أنها تساهم في أمراض المرض وهذه الطريقة تسمح لنا بدراسة كاملة هذه RNAs التعميم وتحديد وظيفتها وعلاقتها بالمرض.ويمكن لهذه الطريقة أن توفر نظرة ثاقبة لفهم أفضل للرنا رنا دائرية، ما هي وظائفها، والدور الذي قد تلعبه في بعض الأمراض. ويمكن تطبيق هذه الطريقة في استنساخ genes الأخرى التي تعبر عن RNAs دائرية عبر الأنواع حيث يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في وظيفتها. تضخيم منتجات PCR يثبت أن يكون الأكثر صعوبة مع شظايا طويلة تضخيمها من الحمض النووي الجينومي، جنبا إلى جنب مع وجود عناصر متكررة متعددة داخل جزء.

use-of-alu-element-containing-minigenes-to-analyze-circular-rnas

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.

We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.

الجمع بين الرطب وتقنيات مختبر الجافة لتوجيه بلورة البروتينات كبيرة ملفوف لفائف تحتوي على

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

قياس متزامنة من بيروكسيد الهيدروجين فائق أكسيد/وإنتاج NADH Dehydrogenases المتقدرية المحتوية على فلافين

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. The ability to readily detect the formation of these fibers under various experimental conditions is essential for understanding their potential function. Many methods have been used to detect the fibers, but not without some drawbacks. For example, electron microscopy (EM), or staining with Congo Red or Thioflavin T often requires purification of the fibers. On the other hand, semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (SDD-AGE) allows detection of the SDS-resistant amyloid-like fibers in the cell extracts without purification. In addition, it allows the comparison of the size difference of the fibers. More importantly, it can be used to identify specific proteins within the fibers by Western blotting. It is less time consuming and more easily accessible to a wider number of labs. SDD-AGE results often show variable degree of heterogeneity. It raises the question whether part of the heterogeneity results from the dissociation of the protein complex during the electrophoresis in the presence of SDS. For this reason, we have employed a second dimension of SDD-AGE to determine if the size heterogeneity seen in SDD-AGE is truly a result of fiber heterogeneity in vivo and not a result of either degradation or dissociation of some of the proteins during electrophoresis. This method allows fast, qualitative confirmation that the amyloid or amyloid-like fibers are not partially dissociating during the SDD-AGE process.

Here we use two-dimensional semi-denaturing agarose gel electrophoresis to confirm the presence of amyloid-like fibers of heterogeneous size and exclude the possibility that the size heterogeneity is due to dissociation of the amyloid fibers during the gel running process.

استخدام الأبعاد شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد اثنين لتأكيد عدم تجانس حجم الألياف اميلويد أو اميلويد مثل

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

الإنتاج الواسع النطاق للكشف المؤتلف في سقالة دائرية باستخدام نظام المستمدة من فرويد في الإشريكيّة القولونية

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

التعبير، تنقية، تبلور، واختبارات إنزيم من البروتينات التي تحتوي على مجال الهيدرولاز اتاتس

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a multitude of samples. It has been extensively used in many research areas and achieved industrial application in fields such as human diagnostics and trait selection in crops of genetically modified organisms (GMO) crops. However, qPCR is not an error-proof technique. Mixing all reagents into a single master mix subsequently distributed onto 96 wells of a regular qPCR plate might lead to operator mistakes such as incorrect mixing of reagents or inaccurate dispensing into the wells. Here, a technique called gelification is presented, whereby most of the water present in the master mix is substituted by reagents that form a sol-gel mixture when submitted to a vacuum. As a result, qPCR reagents are effectively preserved for a few weeks at room temperature or a few months at 2-8 oC. Details of preparing each solution are shown here along with the expected aspect of a gelified reaction designed to detect&#160;T. cruzi satellite DNA (satDNA). A similar procedure can be applied to detect other organisms. Starting a gelified qPCR run is as simple as removing the plate from the refrigerator, adding the samples to their respective wells, and starting the run, thus decreasing the setup time of a full-plate reaction to the time it takes to load the samples. Additionally, gelified PCR reactions can be produced and controlled for quality in batches, saving time and avoiding common operator mistakes while running routine PCR reactions.

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

The present work describes the steps for producing ready-to-use qPCR for T. cruzi DNA detection that can be pre-loaded on the reaction vessel and stored in the refrigerator for several months.

qPCR جاهز للاستخدام للكشف عن الحمض النووي من المثقبية الكروزية أو الكائنات المسببة للأمراض الأخرى

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

صياغة وتوصيف العوامل النشطة بيولوجيا المحتوية على أقراص نانوية

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...