Name: use of alu element containing minigenes to analyze circular rnas
Uploaded: 2020-03-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le ministère de la Défense DoD subvention AZ180075. Stefan Stamm remercie Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin a été soutenue par le DAAD, programme allemand d’échange académique, Justin R. Welden a été récipiendaire de l’Université du Kentucky Max Steckler Award.

1. Conception des constructions
<ol><li>Utilisez le navigateur24 du génome de l’UCSC pour identifier les éléments répétitifs nécessaires à la formation circulaire d’ARN et les incorporer dans les constructions. Fait important, les amorces pour l’amplification doivent être en dehors des éléments répétitifs.</li>
	<li>Coller la séquence circulaire d’ARN(figure supplémentaire 1 est une séquence d’essai) en <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?com...

<ol>
	<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+elements:+know+the+SINEs.">Alu elements: know the SINEs.</a> Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).</li><li>Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Alu+editability.">Genome-wide analysis of Alu editability.</a> Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).</li><li>Levanon, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+abundant+A-to-I+editing+sites+in+the+human+transcriptome.">Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome.</a> Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+Skipping+Is+Correlated+with+Exon+Circularization.">Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+translation+of+circular+RNAs+driven+by+N(6)-methyladenosine.">Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine.</a> Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).</li><li>Abe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+Circle+Translation+of+Circular+RNA+in+Living+Human+Cells.">Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells.</a> Scientific Reports. 5, 16435 (2015).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).</li><li>Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Survival+Motor+Neuron+genes+generate+a+vast+repertoire+of+circular+RNAs.">Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).</li><li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing.">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).</li><li>Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+exon+sequences+in+alternative+splicing+of+the+human+fibronectin+gene.">A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene.</a> Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).</li><li>Gaildrat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+splicing+reporter+minigene+assay+to+evaluate+the+effect+on+splicing+of+unclassified+genetic+variants.">Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants.</a> Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li><li>Baralle, D., Baralle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+in+action:+assessing+disease+causing+sequence+changes.">Splicing in action: assessing disease causing sequence changes.</a> Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).</li><li>Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+throughput+analysis+of+alternative+splicing+by+fluorescently+labeled+RT-PCR.">Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).</li><li>Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+strategy+identifies+cardiotonic+steroids+as+alternative+splicing+modulators.">A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).</li><li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrvinium+pamoate+changes+alternative+splicing+of+the+serotonin+receptor+2C+by+influencing+its+RNA+structure.">Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).</li><li>Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+expressing+circular+RNAs+via+tRNA+splicing.">Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-7 (2017).</li><li>Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Expressing+and+Imaging+Abundant,+Stable,+Circular+RNAs+In+Vivo+Using+tRNA+Splicing.">A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing.</a> Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).</li><li>Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+MAPT+locus+generates+circular+RNAs.">The human MAPT locus generates circular RNAs.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).</li><li>Casper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+Genome+Browser+database:+2018+update.">The UCSC Genome Browser database: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).</li><li>Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+plasmid+vectors+expressing+FLAG-tagged+proteins+under+the+regulation+of+human+elongation+factor-1alpha+promoter+using+Gibson+assembly.">Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+to+engineer+DNA+polymerases+for+enhanced+processivity+and+improved+performance+in+vitro.">A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Conn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+quaking+regulates+formation+of+circRNAs.">The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs.</a> Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).</li><li>Jeck, W. R., Sharpless, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+characterizing+circular+RNAs.">Detecting and characterizing circular RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).</li><li>Pamudurti, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+CircRNAs.">Translation of CircRNAs.</a> Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).</li><li>Kramer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+control+of+Drosophila+circular+RNA+expression+by+intronic+repeats,+hnRNPs,+and+SR+proteins.">Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins.</a> Genes &amp; Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).</li><li>Starke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+circularization+requires+canonical+splice+signals.">Exon circularization requires canonical splice signals.</a> Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).</li><li>Suzuki, H., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+pre-mRNA+splicing+from+RNase+R+resistant+RNAs.">A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+alternative+back-splicing+and+alternative+splicing+landscape+of+circular+RNAs.">Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs.</a> Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).</li><li>Liang, D., Wilusz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+intronic+repeat+sequences+facilitate+circular+RNA+production.">Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production.</a> Genes &amp; Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).</li><li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+physiology+and+pathology.">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).</li><li>Fejes-Toth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+processing+generates+a+diversity+of+5'-modified+long+and+short+RNAs.">Post-transcriptional processing generates a diversity of 5'-modified long and short RNAs.</a> Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).</li><li>Gao, Q. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+tau+exon+10,+whose+missplicing+causes+frontotemporal+dementia.">Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia.</a> Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).</li><li>Hartmann, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alternative+splicing+of+human+tau+exon+10+by+phosphorylation+of+splicing+factors.">Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).</li><li>Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+backsplicing+produces+translatable+circular+mRNAs.">Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs.</a> RNA. 21 (2), 172-179 (2015).</li><li>Yang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+GFP-Based+Reporter+to+Study+Back+Splicing+and+Translation+of+Circular+RNA.">Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+profiling+reveals+an+abundant+circHIPK3+that+regulates+cell+growth+by+sponging+multiple+miRNAs.">Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11215 (2016).</li><li>Jia, W., Xu, B., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+expression+profiles+of+mouse+ovaries+during+postnatal+development+and+the+function+of+circular+RNA+epidermal+growth+factor+receptor+in+granulosa+cells.">Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells.</a> Metabolism. 85, 192-204 (2018).</li><li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Output+of+Protein-Coding+Genes+Shifts+to+Circular+RNAs+When+the+Pre-mRNA+Processing+Machinery+Is+Limiting.">The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting.</a> Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).</li><li>Legnini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circ-ZNF609+Is+a+Circular+RNA+that+Can+Be+Translated+and+Functions+in+Myogenesis.">Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis.</a> Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+circRNA+Biogenesis+and+Function+with+NF90/NF110+in+Viral+Infection.">Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection.</a> Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biogenesis+of+Nascent+Circular+RNAs.">The Biogenesis of Nascent Circular RNAs.</a> Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).</li></ol>

En général, les ARN circulaires sont faibles abondants1, ce qui complique l’étude de leur fonction et de leur formation. Semblable aux ARN linéaires13, l’utilisation de minigènes reporter permet l’identification des cis et des facteurs trans-acteurs qui régulent la formation d’ARN circulaires. Ainsi, cette approche génère des hypothèses qui peuvent être testées plus en utilisant les gènes endogènes.
L’étape la plus critiqu...

Arn circulaires Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN échoués isolés fermés covalentement qui sont exprimés dans la plupart des organismes. Ils sont générés en rejoignant un site d’épissage en aval 5' à un site d’épissage en amont 3', un processus appelé back-splicing (Figure 1A)1. Les séquences de l’ARNM pré-mRNA qui présentent une base complémentaire aussi courte que 30-40 nt apportent des sites d’attelle arrière dans un alignement approprié pour la formation d’ARN2. Chez l’homme, les éléments Alu 1, représentant environ 11% du génome3, forment de vastes structures d’ARN double brin dans l’ARN pré-mRNA en raison de leur auto-complémentarité4,5 et favorisent ainsi la formation de circRNAs1.
À l’heure actuelle, trois fonctions principales des circARN ont été décrites. Certains circRNAs lient microARN (miRNAs) et par la séquestration agissent comme des éponges miRNA6. Les CircRNAs ont été impliqués dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle, par la concurrence avec l’épissage linéaire7 ou la modulation de l’activité du facteur de transcription8. Enfin, les circARN contiennent de courts cadres de lecture ouverts et des études de preuve de principe montrent qu’ils peuvent être traduits9,10. Cependant, la fonction de la plupart des circRNAs reste énigmatique. La majorité des ARN circulaires ont été détectés à l’aide de méthodes de séquençage de nouvelle génération11. Des analyses détaillées des gènes individuels à l’aide d’approches ciblées RT-PCR révèlent qu’un grand nombre d’ARN circulaires reste à découvrir12.
Utilisation de gènes reporter pour analyser le traitement pré-mRNA L’analyse de l’ARNm dérivée des constructions de reporter d’ADN transfected dans des cellules est une méthode bien établie pour étudier l’épissage alternatif d’ARNm, qui peut être appliqué aux ARN circulaires. En général, l’exon alternatif, ses introns environnants, et les exons constitutifs sont amplifiés et clonés dans un vecteur d’expression eucaryote. Fréquemment, les introns sont raccourcis. Les constructions sont transfected dans des cellules eucaryotes et généralement analysés par RT-PCR13,14. Cette approche a été largement utilisée pour cartographier les sites d’épissage réglementaire et les facteurs trans-acteurs dans les expériences de co-transfection13,15,16,17,18. En outre, la génération de minigènes exprimant des protéines a permis le dépistage des substances qui changent l’épissage alternatif19,20.
La méthode a été appliquée aux ARN circulaires. À l’heure actuelle, au moins 12 épines dorsales minigène ont été décrites dans la littérature et sont résumées dans le tableau 1. À l’exception du système d’expression basé sur l’ARN TRNA21,22, ils sont tous dépendants des promoteurs de polymérase II. Ici, nous décrivons une méthode pour générer des minigènes de reporter humain pour déterminer les cis et les facteurs trans-agissant impliqués dans la génération des ARN circulaires. Un aperçu de la méthode à l’aide de séquences d’un gène reporter publié23 est montré dans la figure 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(PEI) Hydrochloride</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Builder tool</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark Reader Transilluminator.</td>
			<td>Clare Chemical Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymatic DNA assembly kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel and PCR cleanup kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyco Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 cloning site</td>
			<td>Polycloning site</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf" target="_blank">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Q5 DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 2</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1725310</td>
			<td>Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 2</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>206402</td>
			<td>Qiagen long range polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12183025</td>
			<td>Ambion by Life Technologies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td>Epicenter/Lucigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040H</td>
			<td>NEB stable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cloning bacteria</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>NEB5-alpha competent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web tool to design primers</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web-based temperature calculations</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of alu element containing minigenes to analyze circular rnas

En plus des ARM linéaires, de nombreux gènes eucaryotes génèrent des ARN circulaires. La plupart des ARN circulaires sont générés en rejoignant un site d’épissage 5' avec un site d’épissage en amont 3' dans un pré-mRNA, un processus appelé back-splicing. Cette circularisation est probablement facilitée par des structures secondaires dans le pré-mRNA qui amènent les sites d’épissage à proximité. Dans les gènes humains, les éléments Alu sont pensés pour promouvoir ces structures secondaires d’ARN, car les éléments d’Alu sont abondants et présentent des complémentarités de base les unes avec les autres lorsqu’ils sont présents dans des directions opposées dans l’ARN pré-m. Ici, nous décrivons la génération et l’analyse de grand élément Alu contenant des gènes de reporter qui forment des ARN circulaires. Grâce à l’optimisation des protocoles de clonage, des gènes reporter avec jusqu’à 20 kb de longueur d’insertion peuvent être générés. Leur analyse dans les expériences de co-transfection permet d’identifier les facteurs réglementaires. Ainsi, cette méthode peut identifier les séquences d’ARN et les composants cellulaires impliqués dans la formation circulaire d’ARN.

Les gènes de reporter permettent la détermination des facteurs réglementaires qui influencent la formation circulaire d’ARN. Cependant, ces gènes de reporter sont grands et contiennent des éléments répétitifs qui rendent souvent les constructions d’ADN instables. En raison de leur grande taille, il est souvent nécessaire de supprimer des parties des introns, qui est atteint en amplifiant les pièces génomiques contenant les exons et les parties introniques flanquantes plus petites. Ces morceaux d’ADN sont...

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Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Nous cloner et analyser les gènes des reporters générant des ARN circulaires. Ces gènes reporter sont plus grands que les constructions pour analyser l’épissage linéaire et contenir des éléments Alu. Pour étudier les ARN circulaires, les constructions sont transfected dans les cellules et l’ARN résultant est analysé à l’aide de RT-PCR après l’élimination de l’ARN linéaire.

Utilisation d’un élément Alu contenant des minigènes pour analyser les ARN circulaires

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Ce protocole est significatif parce qu’il permet à l’utilisateur de générer un système d’expression génomique qui peut subir d’autres épissages et dans ce cas former des ARN circulaires qui peuvent être testés pour leur fonction et l’association de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ouvrira la voie à d’autres pour utiliser ce protocole en biologie moléculaire et clonage lors de l’étude de l’épissage alternatif dans la formation et la fonction circulaires de l’ARN. Mon conseil à quelqu’un qui essaie cette technique pour la première fois serait d’optimiser les conditions PCR.Exécutez des gradients ou exécutez pcr touchdown avec différentes températures d’annealing et temps d’extension. Habituellement, des fragments plus longs de plus de six KB prolongeront un KB par cycle et différentes températures d’annealage devraient être testées pour la meilleure amplification. La démonstration de cette méthode est essentielle car elle donnera aux utilisateurs une meilleure représentation visuelle des aspects les plus difficiles de la procédure, en particulier la génération d’amorce.Pour commencer cette procédure, chargez le navigateur ucsc génome et l’utiliser pour identifier les éléments répétitifs nécessaires à la formation circulaire de l’ARN et les intégrer dans les constructions. Fait important, les amorces pour l’amplification doivent être en dehors des éléments répétitifs. Coller la séquence d’ARN circulaire dans la recherche blat humaine et sélectionnez le bon organisme.Soumettez la séquence, rendez-vous à la vue du navigateur et effectuez un zoom arrière de 1,5 délai ou, le cas échéant. Ensuite, souris sur les éléments répétitifs pour identifier leur sous-type dans une fenêtre flottante. Les éléments Alu sont dans la ligne sinusoïde.Utilisez le bouton de suivi par défaut sous la fenêtre pour réinitialiser le navigateur si une image incorrecte est obtenue. D’abord aller voir, l’ADN sur la ligne supérieure du navigateur génome USCS pour télécharger la séquence d’ADN montré dans la fenêtre. Dans l’option de mise en forme de séquençage, sélectionnez des options étendues cas/couleur.Sélectionnez le cas par défaut comme cas inférieur et sélectionnez le boîtier de bascule pour NCBI RefSeq. Sélectionnez soulignez et gras et italique pour RepeatMasker. Cliquez sur soumettre.Il y aura des exons comme majuscules et introns comme lettres minuscules. Vérifiez les bordures exon/intron. Si le navigateur affiche le complément inverse, retournez et sélectionnez la boîte de complément inversée jusqu’à ce que les bordures exon/intron correctes soient montrées.Ensuite, copiez le fichier avec l’orientation correcte dans un document de traitement de texte et mettez en surbrillance les exons. Sélectionnez les fragments à amplifier en vous assurant que l’intron ne commence pas ou ne se termine pas dans une région répétitive, car les amorces de ces régions n’amplifieront pas des séquences spécifiques. Pour commencer, utilisez un outil Web pour concevoir les amorces pour le clonage.Pour la séquence vectorielle, ajouter le site d’insertion comme dernier nucléotide et ajouter par la suite les fragments. Comme la numérotation vectorielle ne commence pas par un site d’insertion donné, le site d’insertion dans le vecteur est localisé et la partie aval est mise devant la séquence en amont. Ajustez les amorces si leurs points de fusion sont séparés de plus de quatre degrés Celsius et ne fonctionnent pas dans l’amplification.Dans cette étude, les gènes des journalistes qui génèrent des ARN circulaires sont clonés et analysés. Les produits PCR optimisés sont séparés sur un gel d’agarose de 1% contenant 1X gel vert. Les bandes individuelles représentent les produits PCR qui seront utilisés dans l’assemblage d’ADN enzymatique.Ces bandes sont ensuite découpées dans le gel et purifiées. Le produit PCR purifié ne fonctionne pas fidèle à la taille prévue avec gel vert de sorte que les produits sont également séparés sur un gel d’agarose de 1% qui est par la suite taché de bromure d’éthidium pour s’assurer que les produits sont de la bonne taille. Pour commencer, mettez en place un kit d’assemblage d’ADN enzymatique.Combinez le vecteur et les inserts dans un rapport molaire de un à deux. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de mélange maître d’assemblage d’ADN. Incuber des échantillons pendant 60 minutes à 50 degrés.Décongeler les cellules compétentes sur la glace pendant l’incubation. Les cellules doivent être dans un volume de 50 microlitres. Ensuite, transformez les cellules compétentes avec la réaction totale d’assemblage.Ajouter deux microlitres du produit assemblé réfrigéré aux cellules compétentes. Mélanger en faisant glisser doucement le tube quatre à cinq fois. Ne pas vortex.Déposer le mélange sur la glace pendant 30 minutes. La chaleur choque le mélange à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes. Ensuite, placez-le sur la glace pendant deux minutes.Après cela, ajouter 950 microlitres de température ambiante SOC médias au tube. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes tout en secouant à 300 RPM. Pendant cette incubation, réchauffer deux plaques de sélection qui contiennent l’antibiotique approprié.Après l’incubation, centrifugez le tube de réaction à 10 000 g pendant 30 secondes pour pelleter les cellules et plaquer 25% des cellules sur une plaque de sélection et 75% sur l’autre. Incubez ces plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Avant de commencer la transfection, vérifiez votre ADN par restriction digest.Ici, un minigène tau représentatif qui contient des exons neuf à 12 est coupé avec des enzymes de restriction indiquées pour exclure les recombinaisons majeures. Pour la transfection, dissoudre d’abord l’hydrochlorure linéaire de polyéthylène dans l’eau à une concentration d’un milligramme par millilitre au pH deux. Utilisez de l’hydroxyde de sodium pour amener le pH jusqu’à sept et filtrez stérilement la solution avec un filtre de 0,22 micromètre.Conservez la solution à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Ensuite, divisez les cellules en puits d’une plaque de six puits et laissez-les pousser pendant la nuit à DMEM media contenant 10%FBS. Le lendemain, aliquot un microgramme du gène rapporté dans un tube stérile et ajouter 200 microlitres de chlorure de sodium filtré stérile de 150 millimlaires.Mélanger par vortex. Ensuite, ajoutez la solution de polyéthyllènenimine à ce mélange à un rapport de trois microlitres de polyéthylnimine pour chacun microgramme d’ADN. Centrifugeuse brièvement pour recueillir des échantillons au fond du tube.Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez-le directement aux cellules HEK293. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Le lendemain, utilisez un kit d’isolation arn pour isoler l’ARN pour RT-PCR. cDNA de deux échantillons dérivés des tissus cérébraux humains sont amplifiés avec des amorces circulaires d’ARN circ tau exon 1210 inverse et circ tau exon 1211 vers l’avant. Bien que la bande attendue correspondant à l’ARN circulaire tau soit observée, les autres bandes fortes sont des artefacts qui ne correspondaient pas au génome humain.Cette expérience est répétée avec des conditions PCR identiques, mais la transcription inverse n’a été effectuée qu’avec l’amorce inverse circ tau exon 1210. Seule la bande attendue est amplifiée et validée par séquençage. L’ARN est ensuite traité avec RNase R qui supprime l’ARN linéaire.L’ARN circulaire est détectable après le traitement tandis que l’ARN linéaire ne donne plus de signal détectable. L’ARN est isolé 24 heures après transfection et analysé par RT-PCR. L’amplification de l’ARNm tau linéaire montre deux bandes dues à l’épissage alternatif de l’exon 10.Leur rapport change à la sur-expression des facteurs d’épissage. L’amplification de l’ARN tau circulaire 1210 montre la dépendance de l’expression de l’ARN tau circ sur l’expression de certains facteurs d’épissage en particulier le Cdc2-like kinase CLK2 et la protéine SR 9G8. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est la conception et l’emplacement des amorces lors de la construction d’un minigène.L’amorce ne doit pas se trouver dans des éléments répétitifs et devra être optimisée dans des conditions différentes selon le fragment amplifié. Après cette procédure, d’autres méthodes qui peuvent être effectuées seront de tester la fonction des ARN circulaires. Les utilisateurs peuvent tester la traduction ou la séquestration des protéines afin d’identifier une fonction pour l’ARN circulaire spécifique qui intéresse l’utilisateur.Cette technique a ouvert la voie à l’utilisation de fragments génomiques dans un système minigène qui peut plus exprimer les ARN circulaires permettant à l’utilisateur de tester et d’identifier leur fonction et, dans certains aspects, leur association à la maladie. L’implication de cette technique s’étend aux thérapies potentielles et aux diagnostics d’une maladie particulière, par exemple tauopathies, maladies neurodégénératives liées à la pathologie tau. Nous avons découvert que la protéine tau associée aux microtubules, connue sous le nom de MAPT, génère des ARN circulaires qui, selon nous, contribuent à la pathologie de la maladie et cette méthode nous permet d’étudier pleinement ces ARN circulaires et d’identifier leur fonction et leur relation à la maladie.Cette méthode pourrait donner un aperçu d’une meilleure compréhension des ARN circulaires, de leurs fonctions et du rôle qu’elles peuvent jouer dans certaines maladies. Cette méthode peut être appliquée dans le clonage d’autres minigènes qui expriment des ARN circulaires à travers les espèces où il peut fournir un aperçu de leur fonction. L’amplification des produits PCR s’avère être la plus difficile avec de longs fragments amplifiés à partir de l’ADN génomique, ainsi que d’avoir de multiples éléments répétitifs dans le fragment.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.

We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.

La combinaison humide et Techniques de laboratoire sec Guide pratique du Cristallisation de grandes superhélice contenant des protéines

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Recherche

Biochimie

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Quantification de l’abondance et la recharge des niveaux d’ARN de transfert chez Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

Mesure simultanée de superoxyde/eau oxygénée et NADH Production de Flavin-contenant des déshydrogénases mitochondriales

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. The ability to readily detect the formation of these fibers under various experimental conditions is essential for understanding their potential function. Many methods have been used to detect the fibers, but not without some drawbacks. For example, electron microscopy (EM), or staining with Congo Red or Thioflavin T often requires purification of the fibers. On the other hand, semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (SDD-AGE) allows detection of the SDS-resistant amyloid-like fibers in the cell extracts without purification. In addition, it allows the comparison of the size difference of the fibers. More importantly, it can be used to identify specific proteins within the fibers by Western blotting. It is less time consuming and more easily accessible to a wider number of labs. SDD-AGE results often show variable degree of heterogeneity. It raises the question whether part of the heterogeneity results from the dissociation of the protein complex during the electrophoresis in the presence of SDS. For this reason, we have employed a second dimension of SDD-AGE to determine if the size heterogeneity seen in SDD-AGE is truly a result of fiber heterogeneity in vivo and not a result of either degradation or dissociation of some of the proteins during electrophoresis. This method allows fast, qualitative confirmation that the amyloid or amyloid-like fibers are not partially dissociating during the SDD-AGE process.

Here we use two-dimensional semi-denaturing agarose gel electrophoresis to confirm the presence of amyloid-like fibers of heterogeneous size and exclude the possibility that the size heterogeneity is due to dissociation of the amyloid fibers during the gel running process.

Utilisation de deux dimensions semi dénaturation détergent Gel d’agarose pour confirmer l’hétérogénéité de la taille des fibres amyloïdes ou type amyloïde

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Production à grande échelle d’ARN Recombinant sur un échafaudage circulaire utilisant un système dérivé de Viroid chez Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Expression, Purification, Cristallisation et Essais enzymatiques des protéines contenant du domaine de l'hydrolase fumarylacetoacetate

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Utilisation de la thermophorèse à micro-échelle pour mesurer les interactions protéine-lipide

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a multitude of samples. It has been extensively used in many research areas and achieved industrial application in fields such as human diagnostics and trait selection in crops of genetically modified organisms (GMO) crops. However, qPCR is not an error-proof technique. Mixing all reagents into a single master mix subsequently distributed onto 96 wells of a regular qPCR plate might lead to operator mistakes such as incorrect mixing of reagents or inaccurate dispensing into the wells. Here, a technique called gelification is presented, whereby most of the water present in the master mix is substituted by reagents that form a sol-gel mixture when submitted to a vacuum. As a result, qPCR reagents are effectively preserved for a few weeks at room temperature or a few months at 2-8 oC. Details of preparing each solution are shown here along with the expected aspect of a gelified reaction designed to detect&#160;T. cruzi satellite DNA (satDNA). A similar procedure can be applied to detect other organisms. Starting a gelified qPCR run is as simple as removing the plate from the refrigerator, adding the samples to their respective wells, and starting the run, thus decreasing the setup time of a full-plate reaction to the time it takes to load the samples. Additionally, gelified PCR reactions can be produced and controlled for quality in batches, saving time and avoiding common operator mistakes while running routine PCR reactions.

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

The present work describes the steps for producing ready-to-use qPCR for T. cruzi DNA detection that can be pre-loaded on the reaction vessel and stored in the refrigerator for several months.

qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de Trypanosoma cruzi ou d’autres organismes pathogènes

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

Formulation et caractérisation d’agents bioactifs contenant des nanodisques

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...