Name: use of alu element containing minigenes to analyze circular rnas
Uploaded: 2020-03-10T12:00:00
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Diese Arbeit wurde vom DoD-Zuschuss des Verteidigungsministeriums AZ180075 unterstützt. Stefan Stamm dankt Jacqueline Noonan Endowment. Unterstützt wurde Anna Pawluchin vom DAAD, dem deutschen akademischen Austauschprogramm, Justin R. Welden erhielt den Max Steckler Award der University of Kentucky.

1. Konstruktion der Konstrukte
<ol><li>Verwenden Sie den UCSC-Genombrowser24, um sich wiederholende Elemente zu identifizieren, die für die kreisförmige RNA-Bildung erforderlich sind, und integrieren Sie sie in die Konstrukte. Wichtig ist, dass Primer für die Verstärkung außerhalb der sich wiederholenden Elemente liegen müssen.</li>
	<li>Fügen Sie die kreisförmige RNA-Sequenz(Supplemental Abbildung 1 ist eine Testsequenz) in <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBla...

<ol>
	<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+elements:+know+the+SINEs.">Alu elements: know the SINEs.</a> Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).</li><li>Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Alu+editability.">Genome-wide analysis of Alu editability.</a> Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).</li><li>Levanon, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+abundant+A-to-I+editing+sites+in+the+human+transcriptome.">Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome.</a> Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+Skipping+Is+Correlated+with+Exon+Circularization.">Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+translation+of+circular+RNAs+driven+by+N(6)-methyladenosine.">Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine.</a> Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).</li><li>Abe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+Circle+Translation+of+Circular+RNA+in+Living+Human+Cells.">Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells.</a> Scientific Reports. 5, 16435 (2015).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).</li><li>Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Survival+Motor+Neuron+genes+generate+a+vast+repertoire+of+circular+RNAs.">Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).</li><li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing.">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).</li><li>Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+exon+sequences+in+alternative+splicing+of+the+human+fibronectin+gene.">A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene.</a> Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).</li><li>Gaildrat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+splicing+reporter+minigene+assay+to+evaluate+the+effect+on+splicing+of+unclassified+genetic+variants.">Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants.</a> Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li><li>Baralle, D., Baralle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+in+action:+assessing+disease+causing+sequence+changes.">Splicing in action: assessing disease causing sequence changes.</a> Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).</li><li>Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+throughput+analysis+of+alternative+splicing+by+fluorescently+labeled+RT-PCR.">Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).</li><li>Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+strategy+identifies+cardiotonic+steroids+as+alternative+splicing+modulators.">A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).</li><li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrvinium+pamoate+changes+alternative+splicing+of+the+serotonin+receptor+2C+by+influencing+its+RNA+structure.">Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).</li><li>Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Conn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+quaking+regulates+formation+of+circRNAs.">The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs.</a> Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).</li><li>Jeck, W. R., Sharpless, N. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+control+of+Drosophila+circular+RNA+expression+by+intronic+repeats,+hnRNPs,+and+SR+proteins.">Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins.</a> Genes &amp; Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).</li><li>Starke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+circularization+requires+canonical+splice+signals.">Exon circularization requires canonical splice signals.</a> Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).</li><li>Suzuki, H., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+pre-mRNA+splicing+from+RNase+R+resistant+RNAs.">A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+alternative+back-splicing+and+alternative+splicing+landscape+of+circular+RNAs.">Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs.</a> Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).</li><li>Liang, D., Wilusz, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alternative+splicing+of+human+tau+exon+10+by+phosphorylation+of+splicing+factors.">Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).</li><li>Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+backsplicing+produces+translatable+circular+mRNAs.">Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs.</a> RNA. 21 (2), 172-179 (2015).</li><li>Yang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+GFP-Based+Reporter+to+Study+Back+Splicing+and+Translation+of+Circular+RNA.">Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+profiling+reveals+an+abundant+circHIPK3+that+regulates+cell+growth+by+sponging+multiple+miRNAs.">Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11215 (2016).</li><li>Jia, W., Xu, B., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+expression+profiles+of+mouse+ovaries+during+postnatal+development+and+the+function+of+circular+RNA+epidermal+growth+factor+receptor+in+granulosa+cells.">Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells.</a> Metabolism. 85, 192-204 (2018).</li><li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Output+of+Protein-Coding+Genes+Shifts+to+Circular+RNAs+When+the+Pre-mRNA+Processing+Machinery+Is+Limiting.">The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting.</a> Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).</li><li>Legnini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circ-ZNF609+Is+a+Circular+RNA+that+Can+Be+Translated+and+Functions+in+Myogenesis.">Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis.</a> Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+circRNA+Biogenesis+and+Function+with+NF90/NF110+in+Viral+Infection.">Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection.</a> Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biogenesis+of+Nascent+Circular+RNAs.">The Biogenesis of Nascent Circular RNAs.</a> Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).</li></ol>

Im Allgemeinen sind kreisförmige RNAs niedrig reichlich1, was die Untersuchung ihrer Funktion und Bildung erschwert. Ähnlich wie bei linearen RNAs13ermöglicht die Verwendung von Reporter-Minigenes die Identifizierung von cis und trans-wirkenden Faktoren, die die Bildung von kreisförmigen RNAs regulieren. So erzeugt dieser Ansatz Hypothesen, die mit den endogene Genen weiter getestet werden können.
Der wichtigste Schritt ist das Design des Re...

Zirkuläre RNAs Circular RNAs (circRNAs) sind kovalent geschlossene einsträngige RNAs, die in den meisten Organismen exprimiert werden. Sie werden erzeugt, indem sie eine nachgelagerte 5' Spleißstelle zu einem vorgelagerten 3' Spleißstandort verbinden, ein Prozess, der als Back-Spleicing bezeichnet wird (Abbildung 1A)1. Sequenzen in der Pre-mRNA, die eine Basis komplementär wie 30-40 nt aufweisen, bringen Back-Splice-Sites in die richtige Ausrichtung für die zirkRNA-Bildung2. Beim Menschen bilden Alu-Elemente 1, die etwa 11% des Genoms3darstellen, aufgrund ihrer Selbstkomplementärität4,5 umfangreiche doppelsträngige RNA-Strukturen in pre-mRNA und fördern damit die Bildung von CircRNAs1.
Derzeit wurden drei Hauptfunktionen von circRNAs beschrieben. Einige circRNAs binden microRNAs (miRNAs) und wirken durch Sequestrierung wie miRNA Schwämme6. CircRNAs wurden in die transkriptionelle und posttranskriptionelle Regulierung, durch Wettbewerb mit linearer Spleißung7 oder Modulation der Transkriptionsfaktoraktivität8verwickelt. Schließlich enthalten circRNAs kurze offene Leserahmen und Grundsatzstudien zeigen, dass sie9,10übersetzt werden können. Die Funktion der meisten circRNAs bleibt jedoch rätselhaft. Die meisten zirkulären RNAs wurden mit den Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation11erkannt. Detaillierte Analysen einzelner Gene mit gezielten RT-PCR-Ansätzen zeigen, dass eine große Anzahl von kreisförmigen RNAs noch entdeckt werden muss12.
Einsatz von Reportergenen zur Analyse der Pre-mRNA-Verarbeitung Die Analyse von mRNA, die von DNA-Reporterkonstrukten abgeleitet wurde, die in Zellen transfiziert werden, ist eine etablierte Methode zur Untersuchung alternativer Pre-mRNA-Spleißungen, die auf kreisförmige RNAs angewendet werden können. Im Allgemeinen werden das alternative Exon, seine umgebenden Introns und konstitutive Exons verstärkt und zu einem eukaryotischen Expressionsvektor geklont. Häufig werden die Introns verkürzt. Die Konstrukte werden in eukaryotische Zellen transfiziert und in der Regel von RT-PCR13,14analysiert. Dieser Ansatz wurde ausgiebig verwendet, um regulatorische Spleißstellen und transacting Faktoren in Co-Transfektionsexperimenten13,15,16,17,18zu kartieren. Darüber hinaus ermöglichte die Erzeugung von proteinexstigen Minigenen das Screening von Substanzen, die alternative Spleißen ändern19,20.
Die Methode wurde auf zirkuläre RNAs angewendet. Derzeit sind mindestens 12 Minigen-Rückgrate in der Literatur beschrieben und in Tabelle 1zusammengefasst. Mit Ausnahme des tRNA-basierten Expressionssystems21,22sind sie alle von Polymerase-II-Promotoren abhängig. Hier beschreiben wir eine Methode zur Generierung menschlicher Reporter-Minigene, um cis und trans-acting Faktoren zu bestimmen, die an der Erzeugung von kreisförmigen RNAs beteiligt sind. Eine Übersicht über die Methode anhand von Sequenzen eines veröffentlichten Reportergens23 ist in Abbildung 1dargestellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(PEI) Hydrochloride</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Builder tool</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark Reader Transilluminator.</td>
			<td>Clare Chemical Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymatic DNA assembly kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel and PCR cleanup kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyco Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 cloning site</td>
			<td>Polycloning site</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf" target="_blank">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Q5 DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 2</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1725310</td>
			<td>Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 2</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>206402</td>
			<td>Qiagen long range polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12183025</td>
			<td>Ambion by Life Technologies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td>Epicenter/Lucigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040H</td>
			<td>NEB stable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cloning bacteria</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>NEB5-alpha competent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web tool to design primers</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web-based temperature calculations</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of alu element containing minigenes to analyze circular rnas

Neben linearen mRNAs erzeugen viele eukaryotische Gene kreisförmige RNAs. Die meisten kreisförmigen RNAs werden generiert, indem eine 5' Spleißstelle mit einer vorgelagerten 3' Spleißstelle innerhalb einer Pre-mRNA, einem Prozess, der als Back-Spleicing bezeichnet wird, angeschlossen wird. Diese Zirkularisierung wird wahrscheinlich durch sekundäre Strukturen in der Pre-mRNA unterstützt, die die Spleißstellen in die Nähe bringen. In menschlichen Genen werden Alu-Elemente gedacht, um diese sekundären RNA-Strukturen zu fördern, da Alu-Elemente reichlich vorhanden sind und Basiskomplementaritäten miteinander aufweisen, wenn sie in entgegengesetzten Richtungen in der Pre-mRNA vorhanden sind. Hier beschreiben wir die Erzeugung und Analyse großer Alu-Elemente, die Reportergene enthalten, die kreisförmige RNAs bilden. Durch die Optimierung von Klonprotokollen können Reportergene mit bis zu 20 kb Insert-Länge erzeugt werden. Ihre Analyse in Co-Transfektionsexperimenten ermöglicht die Identifizierung regulatorischer Faktoren. So kann diese Methode RNA-Sequenzen und zelluläre Komponenten identifizieren, die an der kreisförmigen RNA-Bildung beteiligt sind.

Reportergene ermöglichen die Bestimmung regulatorischer Faktoren, die die zirkuläre RNA-Bildung beeinflussen. Diese Reportergene sind jedoch groß und enthalten sich wiederholende Elemente, die DNA-Konstrukte oft instabil machen. Aufgrund ihrer großen Größe ist es oft notwendig, Teile der Introns zu löschen, was durch die Verstärkung genomischer Teile mit den Exons und kleineren flankierenden intronischen Teilen erreicht wird. Diese DNA-Stücke werden enzymatisch zusammengesetzt, so dass Enzyme ohne Einschränkung...

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Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Wir klonen und analysieren Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen. Diese Reportergene sind größer als Konstrukte, um lineare Spleißungen zu analysieren und Alu-Elemente zu enthalten. Zur Untersuchung der kreisförmigen RNAs werden die Konstrukte in Zellen transfiziert und die resultierende RNA wird mit RT-PCR nach Entfernung linearer RNA analysiert.

Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es dem Benutzer ermöglicht, ein genomisches Expressionssystem zu erzeugen, das alternatives Spleißen durchlaufen kann und in diesem Fall kreisförmige RNAs bildet, die auf ihre Funktion und Krankheitsassoziation getestet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie anderen den Weg ebnen wird, dieses Protokoll in der Molekularbiologie und beim Klonen zu verwenden, wenn sie alternatives Spleißen in der kreisförmigen RNA-Bildung und -Funktion untersucht. Mein Rat an jemanden, der diese Technik zum ersten Mal versucht, wäre, die PCR-Bedingungen zu optimieren.Führen Sie Gradienten oder führen Sie Touchdown-PCR mit unterschiedlichen Glühtemperaturen und Verlängerungszeiten durch. Normalerweise verlängern längere Fragmente über sechs KB eine KB pro Zyklus und verschiedene Glühtemperaturen müssten auf die beste Verstärkung getestet werden. Die Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie den Benutzern eine bessere visuelle Darstellung der schwierigeren Aspekte des Verfahrens, insbesondere der Generierung von Primern, geben wird.Um dieses Verfahren zu beginnen, laden Sie den UCSC Genome Browser und verwenden Sie ihn, um sich wiederholende Elemente zu identifizieren, die für die kreisförmige RNA-Bildung notwendig sind, und integrieren Sie sie in die Konstrukte. Wichtig ist, dass Primer für die Verstärkung außerhalb der sich wiederholenden Elemente liegen müssen. Fügen Sie die kreisförmige RNA-Sequenz in die menschliche BLAT-Suche ein und wählen Sie den richtigen Organismus aus.Senden Sie die Sequenz, wechseln Sie zur Browseransicht, und zoomen Sie 1,5 Timer oder ggf.. Als Nächstes bewegen Sie sich mit der Maus über die sich wiederholenden Elemente, um ihren Subtyp in einem unverankerten Fenster zu identifizieren. Alu-Elemente befinden sich in der Sinuslinie.Verwenden Sie die Schaltfläche "Standardspuren" unter dem Fenster, um den Browser zurückzusetzen, wenn ein falsches Bild abgerufen wird. Gehen Sie zuerst zu sehen, DNA auf der obersten Zeile des USCS Genome Browser, um die DNA-Sequenz im Fenster gezeigt herunterladen. Wählen Sie in der Formatierungsoption Sequenzierung erweiterte Groß-/Kleinformatoptionen aus.Wählen Sie die Standardgroß-Kleinschreibung als niedriger aus, und wählen Sie die Umschaltgroßteilfürgroßung für NCBI RefSeq aus. Wählen Sie unterstreichen und fett und kursiv für RepeatMasker. Klicken Sie auf Absenden.Es wird Exons als Großbuchstaben und Introns als Kleinbuchstaben geben. Überprüfen Sie die Exon-/Intron-Grenzen. Wenn der Browser die umgekehrte Ergänzung anzeigt, gehen Sie zurück und wählen Sie das umgekehrte Komplementfeld aus, bis die richtigen Exon-/Intron-Ränder angezeigt werden.Kopieren Sie als Nächstes die Datei mit der richtigen Ausrichtung in ein Textverarbeitungsdokument, und markieren Sie die Exons. Wählen Sie die zu verstärkenden Fragmente aus, um sicherzustellen, dass das Intron nicht in einem sich wiederholenden Bereich beginnt oder endet, da Primer in diesen Regionen bestimmte Sequenzen nicht verstärken. Verwenden Sie zunächst ein Webtool, um die Primer für das Klonen zu entwerfen.Fügen Sie für die Vektorsequenz die Einfügestelle als letztes Nukleotid hinzu, und fügen Sie anschließend die Fragmente hinzu. Da die Vektornummerierung nicht mit einer bestimmten Einfügestelle beginnt, befindet sich die Einfügestelle im Vektor und das nachgeschaltete Teil wird vor der Upstream-Sequenz eingelagert. Passen Sie Primer an, wenn ihre Schmelzpunkte mehr als vier Grad Celsius voneinander entfernt sind und nicht in der Verstärkung wirken.In dieser Studie werden Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen, geklont und analysiert. Optimierte PCR-Produkte werden auf einem 1%Agarose-Gel getrennt, das 1X Gel grün enthält. Die einzelnen Bänder stellen die PCR-Produkte dar, die in der enzymatischen DNA-Montage verwendet werden.Diese Bänder werden dann aus dem Gel herausgeschnitten und gereinigt. Das gereinigte PCR-Produkt läuft nicht der erwarteten Größe mit Gelgrün, so dass die Produkte auch auf einem 1%Agarose-Gel getrennt werden, das anschließend mit Ethidiumbromid gefärbt wird, um sicherzustellen, dass die Produkte die richtige Größe haben. Legen Sie zunächst ein enzymatisches DNA-Montageset vor.Kombinieren Sie den Vektor und fügt in einem Molverhältnis von eins zu zwei. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter DNA-Montage-Master-Mix hinzu. Inkubieren Sie Proben für 60 Minuten bei 50 Grad.Während der Inkubation kompetente Zellen auf Eis auftauen. Die Zellen sollten ein Volumen von 50 Mikrolitern haben. Als nächstes transformieren Sie kompetente Zellen mit der Gesamtmontagereaktion.Fügen Sie zwei Mikroliter des gekühlten, zusammengebauten Produkts zu den zuständigen Zellen hinzu. Mischen Sie, indem Sie das Rohr vier- bis fünfmal sanft streichen. Wirbel nicht.Die Mischung 30 Minuten auf Eis legen. Hitze schockieren die Mischung bei 42 Grad Celsius für 30 Sekunden. Dann legen Sie es wieder auf Eis für zwei Minuten.Danach 950 Mikroliter Raumtemperatur-SOC-Medien in die Röhre geben. Bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten inkubieren, während bei 300 RPM geschüttelt wird. Während dieser Inkubation zwei Selektionsplatten, die das entsprechende Antibiotikum enthalten, warm.Zentrifugieren Sie nach der Inkubation das Reaktionsrohr 30 Sekunden lang bei 10.000 g, um die Zellen zu pellet enzieren und 25 % der Zellen auf einer Selektionsplatte und 75 % auf der anderen zu versenken. Bebrüte diese Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bevor Sie mit der Transfektion beginnen, überprüfen Sie Ihre DNA durch Einschränkung Digest.Hier wird ein repräsentatives Tau-Minigen, das die Exons neun bis zwölf enthält, mit Restriktionsenzymen geschnitten, die auf größere Rekombinationen hinweisen. Für die Transfektion zunächst lineares Polyethylenhydrochlorid in Wasser mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter bei pH 2 auflösen. Verwenden Sie Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf bis zu sieben zu bringen und sterile Filter die Lösung mit einem 0,22 Mikrometer Filter.Bewahren Sie die Lösung bei vier Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit ist. Dann teilen Sie die Zellen in die Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte und lassen Sie sie über Nacht bei DMEM-Medien mit 10%FBS wachsen. Am nächsten Tag aliquot ein Mikrogramm des gemeldeten Gens in einer sterilen Röhre und fügen Sie 200 Mikroliter steril gefiltertes 150 Millimolar Natriumchlorid hinzu.Mix durch Wirbel. Als nächstes fügen Sie die Polyethylenimin-Lösung zu diesem Gemisch im Verhältnis von drei Mikroliter Polyethylenimin für jedes Mikrogramm DNA hinzu. Zentrifuge kurz, um Proben an der Unterseite des Rohres zu sammeln.Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Fügen Sie es dann direkt zu HEK293-Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Verwenden Sie am nächsten Tag ein RNA-Isolationskit, um die RNA für RT-PCR zu isolieren. cDNA aus zwei Proben aus menschlichen Hirngeweben wird mit kreisförmigen RNA-Primern circ tau exon 1210 reverse und circ tau exon 1211 nach vorne verstärkt. Während das erwartete Band, das tau-zirkuläre RNA entspricht, gesehen wird, sind die anderen starken Bänder Artefakte, die nicht mit dem menschlichen Genom übereinstimmten.Dieses Experiment wird mit identischen PCR-Bedingungen wiederholt, aber die umgekehrte Transkription wurde nur mit dem circ tau exon 1210 Reverse Primer durchgeführt. Nur das erwartete Band wird durch Sequenzierung verstärkt und validiert. Die RNA wird dann mit RNase R behandelt, die lineare RNA entfernt.Die kreisförmige RNA ist nach der Behandlung nachweisbar, während lineare RNA kein nachweisbares Signal mehr gibt. RNA wird 24 Stunden nach der Transfektion isoliert und mit RT-PCR analysiert. Die Verstärkung der linearen Tau mRNA zeigt zwei Bänder durch alternatives Spleißen von Exon 10.Ihr Verhältnis ändert sich zum Überausdruck von Spleißfaktoren. Die Verstärkung der kreisförmigen 1210 tau RNA zeigt die Abhängigkeit der tau circ RNA Expression von der Expression einiger Spleißfaktoren, insbesondere der Cdc2-ähnlichen Kinase CLK2 und des SR-Proteins 9G8. Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist das Design und die Lage der Primer beim Bau eines Minigens.Die Grundierung sollte nicht in sich wiederholenden Elementen liegen und muss unter verschiedenen Bedingungen optimiert werden, je nachdem, ob das Fragment verstärkt wird. Nach diesem Verfahren werden andere Methoden, die ausgeführt werden können, die Funktion der zirkulären RNAs testen. Die Benutzer können die Übersetzung oder Sequestrierung von Proteinen testen, um eine Funktion für die spezifische kreisförmige RNA zu identifizieren, an der der Benutzer interessiert ist.Diese Technik ebnete den Weg, um genomische Fragmente in einem Minigensystem zu nutzen, das die kreisförmigen RNAs überausdrücken kann, so dass der Benutzer ihre Funktion und in einigen Aspekten ihre Assoziation mit Krankheiten testen und identifizieren kann. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf mögliche Therapien und Diagnostika einer bestimmten Krankheit, zum Beispiel Tauopathien, neurodegenerative Erkrankungen im Zusammenhang mit Tau-Pathologie. Wir haben entdeckt, dass das mikrotubulieassoziierte Protein Tau, bekannt als MAPT, kreisförmige RNAs erzeugt, von denen wir glauben, dass sie zur Krankheitspathologie beitragen, und diese Methode ermöglicht es uns, diese kreisförmigen RNAs vollständig zu untersuchen und ihre Funktion und Beziehung zu Krankheiten zu identifizieren.Diese Methode könnte Einen Einblick in ein besseres Verständnis von kreisförmigen RNAs, ihre Funktionen und die Rolle, die sie bei bestimmten Krankheiten spielen können, geben. Diese Methode kann beim Klonen anderer Minigene angewendet werden, die kreisförmige RNAs über Arten hinweg ausdrücken, wo sie Einblicke in ihre Funktion geben können. Die Amplifikation der PCR-Produkte erweist sich als die schwierigste mit langen Fragmenten, die aus der genomischen DNA verstärkt werden, zusammen mit mehreren sich wiederholenden Elementen innerhalb des Fragments.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.

We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.

Nass- und Trockenlabortechniken Die Kombination der Kristallisation von Large Coiled-Coil-Proteine ​​enthalten, zu Führer

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Forschung

Biochemie

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

Gleichzeitige Messung von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH Produktion durch Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. The ability to readily detect the formation of these fibers under various experimental conditions is essential for understanding their potential function. Many methods have been used to detect the fibers, but not without some drawbacks. For example, electron microscopy (EM), or staining with Congo Red or Thioflavin T often requires purification of the fibers. On the other hand, semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (SDD-AGE) allows detection of the SDS-resistant amyloid-like fibers in the cell extracts without purification. In addition, it allows the comparison of the size difference of the fibers. More importantly, it can be used to identify specific proteins within the fibers by Western blotting. It is less time consuming and more easily accessible to a wider number of labs. SDD-AGE results often show variable degree of heterogeneity. It raises the question whether part of the heterogeneity results from the dissociation of the protein complex during the electrophoresis in the presence of SDS. For this reason, we have employed a second dimension of SDD-AGE to determine if the size heterogeneity seen in SDD-AGE is truly a result of fiber heterogeneity in vivo and not a result of either degradation or dissociation of some of the proteins during electrophoresis. This method allows fast, qualitative confirmation that the amyloid or amyloid-like fibers are not partially dissociating during the SDD-AGE process.

Here we use two-dimensional semi-denaturing agarose gel electrophoresis to confirm the presence of amyloid-like fibers of heterogeneous size and exclude the possibility that the size heterogeneity is due to dissociation of the amyloid fibers during the gel running process.

Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Großtechnische Produktion von rekombinanten RNAs auf einem kreisförmigen Gerüst mit einem Viroid-abgeleitete System bei Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Einsatz der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a multitude of samples. It has been extensively used in many research areas and achieved industrial application in fields such as human diagnostics and trait selection in crops of genetically modified organisms (GMO) crops. However, qPCR is not an error-proof technique. Mixing all reagents into a single master mix subsequently distributed onto 96 wells of a regular qPCR plate might lead to operator mistakes such as incorrect mixing of reagents or inaccurate dispensing into the wells. Here, a technique called gelification is presented, whereby most of the water present in the master mix is substituted by reagents that form a sol-gel mixture when submitted to a vacuum. As a result, qPCR reagents are effectively preserved for a few weeks at room temperature or a few months at 2-8 oC. Details of preparing each solution are shown here along with the expected aspect of a gelified reaction designed to detect&#160;T. cruzi satellite DNA (satDNA). A similar procedure can be applied to detect other organisms. Starting a gelified qPCR run is as simple as removing the plate from the refrigerator, adding the samples to their respective wells, and starting the run, thus decreasing the setup time of a full-plate reaction to the time it takes to load the samples. Additionally, gelified PCR reactions can be produced and controlled for quality in batches, saving time and avoiding common operator mistakes while running routine PCR reactions.

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

The present work describes the steps for producing ready-to-use qPCR for T. cruzi DNA detection that can be pre-loaded on the reaction vessel and stored in the refrigerator for several months.

Gebrauchsfertige qPCR zum Nachweis von DNA aus Trypanosoma cruzi oder anderen pathogenen Organismen

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

Formulierung und Charakterisierung bioaktiver Wirkstoffe, die Nanoscheiben enthalten

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...