Name: use of alu element containing minigenes to analyze circular rnas
Uploaded: 2020-03-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי משרד ההגנה משרד הביטחון מענק AZ180075. סטפן סטאם, תודה לז של ז'קלין נונן אנה פאולוצ'ין נתמכת על ידי ה-DAAD, התוכנית האקדמית הגרמנית, ג'סטין R. Welden היה מקבל את הפרס של אוניברסיטת קנטקי מקס סטקלר.

1. עיצוב המבנים
<ol><li>השתמש בדפדפן UCSC הגנום24 לזהות אלמנטים חוזרים הדרושים עבור היווצרות RNA מעגלי ולשלב אותם במבנים. חשוב ביותר, התחל הגברה של הצורך להיות מחוץ ליסודות החוזרים.</li>
	<li>הדבקת רצף ה-RNA המעגלי (איור משלים 1 הוא רצף מבחנים) לתוך <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start...

<ol>
	<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+elements:+know+the+SINEs.">Alu elements: know the SINEs.</a> Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).</li><li>Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Alu+editability.">Genome-wide analysis of Alu editability.</a> Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).</li><li>Levanon, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+abundant+A-to-I+editing+sites+in+the+human+transcriptome.">Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome.</a> Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+Skipping+Is+Correlated+with+Exon+Circularization.">Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+translation+of+circular+RNAs+driven+by+N(6)-methyladenosine.">Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine.</a> Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).</li><li>Abe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+Circle+Translation+of+Circular+RNA+in+Living+Human+Cells.">Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells.</a> Scientific Reports. 5, 16435 (2015).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).</li><li>Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Survival+Motor+Neuron+genes+generate+a+vast+repertoire+of+circular+RNAs.">Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).</li><li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing.">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).</li><li>Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+exon+sequences+in+alternative+splicing+of+the+human+fibronectin+gene.">A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene.</a> Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).</li><li>Gaildrat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+splicing+reporter+minigene+assay+to+evaluate+the+effect+on+splicing+of+unclassified+genetic+variants.">Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants.</a> Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li><li>Baralle, D., Baralle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+in+action:+assessing+disease+causing+sequence+changes.">Splicing in action: assessing disease causing sequence changes.</a> Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).</li><li>Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+throughput+analysis+of+alternative+splicing+by+fluorescently+labeled+RT-PCR.">Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).</li><li>Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+strategy+identifies+cardiotonic+steroids+as+alternative+splicing+modulators.">A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).</li><li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrvinium+pamoate+changes+alternative+splicing+of+the+serotonin+receptor+2C+by+influencing+its+RNA+structure.">Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).</li><li>Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+expressing+circular+RNAs+via+tRNA+splicing.">Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-7 (2017).</li><li>Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Expressing+and+Imaging+Abundant,+Stable,+Circular+RNAs+In+Vivo+Using+tRNA+Splicing.">A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing.</a> Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).</li><li>Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+MAPT+locus+generates+circular+RNAs.">The human MAPT locus generates circular RNAs.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).</li><li>Casper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+Genome+Browser+database:+2018+update.">The UCSC Genome Browser database: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).</li><li>Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+plasmid+vectors+expressing+FLAG-tagged+proteins+under+the+regulation+of+human+elongation+factor-1alpha+promoter+using+Gibson+assembly.">Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+to+engineer+DNA+polymerases+for+enhanced+processivity+and+improved+performance+in+vitro.">A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Conn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+quaking+regulates+formation+of+circRNAs.">The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs.</a> Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).</li><li>Jeck, W. R., Sharpless, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+characterizing+circular+RNAs.">Detecting and characterizing circular RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).</li><li>Pamudurti, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+CircRNAs.">Translation of CircRNAs.</a> Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).</li><li>Kramer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+control+of+Drosophila+circular+RNA+expression+by+intronic+repeats,+hnRNPs,+and+SR+proteins.">Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins.</a> Genes &amp; Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).</li><li>Starke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+circularization+requires+canonical+splice+signals.">Exon circularization requires canonical splice signals.</a> Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).</li><li>Suzuki, H., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+pre-mRNA+splicing+from+RNase+R+resistant+RNAs.">A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+alternative+back-splicing+and+alternative+splicing+landscape+of+circular+RNAs.">Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs.</a> Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).</li><li>Liang, D., Wilusz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+intronic+repeat+sequences+facilitate+circular+RNA+production.">Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production.</a> Genes &amp; Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).</li><li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+physiology+and+pathology.">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).</li><li>Fejes-Toth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+processing+generates+a+diversity+of+5'-modified+long+and+short+RNAs.">Post-transcriptional processing generates a diversity of 5'-modified long and short RNAs.</a> Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).</li><li>Gao, Q. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+tau+exon+10,+whose+missplicing+causes+frontotemporal+dementia.">Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia.</a> Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).</li><li>Hartmann, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alternative+splicing+of+human+tau+exon+10+by+phosphorylation+of+splicing+factors.">Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).</li><li>Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+backsplicing+produces+translatable+circular+mRNAs.">Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs.</a> RNA. 21 (2), 172-179 (2015).</li><li>Yang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+GFP-Based+Reporter+to+Study+Back+Splicing+and+Translation+of+Circular+RNA.">Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+profiling+reveals+an+abundant+circHIPK3+that+regulates+cell+growth+by+sponging+multiple+miRNAs.">Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11215 (2016).</li><li>Jia, W., Xu, B., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+expression+profiles+of+mouse+ovaries+during+postnatal+development+and+the+function+of+circular+RNA+epidermal+growth+factor+receptor+in+granulosa+cells.">Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells.</a> Metabolism. 85, 192-204 (2018).</li><li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Output+of+Protein-Coding+Genes+Shifts+to+Circular+RNAs+When+the+Pre-mRNA+Processing+Machinery+Is+Limiting.">The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting.</a> Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).</li><li>Legnini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circ-ZNF609+Is+a+Circular+RNA+that+Can+Be+Translated+and+Functions+in+Myogenesis.">Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis.</a> Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+circRNA+Biogenesis+and+Function+with+NF90/NF110+in+Viral+Infection.">Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection.</a> Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biogenesis+of+Nascent+Circular+RNAs.">The Biogenesis of Nascent Circular RNAs.</a> Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).</li></ol>

באופן כללי, RNAs מעגלית נמוך1שופע, אשר מסבך את המחקר של התפקוד שלהם ואת המבנה. בדומה RNAs ליניארי13, השימוש של מיניגנים הכתב מאפשר זיהוי של העמים וגורמים טרנס משחק המסדירים את היווצרות rnas מעגלית. לפיכך, גישה זו יוצרת השערות שניתן לבחון עוד יותר באמצעות הגנים האנדוגניים....

RNAs מעגלית RNAs מעגלית (circRNAs) הם סגורים בודד שנתקע יחיד RNAs אשר מבוטא ברוב האורגניזמים. הם מופקים על ידי הצטרפות במטה 5 ' אחוי אתר לאתר במעלה 3 ' אחוי, תהליך הנקרא שחבור חזרה (איור 1א)1. רצפים של pre-mRNA כי התערוכה בסיס משלימה קצר כמו 30-40 nt להביא החזרה האתר ליישור הנכון עבור מערך circRNA2. בבני אדם, Alu אלמנטס1, המייצג כ -11% של הגנום3, טופס נרחב כפול תקוע מבנים RNA ב pre-mrna בשל העצמיות העצמית שלהם4,5 ובכך לקדם את היווצרות circrnas1.
כיום תוארו שלוש פונקציות עיקריות של circRNAs. חלק מהמעגלי האיגוד מסוג circRNAs (miRNAs) ובאמצעות קיבוע על לפעול כמו ספוגים Mirnas6. באמצעות תחרות עם שחבור ליניארי7 או אפנון של פעילות שעתוק8, היתה מעורב ביניהם מעורבים. לבסוף, מכילים circrnas מסגרות קריאה פתוחות קצרות והוכחת מחקרים עקרוניים מראים כי ניתן לתרגמו9,10. עם זאת, התפקוד של רוב הcircrnas נשאר באופן חידתי. רוב RNAs מעגלית זוהו באמצעות שיטות רצף הדור הבא11. ניתוחים מפורטים של גנים בודדים באמצעות ממוקדות RT-PCR גישות לגלות כי מספר גדול של RNAs מעגלית נשאר להתגלות12.
שימוש בגנים של כתבת לניתוח עיבוד טרום-mRNA ניתוח mRNA נגזר המבנה כתב DNA בנייה לתוך תאים היא שיטה מבוססת היטב כדי ללמוד אלטרנטיבה טרום mRNA שחבור, אשר ניתן להחיל על RNAs מעגלית. באופן כללי, האקסוקה החלופית, האינטרוטונים המקיפים אותה, והרחבות הקונסטיטוטיביות מושוכגות לתוך וקטור ביטוי של איקריוטית. לעתים קרובות, האינטרונים מקוצרים. המבנים מנותחים לתאי איקריוטית ומנותח בדרך כלל על ידי RT-PCR13,14. גישה זו הייתה בשימוש נרחב כדי למפות את האזורים הרגולטורים וגורמי משחק בניסויים שיתוף פעולה13,15,16,17,18. בנוסף, הדור של ביטוי חלבון מיני גנים מותר להקרנה של חומרים המשנים שחבור חלופיים19,20.
השיטה הוחלה על RNAs מעגלית. כיום, לפחות 12 מיניגנים לאחור תוארו בספרות ומסוכמים בטבלה 1. למעט מערכת trna ביטוי מבוסס21,22, הם כולם תלויים פולימראז השני היזמים. כאן, אנו מתארים שיטה ליצור מיני העיתונאי האנושי כדי לקבוע את הגורמים העמים והטרנס משחק מעורב בדור של RNAs מעגלית. מבט כולל על השיטה באמצעות רצפים של העיתונאי שפורסם גן23 מוצג באיור 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(PEI) Hydrochloride</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Builder tool</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark Reader Transilluminator.</td>
			<td>Clare Chemical Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymatic DNA assembly kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel and PCR cleanup kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyco Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 cloning site</td>
			<td>Polycloning site</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf" target="_blank">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Q5 DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 2</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1725310</td>
			<td>Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 2</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>206402</td>
			<td>Qiagen long range polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12183025</td>
			<td>Ambion by Life Technologies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td>Epicenter/Lucigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040H</td>
			<td>NEB stable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cloning bacteria</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>NEB5-alpha competent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web tool to design primers</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web-based temperature calculations</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of alu element containing minigenes to analyze circular rnas

בנוסף mrnas ליניארי, הרבה גנים איקריוטית ליצור rnas מעגלית. מרבית ה-RNAs המעגלי מופקים על-ידי הצטרפות לאתר של 5 ' אחוי עם אתר אחוי במעלה 3 ' בתוך מקדם-mRNA, תהליך הנקרא שחבור חזרה. מעגליות זה עשוי לסייע על ידי מבנים משניים ב-pre-mRNA המביאים את האחוטים לקרבת מקומות. בגנים האנושיים, alu אלמנטס נחשבים לקידום אלה מבנים RNA משני, כמו alu אלמנטס הם שופע בסיס התצוגה משלימה אחד עם השני כאשר נוכח הכיוונים הנגדיים ב pre-mrna. כאן, אנו מתארים את הדור ואת הניתוח של גדול, Alu אלמנט המכיל גנים עיתונאי היוצרים rnas מעגלית. באמצעות אופטימיזציה של פרוטוקולי שיבוט, גנים עיתונאי עם עד 20 kb אורך להוסיף ניתן ליצור. הניתוח שלהם בניסויים מאפשר זיהוי של גורמי רגולציה. כך, שיטה זו יכולה לזהות רצפי RNA ורכיבים סלולריים המעורבים במערך RNA מעגלי.

גנים עיתונאי לאפשר נחישות של גורמים הרגולציה המשפיעים על היווצרות RNA מעגלי. עם זאת, גנים כתבת אלה הם גדולים ומכילים אלמנטים חוזרים כי לעתים קרובות לעשות בנייה DNA לא יציב. בשל גודלם הגדול, לעתים קרובות יש צורך למחוק חלקים של introns, אשר מושגת על ידי הגברה של חתיכות גנומית המכילה exons וחלקים קטנים ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs at JoVE.com

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

אנחנו לשכפל ולנתח גנים עיתונאי יצירת RNAs מעגלית. גנים כתבת אלה גדולים יותר מאשר בנייה כדי לנתח שחבור ליניארי ולהכיל Alu אלמנטס. כדי לחקור את RNAs מעגלית, המבנים הם מנותחים לתוך תאים וכתוצאה מכך RNA מנותח באמצעות RT-PCR לאחר הסרת RNA ליניארי.

שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שהוא מאפשר למשתמש ליצור מערכת ביטוי גנומי שיכולה לעבור ש splicing חלופי במקרה זה טופס RNAs מעגלי שניתן לבדוק עבור הפונקציה שלהם שיוך המחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא תסלול את הדרך לאחרים להשתמש בפרוטוקול זה בביולוגיה מולקולרית ובשכפול כאשר לומדים ש splicing חלופי בהיווצרות RNA מעגלית ותפקוד. העצה שלי למישהו מנסה טכניקה זו בפעם הראשונה יהיה לייעל את תנאי PCR.הפעל מעברי צבע או בצע PCR טאצ'דאון עם טמפרטורות חישול שונות ושהיות הרחבה. בדרך כלל שברים ארוכים יותר מעל שישה KB יאריכו KB אחד לכל מחזור ויהיה צורך לבדוק טמפרטורות חישול שונות להגברה הטובה ביותר. הדגמה של שיטה זו היא קריטית כי זה ייתן למשתמשים ייצוג חזותי טוב יותר של ההיבטים הקשים יותר של ההליך במיוחד הדור של פריימרים.כדי להתחיל בהליך זה, לטעון את דפדפן הגנום UCSC ולהשתמש בו כדי לזהות אלמנטים חוזרים ונשנים הדרושים להיווצרות RNA מעגלית ולשלב אותם לתוך המבנים. חשוב לציין, פריימרים להגברה צריכים להיות מחוץ ליסודות החוזרים על עצמם. הדבק את רצף ה- RNA המעגלי בחיפוש BLAT האנושי ובחר את האורגניזם הנכון.שלח את הרצף, עבור לתצוגת הדפדפן והגדל את 1.5 תזמנות הזמן או לפי הצורך. לאחר מכן, עכבר מעל האלמנטים החוזרים על עצמם כדי לזהות את תת-הטיפוס שלהם בחלון צף. אלמנטים אלו נמצאים בקו סינוס.השתמש בלחצן רצועות ברירת המחדל מתחת לחלון כדי לאפס את הדפדפן אם מתקבלת תמונה שגויה. ראשית ללכת לתצוגה, DNA בשורה העליונה של דפדפן הגנום USCS כדי להוריד את רצף ה-DNA המוצג בחלון. באפשרות עיצוב רצף, בחר אפשרויות רישיות/צבע מורחבות.בחר את רישיות ברירת המחדל כאותיות נמוכות ובחר החלף מצב רישיות עבור NCBI RefSeq. בחר קו תחתון ומודגש ונוטה עבור RepeatMasker. לחץ על שלח.יהיו אקסונים כאותיות רישיות ואותיות קטנות. בדוק את גבולות האקסון / intron. אם הדפדפן מציג את המשלים ההפוך, חזור אחורה ובחר בתיבת ההשלמה ההפוך עד שגבולות האקסון/אינטרון הנכונים יתוופסו.לאחר מכן, העתיקו את הקובץ בכיוון הנכון למסמך עיבוד תמלילים וסמן את האקסונים. בחר את הקטעים שיש להגביר כדי לוודא שה- intron אינו מתחיל או מסתיימים באזור שחוזר על עצמו, שכן פריימרים באזורים אלה לא יגבירו רצפים ספציפיים. כדי להתחיל, השתמש בכלי אינטרנט לעיצוב פריימרים לשכפול.עבור הרצף הווקטורי, הוסף את אתר הכניסה כנוקלאוטיד האחרון ולאחר מכן הוסף את הקטעים. מכיוון שהמספר הווקטורי אינו מתחיל באתר הכנסה נתון, אתר הכניסה בווקטור ממוקם והחלק במורד הזרם מוכנס לפני רצף הזרם במעלה הזרם. התאימו את פריימרים אם נקודות ההיתוך שלהם הן יותר מארבע מעלות זו מזו ולא עובדות בהגברה.במחקר זה, גנים עיתונאיים המייצרים RNAs מעגליים משובטים ומנותחים. מוצרי PCR ממוטבים מופרדים על ג'ל 1%agarose המכיל 1X ג'ל ירוק. הלהקות הבודדות מייצגות את מוצרי PCR שישמשו בהרכבת DNA אנזימטית.להקות אלה נחתכות מהג'ל ומטוהרות. מוצר PCR מטוהרים אינו פועל נאמן לגודל הצפוי עם ג'ל ירוק ולכן המוצרים מופרדים גם על 1% ג'ל agarose כי הוא מוכתם לאחר מכן עם ברומיד אתידיום כדי להבטיח את המוצרים הם בגודל הנכון. כדי להתחיל, להגדיר ערכת הרכבת DNA אנזימטית.שלבו את הווקטור והתוספים ביחס תוחב של 1 ל-2. לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של תערובת אב הרכבה DNA. דגימות דגירה במשך 60 דקות ב50 מעלות.להפשיר תאים מוכשרים על קרח במהלך הדגירה. תאים צריכים להיות בנפח של 50 מיקרוליטרים. לאחר מכן, המר תאים מוכשרים עם תגובת ההרכבה הכוללת.הוסף שני מיקרוליטרים של המוצר המצונן שהתאסף לתאים המוכשרים. מערבבים על ידי תנועה עדין של הצינור ארבע עד חמש פעמים. אל תבמצח.מניחים את התערובת על קרח במשך 30 דקות. חום מזעזע את התערובת ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות. ואז למקם אותו בחזרה על קרח במשך שתי דקות.לאחר מכן, להוסיף 950 microliters של טמפרטורת החדר SOC מדיה לצינור. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות תוך טלטול ב 300 סל"ד. במהלך הדגירה הזו, חם שתי צלחות בחירה המכילות את האנטיביוטיקה המתאימה.בעקבות הדגירה, צנטריפוגה צינור התגובה ב 10, 000 גרם במשך 30 שניות כדי גלולה את התאים צלחת החוצה 25% מהתאים על לוח בחירה אחד ו 75% על השני. דגירה צלחות אלה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לפני שתתחילו בהשתפה, בדקו את הדנ"א שלכם על ידי תקציר הגבלה.כאן, מיניגן טאו מייצג המכיל אקסונים תשע עד 12 נחתך עם אנזימי הגבלה המצוינים לשלול קומקומביות גדולות. עבור transfection, הראשון להמיס פוליאתילן הידרוכלוריד ליניארי במים בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר ב pH 2. השתמש נתרן הידרוקסידי להביא את ה- pH עד שבע ו סטרילי לסנן את הפתרון עם מסנן מיקרומטר 0.22.יש לאחסן את הפתרון בארבע מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש. לאחר מכן לפצל את התאים לתוך בארות של צלחת שש באר ולתת להם לגדול בן לילה במדיה DMEM המכיל 10%FBS. למחרת, aliquot מיקרוגרם אחד של הגן שדווח בצינור סטרילי ולהוסיף 200 microliters של סטרילי מסונן 150 מילימולר נתרן כלורי.מערבבים על ידי מערבולת. לאחר מכן, מוסיפים את פתרון הפוליאתילנימין לתערובת זו ביחס של שלושה מיקרוליטרים של פוליאתילנימינים עבור כל מיקרוגרם אחד של DNA. צנטריפוגה בקצרה כדי לאסוף דגימות בתחתית הצינור.הדגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן הוסיפו אותו ישירות לתאי HEK293. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.למחרת, השתמש בערכת בידוד RNA כדי לבודד את ה- RNA עבור RT-PCR. cDNA משתי דגימות הנגזרות מרקמות המוח האנושיות מוגברות עם פריימרים RNA עגולים circ טאו אקסון 1210 הפוך ו- circ tau exon 1211 קדימה. בעוד הלהקה הצפויה המתאימה ל- RNA מעגלי טאו נראית, הלהקות החזקות האחרות הן חפצים שלא תאם את הגנום האנושי.ניסוי זה חוזר על עצמו עם תנאי PCR זהים, אבל שעתוק הפוך בוצע רק עם סירק טאו אקסון 1210 פריימר הפוך. רק הרצועה הצפויה מוגברת ומותאמת באמצעות רצף. ה- RNA מטופל לאחר מכן עם RNase R שיסיר RNA ליניארי.ה- RNA המעגלי ניתן לזיהוי לאחר הטיפול ואילו RNA ליניארי אינו נותן עוד אות ניתן לגילוי. RNA מבודד 24 שעות לאחר ההמרה ונותח על ידי RT-PCR. הגברה של mRNA טאו ליניארי מראה שתי להקות בשל שחבור חלופי של exon 10.היחס ביניהם משתנה לביטוי היתר של גורמי ש splicing. הגברה של מעגלי 1210 טאו RNA מראה את התלות של ביטוי RNA tau circ על הביטוי של כמה גורמים שחבור במיוחד CDC2 כמו קינאז CLK2 ואת חלבון SR 9G8. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא העיצוב והמיקום של פריימרים בעת בניית minigene.פריימר לא צריך לשכב אלמנטים חוזרים ויהיה צורך אופטימיזציה בתנאים שונים בהתאם לרסיס להיות מוגבר. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות שניתן לבצע יהיה לבדוק את הפונקציה של RNAs מעגלי. המשתמשים יכולים לבדוק תרגום או המשך של חלבונים כדי לזהות פונקציה עבור RNA מעגלי ספציפי המשתמש מעוניין.טכניקה זו סללה את הדרך להשתמש שברים גנומיים במערכת minigene שיכולים לבטא את RNAs מעגלי המאפשר למשתמש לבדוק ולזהות את תפקידם בהיבטים מסוימים הקשר שלהם למחלות. המשמעות של טכניקה זו משתרעת על טיפולים פוטנציאליים ואבחון של מחלה מסוימת, למשל טאופתיות, מחלות ניווניות הקשורות לפתולוגיה טאו. גילינו כי טאו חלבון הקשורים microtubule, המכונה MAPT, מייצר RNAs מעגלי אשר אנו מאמינים תורמים פתולוגיה המחלה שיטה זו מאפשרת לנו ללמוד באופן מלא אלה RNAs מעגלי וזיהוי הפונקציה שלהם ואת היחס למחלות.שיטה זו יכולה לספק תובנה להבנה טובה יותר של RNAs מעגליים, מה הם הפונקציות שלהם, ואת התפקיד שהם עשויים לשחק במחלות מסוימות. ניתן ליישם שיטה זו בשכפול מיניגנים אחרים המבטאת RNAs מעגליים על פני מינים שבהם היא יכולה לספק תובנה לגבי תפקידם. הגברה של מוצרי PCR מתגלה כקשה ביותר עם שברים ארוכים המוגברים מדנ"א גנומי, יחד עם אלמנטים חוזרים ונשנים מרובים בתוך השבר.

use-of-alu-element-containing-minigenes-to-analyze-circular-rnas

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.

We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.

שילוב רטוב טכניקות מעבדה יבשות כדי להנחות את ההתגבשות של חלבונים מפותל, סליל גדולים המכיל

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

מדידה סימולטני של סופראוקסיד/מימן על-חמצני ו- NADH הייצור על ידי המכילות פלווין Dehydrogenases מיטוכונדריאלי

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. The ability to readily detect the formation of these fibers under various experimental conditions is essential for understanding their potential function. Many methods have been used to detect the fibers, but not without some drawbacks. For example, electron microscopy (EM), or staining with Congo Red or Thioflavin T often requires purification of the fibers. On the other hand, semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (SDD-AGE) allows detection of the SDS-resistant amyloid-like fibers in the cell extracts without purification. In addition, it allows the comparison of the size difference of the fibers. More importantly, it can be used to identify specific proteins within the fibers by Western blotting. It is less time consuming and more easily accessible to a wider number of labs. SDD-AGE results often show variable degree of heterogeneity. It raises the question whether part of the heterogeneity results from the dissociation of the protein complex during the electrophoresis in the presence of SDS. For this reason, we have employed a second dimension of SDD-AGE to determine if the size heterogeneity seen in SDD-AGE is truly a result of fiber heterogeneity in vivo and not a result of either degradation or dissociation of some of the proteins during electrophoresis. This method allows fast, qualitative confirmation that the amyloid or amyloid-like fibers are not partially dissociating during the SDD-AGE process.

Here we use two-dimensional semi-denaturing agarose gel electrophoresis to confirm the presence of amyloid-like fibers of heterogeneous size and exclude the possibility that the size heterogeneity is due to dissociation of the amyloid fibers during the gel running process.

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a multitude of samples. It has been extensively used in many research areas and achieved industrial application in fields such as human diagnostics and trait selection in crops of genetically modified organisms (GMO) crops. However, qPCR is not an error-proof technique. Mixing all reagents into a single master mix subsequently distributed onto 96 wells of a regular qPCR plate might lead to operator mistakes such as incorrect mixing of reagents or inaccurate dispensing into the wells. Here, a technique called gelification is presented, whereby most of the water present in the master mix is substituted by reagents that form a sol-gel mixture when submitted to a vacuum. As a result, qPCR reagents are effectively preserved for a few weeks at room temperature or a few months at 2-8 oC. Details of preparing each solution are shown here along with the expected aspect of a gelified reaction designed to detect&#160;T. cruzi satellite DNA (satDNA). A similar procedure can be applied to detect other organisms. Starting a gelified qPCR run is as simple as removing the plate from the refrigerator, adding the samples to their respective wells, and starting the run, thus decreasing the setup time of a full-plate reaction to the time it takes to load the samples. Additionally, gelified PCR reactions can be produced and controlled for quality in batches, saving time and avoiding common operator mistakes while running routine PCR reactions.

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

The present work describes the steps for producing ready-to-use qPCR for T. cruzi DNA detection that can be pre-loaded on the reaction vessel and stored in the refrigerator for several months.

qPCR מוכן לשימוש לזיהוי דנ"א מטריפנוזומה קרוזי או אורגניזמים פתוגניים אחרים

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

ניסוח ואפיון חומר ביו-אקטיבי המכיל ננודיסקים

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...