Name: use of alu element containing minigenes to analyze circular rnas
Uploaded: 2020-03-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs at JoVE.com

Эта работа была поддержана Министерством обороны Министерства обороны грант a180075. Stefan Stamm благодарит фонд Jacqueline Noonan. Анна Павлючина была поддержана DAAD, немецкая программа академического обмена, Джастин Р. Уэлден был получателем Университета Кентукки Макс Стеклер премии.

1. Проектирование конструкций
<ol><li>Используйте браузер генома UCSC24 для выявления повторяющихся элементов, необходимых для формирования круговой РНК, и их включения в конструкции. Важно отметить, что грунтовки для усиления должны быть вне повторяющихся элементов.</li>
	<li>Вст?...

<ol>
	<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs+are+abundant,+conserved,+and+associated+with+ALU+repeats.">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+sequence-mediated+exon+circularization.">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li><li>Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+elements:+know+the+SINEs.">Alu elements: know the SINEs.</a> Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).</li><li>Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+Alu+editability.">Genome-wide analysis of Alu editability.</a> Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).</li><li>Levanon, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+abundant+A-to-I+editing+sites+in+the+human+transcriptome.">Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome.</a> Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).</li><li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges.">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li><li>Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+Skipping+Is+Correlated+with+Exon+Circularization.">Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus.">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+translation+of+circular+RNAs+driven+by+N(6)-methyladenosine.">Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine.</a> Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).</li><li>Abe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+Circle+Translation+of+Circular+RNA+in+Living+Human+Cells.">Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells.</a> Scientific Reports. 5, 16435 (2015).</li><li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression.">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).</li><li>Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Survival+Motor+Neuron+genes+generate+a+vast+repertoire+of+circular+RNAs.">Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).</li><li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing.">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).</li><li>Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+exon+sequences+in+alternative+splicing+of+the+human+fibronectin+gene.">A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene.</a> Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).</li><li>Gaildrat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+splicing+reporter+minigene+assay+to+evaluate+the+effect+on+splicing+of+unclassified+genetic+variants.">Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants.</a> Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li><li>Baralle, D., Baralle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+in+action:+assessing+disease+causing+sequence+changes.">Splicing in action: assessing disease causing sequence changes.</a> Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).</li><li>Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+throughput+analysis+of+alternative+splicing+by+fluorescently+labeled+RT-PCR.">Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).</li><li>Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+strategy+identifies+cardiotonic+steroids+as+alternative+splicing+modulators.">A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).</li><li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrvinium+pamoate+changes+alternative+splicing+of+the+serotonin+receptor+2C+by+influencing+its+RNA+structure.">Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).</li><li>Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+expressing+circular+RNAs+via+tRNA+splicing.">Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-7 (2017).</li><li>Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Expressing+and+Imaging+Abundant,+Stable,+Circular+RNAs+In+Vivo+Using+tRNA+Splicing.">A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing.</a> Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).</li><li>Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+MAPT+locus+generates+circular+RNAs.">The human MAPT locus generates circular RNAs.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).</li><li>Casper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+Genome+Browser+database:+2018+update.">The UCSC Genome Browser database: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).</li><li>Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+plasmid+vectors+expressing+FLAG-tagged+proteins+under+the+regulation+of+human+elongation+factor-1alpha+promoter+using+Gibson+assembly.">Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+to+engineer+DNA+polymerases+for+enhanced+processivity+and+improved+performance+in+vitro.">A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Conn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+quaking+regulates+formation+of+circRNAs.">The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs.</a> Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).</li><li>Jeck, W. R., Sharpless, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+characterizing+circular+RNAs.">Detecting and characterizing circular RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).</li><li>Pamudurti, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+CircRNAs.">Translation of CircRNAs.</a> Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).</li><li>Kramer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+control+of+Drosophila+circular+RNA+expression+by+intronic+repeats,+hnRNPs,+and+SR+proteins.">Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins.</a> Genes &amp; Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).</li><li>Starke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+circularization+requires+canonical+splice+signals.">Exon circularization requires canonical splice signals.</a> Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).</li><li>Suzuki, H., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+pre-mRNA+splicing+from+RNase+R+resistant+RNAs.">A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).</li><li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+alternative+back-splicing+and+alternative+splicing+landscape+of+circular+RNAs.">Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs.</a> Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).</li><li>Liang, D., Wilusz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+intronic+repeat+sequences+facilitate+circular+RNA+production.">Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production.</a> Genes &amp; Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).</li><li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+physiology+and+pathology.">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).</li><li>Fejes-Toth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+processing+generates+a+diversity+of+5'-modified+long+and+short+RNAs.">Post-transcriptional processing generates a diversity of 5'-modified long and short RNAs.</a> Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).</li><li>Gao, Q. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+tau+exon+10,+whose+missplicing+causes+frontotemporal+dementia.">Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia.</a> Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).</li><li>Hartmann, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alternative+splicing+of+human+tau+exon+10+by+phosphorylation+of+splicing+factors.">Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).</li><li>Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+backsplicing+produces+translatable+circular+mRNAs.">Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs.</a> RNA. 21 (2), 172-179 (2015).</li><li>Yang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+GFP-Based+Reporter+to+Study+Back+Splicing+and+Translation+of+Circular+RNA.">Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+profiling+reveals+an+abundant+circHIPK3+that+regulates+cell+growth+by+sponging+multiple+miRNAs.">Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11215 (2016).</li><li>Jia, W., Xu, B., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+expression+profiles+of+mouse+ovaries+during+postnatal+development+and+the+function+of+circular+RNA+epidermal+growth+factor+receptor+in+granulosa+cells.">Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells.</a> Metabolism. 85, 192-204 (2018).</li><li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Output+of+Protein-Coding+Genes+Shifts+to+Circular+RNAs+When+the+Pre-mRNA+Processing+Machinery+Is+Limiting.">The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting.</a> Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).</li><li>Legnini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circ-ZNF609+Is+a+Circular+RNA+that+Can+Be+Translated+and+Functions+in+Myogenesis.">Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis.</a> Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+circRNA+Biogenesis+and+Function+with+NF90/NF110+in+Viral+Infection.">Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection.</a> Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biogenesis+of+Nascent+Circular+RNAs.">The Biogenesis of Nascent Circular RNAs.</a> Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).</li></ol>

В целом, круговые РНК являются низкими обильными1,что усложняет изучение их функции и формирования. Подобно линейным РНК13,использование репортера minigenes позволяет определить cis и транс-действующих факторов, которые регулируют формирование круговых РНК. Таким о...

Круговые РНК Круговые РНК (циркрнки) являются ковалентно закрытыми одноцепочечными РНК, которые выражаются в большинстве организмов. Они генерируются путем присоединения вниз по течению 5 ' сращивания сайт вверх по течению 3 ' сращивания сайта, процесс называется обратно-сращивания (Рисунок 1А)1. Последовательности в pre-mRNA, которые демонстрируют базу, дополняемую как короткие, как 30-40 nt принести обратно-сращивания сайтов в надлежащее выравнивание для формирования циркрнки2. У людей, Alu элементы1, представляющие около 11% генома3, образуют обширные двойные структуры РНК в предварительном mRNA из-за их самокомплементи4,5 и тем самым способствовать образованиюциркрнки 1.
В настоящее время описаны три основные функции циркрнки. Некоторые циркрнки связывают микроРНК (миРНК) и через секвестр действуют как губки miRNA6. CircRNAs были вовлечены в транскрипционной и после транскрипции регулирования, через конкуренцию с линейным сращивания7 или модуляции транскрипции фактор деятельности8. Наконец, циркорные системы содержат короткие открытые рамки для чтения, и доказательства принципиальных исследований показывают, что их можно перевести9,10. Тем не менее, функция большинства циркрнок остается загадочной. Большинство круглых РНК были обнаружены с использованием методов секвенирования следующего поколения11. Детальный анализ отдельных генов с использованием целевых подходов RT-PCR показывает, что большое количество круговых РНК еще предстоит обнаружить12.
Использование генов репортеров для анализа обработки предварительной мРНК Анализ мРНК, полученных из ДНК-репортер агонстративных транссексуалов в клетки является устоявшимся методом для изучения альтернативных пре-мРНК сращивания, которые могут быть применены к круговой РНК. В общем, альтернативный экзон, окружающие его интроны и составные экзоны усиливаются и клонируются в вектор эукариотического выражения. Часто интроны сокращаются. Конструкции трансфицируются в эукариотические клетки и обычно анализируются RT-PCR13,14. Этот подход широко используется для картирования нормативных сращивания сайтов и транс-действующих факторов в экспериментах по со-трансфекции13,15,16,17,18. Кроме того, генерация белково-выражающих минигенов допускается скрининг веществ, которые меняют альтернативное сращивание19,20.
Метод применяется к циркулярным РНК. В настоящее время, по крайней мере 12 минигенных позвоночников были описаны в литературе и кратко изложены в таблице 1. За исключением системы экспрессии на основе tRNA21,22, все они зависят от промоутеров полимераза II. Здесь мы описываем метод генерации минигенов репортера для определения циси и транс-действующих факторов, участвующих в генерации круговых РНК. Обзор метода с использованием последовательностей опубликованного гена репортера23 показан на рисунке 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(PEI) Hydrochloride</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Builder tool</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark Reader Transilluminator.</td>
			<td>Clare Chemical Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymatic DNA assembly kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel and PCR cleanup kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyco Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1 cloning site</td>
			<td>Polycloning site</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf" target="_blank">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Q5 DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 2</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1725310</td>
			<td>Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase 2</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>206402</td>
			<td>Qiagen long range polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12183025</td>
			<td>Ambion by Life Technologies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse R</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>RNR07250</td>
			<td>Epicenter/Lucigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040H</td>
			<td>NEB stable cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cloning bacteria</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>NEB5-alpha competent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web tool to design primers</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web-based temperature calculations</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of alu element containing minigenes to analyze circular rnas

В дополнение к линейным мРНК, многие эукариотические гены генерируют круглые РНК. Большинство круглых РНК генерируются путем присоединения 5' сращивания сайта с вверх по течению 3 ' сращивания сайта в рамках предварительной мРНК, процесс, называемый обратно-сплайсинг. Эта круговая речь, вероятно, способствует вторичных структур в предварительном MRNA, которые приносят сращивания сайтов в непосредственной близости. В человеческих генах, Элементы Alu, как полагают, способствуют эти вторичные структуры РНК, как Алу элементы в изобилии и экспонат базы взаимодополняемости друг с другом, когда присутствуют в противоположных направлениях в предварительном mRNA. Здесь мы описываем генерацию и анализ большого элемента Алу, содержащего репортёрские гены, образующие круглые РНК. Благодаря оптимизации протоколов клонирования могут образоваться гены репортеров длиной до 20 кб. Их анализ в экспериментах по сотрансфокации позволяет выявить регуляторные факторы. Таким образом, этот метод может определить последовательности РНК и клеточных компонентов, участвующих в круговой рнкобразования.

Гены репортеров позволяют определить регуляторные факторы, влияющие на формирование круговой РНК. Тем не менее, эти гены репортера являются большими и содержат повторяющиеся элементы, которые часто делают днк конструкции нестабильными. Из-за их большого размера, часто необходимо удал...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs at JoVE.com

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Мы клонируем и анализируем гены репортеров, генерирующие круговые РНК. Эти гены репортеров больше, чем конструкции для анализа линейного сращивания и содержат элементы Alu. Для исследования циркулярных РНК конструкции трансфицируются в клетки и в результате РНК анализируется с помощью РТ-ПЦР после удаления линейной РНК.

Использование элемента Alu, содержащего минигены, для анализа циркулярных РНК

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет пользователю генерировать геномную систему выражения, которая может пройти альтернативное сращивание и в этом случае образуют круговые РНК, которые могут быть проверены на их функции и ассоциации болезней. Основным преимуществом этого метода является то, что он проложит путь для других, чтобы использовать этот протокол в молекулярной биологии и клонирования при изучении альтернативного сращивания в круговой формирования РНК и функции. Мой совет кому-то пытается этот метод в первый раз было бы оптимизировать условия ПЦР.Выполнить градиенты или выполнить приземления ПЦР с различными температурами аннеаляций и времени расширения. Обычно более длинные фрагменты в течение шести КБ будут распространяться на один КБ за цикл, и различные температуры аннеализации должны быть проверены на лучшее усиление. Демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку он даст пользователям лучшее визуальное представление о более сложных аспектах процедуры, особенно генерации грунтовок.Чтобы начать эту процедуру, загрузите UCSC Genome Browser и используйте его для выявления повторяющихся элементов, необходимых для кругового образования РНК и включения их в конструкции. Важно отметить, что грунтовки для усиления должны быть вне повторяющихся элементов. Вставьте круговую последовательность РНК в поиск блата человека и выберите правильный организм.Отправить последовательность, перейти к просмотру браузера, и увеличить 1,5 таймеры или по мере необходимости. Затем мышь над повторяющимися элементами, чтобы определить их подтип в плавающем окне. Элементы Alu находятся в синусовой линии.Используйте кнопку треки по умолчанию под окном, чтобы сбросить браузер, если неправильное изображение получено. Сначала перейдите к мнению, ДНК на верхней линии браузера генома USCS, чтобы загрузить последовательность ДНК показано в окне. В варианте форматирования последовательности выберите расширенные варианты корпуса/цвета.Выберите случай по умолчанию как более низкий и выберите случай переключения для NCBI RefSeq. Выберите подчеркнуть и смелый и italic для RepeatMasker. Нажмите представить.Там будут экзоны, как буквы и интроны, как нижние буквы. Проверьте границы экзон/интрон. Если браузер показывает обратный комплект, вернитесь назад и выберите поле обратного дополнения до тех пор, пока не будут показаны правильные границы exon/intron.Затем скопировать файл с правильной ориентацией в документ обработки слов и выделить exons. Выберите фрагменты, которые будут усилены убедившись, что интрон не начинается или заканчивается в повторяющемся регионе, как грунтовки в этих регионах не будет усиливать конкретные последовательности. Для начала используйте веб-инструмент для разработки праймеров для клонирования.Для векторной последовательности добавьте место вставки в качестве последнего нуклеотида и затем добавьте фрагменты. Поскольку номерирование вектора не начинается с данного места вставки, место вставки в векторе расположено, а часть вниз по течению помещена перед последовательностью вверх по течению. Отрегулируйте грунтовки, если их точки плавления более чем на четыре градуса цельсия друг от друга и не работают в усилении.В этом исследовании, репортер генов, которые генерируют круговые РНК клонируются и анализируются. Оптимизированные продукты ПЦР разделены на 1%agarose гель, содержащий 1X гель зеленый. Отдельные полосы представляют продукты ПЦР, которые будут использоваться в энзиматической сборке ДНК.Затем эти полосы вырезаются из геля и очищаются. Очищенный продукт ПЦР не соответствует ожидаемому размеру с гелем зеленый так продукты также разделены на 1%agarose гель, который впоследствии окрашенных бромистого этидия для обеспечения продуктов правильного размера. Для начала установите комплект для сборки энзиматической ДНК.Объедините вектор и вставки в молярном соотношении один к двум. Далее добавьте 10 микролитров мастер-микса сборки ДНК. Инкубация образцов в течение 60 минут при 50 градусах.Оттепель компетентных клеток на льду во время инкубации. Клетки должны быть в объеме 50 микролитров. Затем преобразуй компетентные ячейки с общей реакцией сборки.Добавьте два микролитров охлажденного собранного продукта в компетентные клетки. Смешайте, аккуратно стряхивая трубку четыре-пять раз. Не вихрь.Поместите смесь на лед в течение 30 минут. Тепло удар смеси при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 30 секунд. Затем поместите его обратно на лед в течение двух минут.После этого добавьте в трубку 950 микролитров средств связи комнатной температуры SOC. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 60 минут при встряхивании при 300 об/мин. Во время этой инкубации, тепло две пластины выбора, которые содержат соответствующие антибиотики.После инкубации центрифуга реакционной трубки на 10 000 г в течение 30 секунд, чтобы гранулировать клетки и выбыть 25% клеток на одной пластине отбора и 75% на другой. Инкубировать эти пластины на ночь при 37 градусах по Цельсию. Прежде чем начать трансфекцию, проверьте свою ДНК путем ограничения пищеварения.Здесь, представитель тау minigene, который содержит экзоны от девяти до 12 разрезается с ограничением ферментов указано, чтобы исключить основные рекомбинации. Для трансфекции сначала растворяют линейный полиэтиленовый гидрохлорид в воде при концентрации одного миллиграмма на миллилитр при рН два. Используйте гидроксид натрия, чтобы довести рН до семи и стерильный фильтр раствор с фильтром 0,22 микрометра.Храните раствор при четырех градусах Цельсия до готовности к использованию. Затем разделить клетки на колодцы из шести скважин пластины и пусть они растут на ночь на DMEM сми, содержащих 10%FBS. На следующий день, aliquot один микрограмм сообщили гена в стерильной трубке и добавить 200 микролитров стерильных фильтрованных 150 миллимолярный хлорид натрия.Смешайте вихрем. Далее добавьте к этой смеси раствор полиэтиленимина в соотношении трех микролитров полиэтиленимина на каждый микрограмм ДНК. Центрифуга кратко собирать образцы в нижней части трубки.Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавьте его непосредственно в клетки HEK293. Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислого газа.На следующий день используйте комплект изоляции РНК для изоляции РНК для RT-PCR. cDNA из двух образцов, полученных из тканей мозга человека усиливаются с круговой РНК грунтовки circ tau exon 1210 обратном и circ tau exon 1211 вперед. В то время как ожидаемая полоса, соответствующая тау круговой РНК видно, другие сильные полосы артефакты, которые не соответствуют геному человека.Этот эксперимент повторяется с идентичными условиями ПЦР, но обратная транскрипция была выполнена только с circ tau exon 1210 обратной грунтовки. Только ожидаемая группа усиливается и проверяется с помощью последовательности. РНК затем лечится RNase R, который удаляет линейную РНК.Круговая РНК обнаруживается после лечения, в то время как линейная РНК больше не дает обнаруживаемого сигнала. РНК изолирована в течение 24 часов после трансфекции и анализируется RT-PCR. Усиление линейной тау-мРНК показывает две полосы из-за альтернативного сращивания exon 10.Их отношение меняется к чрезмерному выражению сращивания факторов. Усиление круговой РНК 1210 тау показывает зависимость экспрессии РНК тау-цирк от выражения некоторых факторов сращивания, особенно cdc2-подобной киназы CLK2 и белка SR 9G8. Самое главное помнить при попытке этой процедуры является дизайн и расположение грунтовки при строительстве minigene.Праймер не должен лежать в повторяющихся элементах и должен быть оптимизирован в различных условиях в зависимости от фрагмента усиливается. После этой процедуры, другие методы, которые могут быть выполнены будет тестирование функции круговой РНК. Пользователи могут проверить перевод или секвестр белков, чтобы определить функцию для конкретной круговой РНК пользователь заинтересован в.Этот метод проложил путь к использованию геномных фрагментов в минигенной системе, которая может более выразить круговые РНК, позволяющие пользователю проверить и определить их функцию и в некоторых аспектах их связь с болезнью. Смысл этого метода распространяется на потенциальные методы лечения и диагностики конкретного заболевания, например тауопатии, нейродегенеративные заболевания, связанные с тау патологией. Мы обнаружили, что микротрубочка связанных белка тау, известный как MAPT, генерирует круговые РНК, которые мы считаем, способствуют патологии болезни, и этот метод позволяет нам в полной мере изучить эти круговые РНК и выявления их функции и связи с болезнью.Этот метод мог бы дать представление о более четком понимании круговых РНК, их функций и роли, которую они могут играть при некоторых заболеваниях. Этот метод может быть применен при клонировании других минигенов, которые выражают круговые РНК между видами, где он может дать представление об их функции. Усиление продуктов ПЦР оказывается наиболее трудным с длинными фрагментами усиливается из геномной ДНК, наряду с наличием нескольких повторяющихся элементов в фрагменте.

use-of-alu-element-containing-minigenes-to-analyze-circular-rnas

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.

We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.

Сочетание мокрой и сухой методы Lab в Руководстве по кристаллизации больших биспиральных, содержащих белки

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Метод визуализации и анализа Мембранные белков, взаимодействующих с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Количественная оценка изобилие и зарядки уровней передачи РНК в Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

Одновременное измерение супероксид/водорода пероксида и НАДН производства флавинсодержащих митохондриальной дегидрогеназ

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. The ability to readily detect the formation of these fibers under various experimental conditions is essential for understanding their potential function. Many methods have been used to detect the fibers, but not without some drawbacks. For example, electron microscopy (EM), or staining with Congo Red or Thioflavin T often requires purification of the fibers. On the other hand, semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (SDD-AGE) allows detection of the SDS-resistant amyloid-like fibers in the cell extracts without purification. In addition, it allows the comparison of the size difference of the fibers. More importantly, it can be used to identify specific proteins within the fibers by Western blotting. It is less time consuming and more easily accessible to a wider number of labs. SDD-AGE results often show variable degree of heterogeneity. It raises the question whether part of the heterogeneity results from the dissociation of the protein complex during the electrophoresis in the presence of SDS. For this reason, we have employed a second dimension of SDD-AGE to determine if the size heterogeneity seen in SDD-AGE is truly a result of fiber heterogeneity in vivo and not a result of either degradation or dissociation of some of the proteins during electrophoresis. This method allows fast, qualitative confirmation that the amyloid or amyloid-like fibers are not partially dissociating during the SDD-AGE process.

Here we use two-dimensional semi-denaturing agarose gel electrophoresis to confirm the presence of amyloid-like fibers of heterogeneous size and exclude the possibility that the size heterogeneity is due to dissociation of the amyloid fibers during the gel running process.

Использование двух мерных полу денатурируя стирального геля агарозы подтвердить размер неоднородность волокон амилоида или амилоид как

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Крупномасштабное производство рекомбинантных молекул РНК на круговой лески с помощью вироиды производные системы в Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Использование микромасштабного термофореза для измерения белково-липидных взаимодействий

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a multitude of samples. It has been extensively used in many research areas and achieved industrial application in fields such as human diagnostics and trait selection in crops of genetically modified organisms (GMO) crops. However, qPCR is not an error-proof technique. Mixing all reagents into a single master mix subsequently distributed onto 96 wells of a regular qPCR plate might lead to operator mistakes such as incorrect mixing of reagents or inaccurate dispensing into the wells. Here, a technique called gelification is presented, whereby most of the water present in the master mix is substituted by reagents that form a sol-gel mixture when submitted to a vacuum. As a result, qPCR reagents are effectively preserved for a few weeks at room temperature or a few months at 2-8 oC. Details of preparing each solution are shown here along with the expected aspect of a gelified reaction designed to detect&#160;T. cruzi satellite DNA (satDNA). A similar procedure can be applied to detect other organisms. Starting a gelified qPCR run is as simple as removing the plate from the refrigerator, adding the samples to their respective wells, and starting the run, thus decreasing the setup time of a full-plate reaction to the time it takes to load the samples. Additionally, gelified PCR reactions can be produced and controlled for quality in batches, saving time and avoiding common operator mistakes while running routine PCR reactions.

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

The present work describes the steps for producing ready-to-use qPCR for T. cruzi DNA detection that can be pre-loaded on the reaction vessel and stored in the refrigerator for several months.

Готовая к использованию qPCR для обнаружения ДНК из Trypanosoma cruzi или других патогенных организмов

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

Рецептура и характеристика биологически активного агента, содержащего нанодиски

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...