Name: electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door het National Heart, Lung en Blood Institute (R01 HL073965, IL) en (T32 HL007829-24, ISF). De auteurs willen ook de wetenschappelijke machine winkel van de Universiteit van Illinois in Chicago erkennen voor het genereren van onze nieuwste MPP flow Chambers.

Het gebruik van dieren in onze studies is goedgekeurd door de Universiteit van Illinois in het Dierenzorg Comité van Chicago (#16-183).
1. montage van de gemodificeerde parallelle plaat stroom kamer
Opmerking: Raadpleeg tabel 1 en Figuur 1 voor de MPP-stroom kamer stuk-id's. Zie afbeelding 1 voor een schematische voorstelling van de oriëntatie van de kamer stukken voor de a...

<ol>
	<li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans:+Role+of+Hemodynamic+Stimuli.">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).</li><li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K++current+in+vascular+endothelial+cells.">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li><li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secrets+of+the+code:+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals?.">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?.</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li><li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise.">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li><li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+K(+)+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries.">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li><li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K(+)+Channels.">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li><li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance.">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force.">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li><li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field.">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K++channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li><li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress.">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers.">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).</li><li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Assembly+and+Application+of+'Shear+Rings':+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital,+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress.">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).</li><li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers.">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress.">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li><li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-activated+Na(+)and+K(+)Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells.">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li><li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery.">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SK(Ca)+and+IK(Ca)+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells.">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li><li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins.">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette:+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow.">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K(+)+current+by+convectively+restoring+[K(+)]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585 (2016).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv.">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li><li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells.">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li><li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway.">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li><li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator.">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li></ol>

Het vasculaire systeem wordt voortdurend blootgesteld aan actieve hemodynamische krachten, die mechanosensitieve ionkanalen3,22 activeren, maar de fysiologische rollen van deze kanalen in shear stress-geïnduceerde mechanotransductie is alleen beginnen te ontstaan4,6,8. De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de mechanosensitiviteit van shear stress-geactiveerde ka...

Hemodynamische krachten gegenereerd door de bloedstroom zijn bekend om te spelen belangrijke rollen in endotheel en vasculaire functie1,2. Het is ook bekend dat verschillende soorten ionenkanalen acuut reageren op veranderingen in shear stress3,4,5 wat leidt tot de hypothese dat ionenkanalen primaire shear stress sensoren kunnen zijn. Meer recentelijk toonden wij en anderen aan dat mechanogevoelige ionenkanalen kritische rollen spelen in verschillende afschuiving gevoelige vasculaire functies, waaronder de vasoactieve respons op shear stress6,7,8 en ontwikkelings-angiogenese9. De mechanismen van de shear-stress gevoeligheid van ionenkanalen zijn echter bijna volledig onbekend. Deze kloof van kennis is waarschijnlijk te wijten aan de technische moeilijkheid van het uitvoeren van elektrofysiologische opnames onder goed gedefinieerde shear stress. In dit artikel bieden we daarom een stap voor stap gedetailleerd protocol dat routinematig wordt uitgevoerd in ons lab om dit doel te bereiken6,7,10,11.
Het algemene doel van deze methode is om het real-time onderzoek van Ion Channel mechanoactivation onder goed gedefinieerde shear stress in het fysiologische bereik mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door een standaard parallelle plaat stroom kamer te wijzigen, zodat een elektrofysiologische pipet in de kamer kan worden verlaagd en toegang wordt verkregen tot cellen die op de bodemplaat zijn geteeld tijdens de real-time blootstelling aan stroming, wat een unieke aanpak biedt om dit te bereiken doel6,7,11. Standaard parallelle plaat stroomkamers, beschreven in voorgaande publicaties, kunnen worden gebruikt voor de real-time beeldvormings analyse van cellen die zijn blootgesteld aan afschuifkrachten12 of andere niet-invasieve benaderingen13,14 maar niet voor Elektrofysiologie. Evenzo is de kegel-en plaat apparatuur, een andere krachtige benadering om cellen bloot te stellen aan shear stress15,16 ook niet geschikt voor elektrofysiologische opnames. Dus, deze stroom apparaten niet toestaan dat het onderzoek van shear stress gevoeligheid van ionenkanalen. De moeilijkheid bij het uitvoeren van elektrofysiologische opnames onder stroom is de belangrijkste reden voor de schaarste van informatie over de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze cruciale effecten.
In termen van de alternatieve benaderingen om hetzelfde doel te bereiken, zijn er geen die zo nauwkeurig of gecontroleerd zijn. Sommige eerdere studies probeerden de activiteit van het ion-kanaal onder stroom op te nemen door cellen bloot te stellen aan een stroom vloeistof afkomstig van een andere pipet die in de nabijheid van een cel van boven de17,18werd gebracht. Dit is zeer niet-fysiologische, als de mechanische krachten gegenereerd onder deze omstandigheden hebben weinig gemeen met de fysiologische profielen van shear stress in de bloedvaten. Vergelijkbare bezorgdheid is van toepassing op de pogingen om fysiologische afschuif stress te simuleren door een perfusie van open kamers. Zoals uitvoerig besproken in onze eerdere studie10, creëert een open Liquid-Air-interface meerdere storingen en recirculatie, die niet-fysiologisch zijn. Om al deze zorgen aan te pakken, hebben we een gemodificeerde parallelle plaat (MPP)-stroom kamer ontworpen, ook wel de "minimaal invasieve stroomvoorziening" genoemd in onze eerdere studies6,7,10,11, gemaakt van acryl en uitgebreid gebruikt in ons lab. Ondanks het feit dat de oorspronkelijke beschrijving van het ontwerp bijna twintig jaar geleden is gepubliceerd en het enige stroom apparaat is dat het mogelijk maakt elektrofysiologische opnames onder welomschreven afschuif spanning uit te voeren, is deze methodologie echter niet goedgekeurd door andere laboratoria en er zijn slechts zeer weinig studies die proberen om stromen onder stroom op te nemen. Wij zijn daarom van mening dat het verstrekken van een gedetailleerde beschrijving voor het gebruik van de MPP flow Chamber een grote hulp zal zijn voor onderzoeken die geïnteresseerd zijn in mechanosensitieve ionenkanalen en vasculaire biologie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 grade forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>1252-30</td>
			<td>Used for transferring digested arteries to fresh solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm diameter Cover glass circles</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 40 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975224</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Co</td>
			<td>305175</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-50MG</td>
			<td>Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>100 mg - LS004194</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elastase, lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>25 mg - LS002290&#160;</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral protease/dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon ND 10-80 tubing</td>
			<td>Microbore Tubing</td>
			<td>AAQ04133</td>
			<td>ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress

Vloeibare shear stress is bekend om een belangrijke rol in de endotheliale functie te spelen. In de meeste vasculaire bedden, verhoogde shear stress van acute stijgingen van de bloedtoevoer activeert een signalering Cascade resulterend in vasodilatatie daardoor verlichten mechanische belasting op de vaatwand. Het patroon van shear stress is ook bekend als een kritische factor in de ontwikkeling van atherosclerose met laminaire shear stress wordt atheroprotective en verstoorde shear stress Pro-atherogenic. Terwijl we een gedetailleerd begrip van de verschillende tussenliggende cel signalering trajecten, de receptoren die eerst de mechanische stimulans vertalen in chemische bemiddel kers zijn niet volledig begrepen. Mechanosensitive ionenkanalen zijn van cruciaal belang voor de respons op afschuiving en regelen shear-geïnduceerde cel signalering waardoor de productie van vasoactieve mediatoren. Deze kanalen behoren tot de vroegste geactiveerde signalering componenten te scheren en zijn gekoppeld aan shear-geïnduceerde vasodilatatie door het bevorderen van stikstofmonoxide productie (bv, naar binnen rectificeren K+ [Kir] en voorbijgaande receptor potentieel [TRP] kanalen) en endotheel hyperpolarisatie factor (bijv. Kir en calcium-geactiveerde K+ [KCA] kanalen) en door afschuiving veroorzaakte vasoconstrictie door een onbepaald mechanisme dat piëzo-kanalen omvat. Het begrijpen van het biopfysische mechanisme waarmee deze kanalen worden geactiveerd door afschuifkrachten (d.w.z. direct of via een primaire mechano-receptor) kan potentiële nieuwe doelen bieden om de pathofysiologie te verhelpen die gepaard gaat met endotheliale disfunctie en atherogenese. Het is nog steeds een grote uitdaging om doorstroming geïnduceerde activering van ionenkanalen in real-time te registreren met behulp van elektrofysiologie. De standaardmethoden om cellen bloot te stellen aan goed gedefinieerde shear stress, zoals de kegel-en plaat rheometer en de gesloten parallelle plaat stroom kamer staan geen real-time studie toe van de activering van ionenkanalen. Het doel van dit protocol is om een gemodificeerde parallelle plaat stroom kamer te beschrijven die real-time elektrofysiologische opname van mechanosensitieve ionenkanalen onder welomschreven shear stress mogelijk maakt.

Meerdere Foto's met verschillende weergaven van de MPP-stroom kamer op de Microscoop (bovenste paneel) en een schematische weergave van de MPP-stroom kamer (onderste paneel) worden weergegeven in Figuur 1. De schematische Details van de afmetingen van het gehele apparaat en de stroom kamer. Figuur 2 toont een foto van het zwaartekracht perfusie systeem aan de MPP-stroom kamer in ons laboratorium (bovenste paneel). Ook is een sche...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Elektrofysiologische opnames van eencellige ionen stromen onder welomschreven afschuif spanning

Het doel van dit protocol is om een gemodificeerde parallelle plaat stroom kamer te beschrijven voor gebruik bij het onderzoeken van real-time activering van mechanosensitieve ionenkanalen door shear stress.

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

Het gebruik van de gewijzigde parallelle plaat stroomkamer kan onderzoekers helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de functionele reactie van mechanosensitive ionkanalen op schuifstress. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt real-time onderzoek te stromen geactiveerde ionkanalen in een gemakkelijk te monteren, herbruikbare parallelle plaat flow kamer. Om te beginnen met de procedure, breng een dunne laag siliconen elastomeer oplossing rond de randen van de rechthoekige ruimte van stuk C, en voorzichtig plaats de rechthoekige deksel glas, stuk D, direct op de elastomeer oplossing om volledig te dekken de open rechthoekige ruimte van stuk C.Zorgvuldig wegvegen overtollige siliconen elastomeer oplossing.Herhaal vervolgens de procedure voor het vasthouden van het rechthoekige afdekglas, stuk F, aan de onderkant van stuk E en laat de siliconen elastomeeroplossing 's nachts bij kamertemperatuur genezen. Nu, monteer de MPP flow kamer door achtereenvolgens het plaatsen van elk stuk op de top van de vorige, te beginnen met de onderste kamer, stuk E, dan stuk C, stuk B, gevolgd door stuk A op de top. Vervolgens lijnen de schroefgaten van elk stuk op de hoeken en stevig schroef de stukken samen om lekken te voorkomen tijdens het beheer van de stroom naar de MPP flow chamber.In een zes-put plaat, plaats vier tot vijf, 12 millimeter dekking glazen cirkels in elke put. Sla de cellen tussen 10% en 30%-samenvloeiing op, zodat enkele cellen toegankelijk zijn voor elektrofysiologische opnames. Vervolgens, incubeer de cellen onder standaard kweekomstandigheden voor niet minder dan twee uur om cellen te hechten, en niet meer dan 24 uur, als endotheelcellen zal plat en moeilijk te patchen wanneer gezaaid op subconfluency voor meer dan 24 uur.Verwijder vervolgens een afdekglas met de aangehangen cellen uit een put van de zes-put plaat en spoel snel in PBS. Breng vervolgens het afdekglas met cellen over op een petrischaal van 35 millimeter met twee milliliter elektrofysiologische BAF-oplossing. Breng het afdekglas met cellen onmiddellijk over naar de MPP-stroomkamer.Breng de afdekglascirkel over op het rechthoekige afdekglas, stuk D, dat is gehecht aan stuk C van de MPP-stroomkamer. Voeg de BAF-oplossing toe om de afdekglascirkel en de cellen volledig onder te dompelen. Plaats vervolgens de afdekglazen cirkel op stuk D zodanig dat de cellen in overeenstemming zijn met de spleet openingen van stuk B.Zorg ervoor dat de cover glas cirkel hecht aan stuk D door middel van oplossing glas hechting om verstoring van de positie van de cover glas cirkel door de stroom toepassing te voorkomen.Monteer vervolgens de MPP-stroomkamer door de stukken in de juiste volgorde aan elkaar te schroeven. Breng de kamer over naar het microscoopstadium en doorspeed onmiddellijk de kamer met BAF-oplossing. Identificeer vervolgens een gezonde cel met een donkere rand en duidelijke kern voor het experiment.Vermijd cellen die lijken te zijn blubbing of cellen die in contact zijn met andere cellen. Om shear stress te controleren, het opzetten van een zwaartekracht perfusie systeem door het aansluiten van een 30 milliliter afgestudeerd spuitcilinder op een drie-weg Luer slot uitgerust met microbore buizen. Bevestig vervolgens de gegradueerde cilinder aan de Kooi van Faraday rond de elektrofysiologie-installatie met dubbelzijdige tape.Voordat u de slang in de MPP-kamer plaatst, vult u de spuit en de slang vooraf met BAF-oplossing. Steek vervolgens de slang in het MPP-stroomkamerinlaatgat van stuk A.Vul de MPP-stroomkamer vooraf met oplossing, zodat deze in het vacuümreservoir wordt verwijderd. Stop de stroom naar de kamer en vul de gegradueerde cilinder aan de bovenste markering.Bereken de stroomsnelheid handmatig met behulp van een stopwatch door de oplossing door de kamer te laten stromen op een bepaalde spuitcilinderhoogte. Verhoog of verlaag de spuit om de stroom te veranderen en bereken de schuifspanning in een parallelle kamer met behulp van deze vergelijking. Herhaal dit proces totdat een gewenst niveau van afschuifstress is gevonden.Breng vervolgens een geassembleerde kamer met aangehangen cellen over naar het microscoopstadium van de elektrofysiologie-installatie. En steek de slang, voorgevuld met BAF-oplossing, in het gat van stuk A.Dan, vul de kamer en was de cellen met 10 milliliter BAF oplossing, tegelijkertijd. Zodra de gewenste patch configuratie met succes is verkregen, laat kanaalstromen te stabiliseren in een statisch bad bij kamertemperatuur.Zodra de stromingen zijn gestabiliseerd, toe te passen schuin op een stap-wise manier, waardoor de verhoogde stroom te stabiliseren voorafgaand aan de volgende stap van shear stress te verhogen. Verwijder schuinte blootstelling aan de cellen door het stoppen van de stroom naar de kamer, waardoor mechanosensitive kanaalstromen om terug te keren naar baseline stromen waargenomen in het statische bad. Hier getoond is een representatieve ruwe opname van Kir stroom van een primaire muis mesenterische endotheelcel met opmerkelijke lineaire uitgaande lekstroom.Een helling van negatieve 140 tot positieve 40 millivolt werd toegepast op de patch meer dan 400 milliseconden. Lek stroom voorkomt dat de analyse van echte Kir kanaal activiteit. Om lekstroom af te trekken, berekent u eerst de lineaire hellinggeleiding van lekstroom.Meerdere G helling door overeenkomstige spanningen van de gehele ruwe spoor te plotlek stroom op de ruwe gegevens. De lijn moet het uitgaande lineaire lek precies bedekken. Trek vervolgens de uitgeplosde lekstroom af van het hele spoor, zodat de lineaire uitgaande stroom ongeveer nul picoamperes per picofarad is en de echte Kir-stroom kan worden geanalyseerd.Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is om de juiste positie van de cover glas in de kamer, zodat cellen toegankelijk zijn voor experimenten. Zorg er bovendien voor dat de afdekslip voldoende is nageleefd op stuk D, zodat de vloeistofstroom het afdekglas met cellen niet verstoort.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Een Flow adhesieanalyse om te studeren leukocyten rekrutering van humane lever Sinusvormige endotheel onder omstandigheden van Afschuifspanning

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

Voorbereiding van de Single-cell Charms voor Cytofluorimetric Analyse van verschillende Mouse Skin Regio

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analyse van Shear Flow-geïnduceerde migratie van RattenUitrustingen Marginal Zone B cellen In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...