Name: electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

यह काम राष्ट्रीय दिल, फेफड़े, और रक्त संस्थान (R01 HL073965, आईएल) और (T32 HL007829-24, ISF) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. लेखकों को भी हमारे नवीनतम एमपीपी प्रवाह कक्षों पैदा करने के लिए शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में वैज्ञानिक मशीन की दुकान स्वीकार करना चाहते हैं.

हमारे अध्ययन में जानवरों का उपयोग शिकागो पशु देखभाल समिति (#16-183) में इलिनोइस विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित है.
1. संशोधित समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर की विधानसभा
नोट: कृपया MPP प्र...

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	<li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans:+Role+of+Hemodynamic+Stimuli.">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).</li><li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K++current+in+vascular+endothelial+cells.">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li><li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secrets+of+the+code:+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals?.">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?.</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li><li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise.">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li><li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+K(+)+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries.">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li><li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K(+)+Channels.">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li><li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance.">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force.">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li><li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field.">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K++channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li><li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress.">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers.">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).</li><li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Assembly+and+Application+of+'Shear+Rings':+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital,+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress.">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).</li><li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers.">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress.">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li><li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-activated+Na(+)and+K(+)Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells.">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li><li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery.">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SK(Ca)+and+IK(Ca)+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells.">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li><li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins.">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette:+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow.">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K(+)+current+by+convectively+restoring+[K(+)]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585 (2016).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv.">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li><li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells.">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li><li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway.">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li><li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator.">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li></ol>

संवहनी प्रणाली लगातार सक्रिय हीमोडायनामिक बलों के संपर्क में है, जो मशीन संवेदी आयन चैनलोंकोसक्रिय3 ,22 लेकिन कतरनी तनाव प्रेरित mechanotransduction में इन चैनलों की शारीरिक भूमिकाओं ही है <sup c...

रक्त प्रवाह से उत्पन्न हीमोडायनामिक बल एंडोथेलियल और संवहनी फलन1,2में प्रमुख भूमिका निभाने के लिए जाने जाते हैं . यह भी अच्छी तरह से जाना जाता है कि आयन चैनलों के कई प्रकार तीव्रता कतरनी तनाव में परिवर्तन का जवाब3,4,5 परिकल्पना है कि आयन चैनल ों प्राथमिक कतरनी तनाव सेंसर हो सकता है के लिए अग्रणी. हाल ही में, हम और अन्य लोगों से पता चला है कि mechanosensitive आयन चैनलकई कतरनी तनाव के लिए vasoactive प्रतिक्रिया सहित कई कतरनी तनाव संवेदनशील संवहनी कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभातेहैं 6,7,8 , और विकासात्मक एंजियोजेनेसिस9. आयन चैनलों के कतरनी तनाव संवेदनशीलता के तंत्र, तथापि, लगभग पूरी तरह से अज्ञात हैं. ज्ञान का यह अंतर सुपरिभाषित कतरनी तनाव के तहत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग करने की तकनीकी कठिनाई के कारण होने की संभावना है। इस लेख में, इसलिए, हम इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया विस्तृत प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम प्रदान करते हैं6,7,10,11.
इस विधि के समग्र लक्ष्य शारीरिक रेंज में अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के तहत आयन चैनल mechanoactivation की वास्तविक समय जांच की अनुमति है. यह एक मानक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष को संशोधित करने के द्वारा हासिल की है एक electrophysiological pippette कक्ष में कम किया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए और प्रवाह के लिए वास्तविक समय जोखिम के दौरान नीचे की थाली पर हो कोशिकाओं का उपयोग, इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए एक अद्वितीय दृष्टिकोण प्रदान लक्ष्य6,7,11. इसके विपरीत, मानक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्षों, पूर्व प्रकाशनों में वर्णित कतरनी बलों को उजागर कोशिकाओं की वास्तविक समय इमेजिंग विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता12 या अन्य गैर इनवेसिव दृष्टिकोण13,14 लेकिन के लिए नहीं वैद्युत शरीर विज्ञान। इसी प्रकार, शंकु और प्लेट उपकरण, कोशिकाओं को अपस्मार करने के लिए एक और शक्तिशाली दृष्टिकोण तनाव15,16 भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त नहीं है। इस प्रकार, इन प्रवाह उपकरणों आयन चैनलों की कतरनी तनाव संवेदनशीलता की जांच की अनुमति नहीं है. प्रवाह के तहत electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन में कठिनाई इन महत्वपूर्ण प्रभाव के लिए जिम्मेदार तंत्र के बारे में जानकारी की कमी के लिए मुख्य कारण है.
वैकल्पिक दृष्टिकोण के संदर्भ में एक ही लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, वहाँ कोई नहीं है कि के रूप में सही या नियंत्रित कर रहे हैं. कुछ पहले के अध्ययनों में 17,18से ऊपर के सेल के आस - पासके क्षेत्र में लाए गए अन्य पिपेट से आने वाले तरल की धारा को कोशिकाओं को उजागर करके आयन चैनल गतिविधि को प्रवाह के अधीन रिकॉर्ड करने का प्रयास किया गया . यह अत्यधिक गैर-भौतिक है, क्योंकि इन स्थितियों में उत्पन्न यांत्रिक बलों में रक्त वाहिकाओं में कतरनी तनाव की शारीरिक प्रोफाइल के साथ कम है। इसी तरह की चिंताओं को खुले कक्षों के भ्रम द्वारा शारीरिक कतरनी तनाव अनुकरण करने के प्रयास करने के लिए लागू होते हैं. जैसा कि हमारे पहले के अध्ययन में विस्तार से चर्चा10, एक खुला तरल हवा इंटरफ़ेस कई गड़बड़ी और recirculation, जो गैर भौतिक हैं बनाता है. इन सभी चिंताओं को संबोधित करने के लिए, हम एक संशोधित समानांतर प्लेट (एमपीपी) प्रवाह कक्ष तैयार किया है, यह भी हमारे पहले के अध्ययन में "न्यूनतम इनवेसिव प्रवाह डिवाइस" के रूप में संदर्भित6,7,10,11, बनाया एक्रिलिक से और बड़े पैमाने पर हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया. हालांकि, इस तथ्य के बावजूद कि डिजाइन का मूल विवरण लगभग 20 साल पहले प्रकाशित किया गया है और केवल प्रवाह उपकरण है जो अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के तहत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने की अनुमति देता है, इस पद्धति को नहीं किया गया है अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया और वहाँ केवल बहुत कुछ अध्ययन है कि प्रवाह के तहत धाराओं रिकॉर्ड करने का प्रयास कर रहे हैं. इसलिए, हम मानते हैं, कि एमपीपी प्रवाह कक्ष का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करने के लिए जो mechanosensitive आयन चैनलों और संवहनी जीव विज्ञान में रुचि रखते हैं शोध करने के लिए बहुत मदद की होगी.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 grade forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>1252-30</td>
			<td>Used for transferring digested arteries to fresh solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm diameter Cover glass circles</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 40 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975224</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Co</td>
			<td>305175</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-50MG</td>
			<td>Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>100 mg - LS004194</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elastase, lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>25 mg - LS002290&#160;</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral protease/dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon ND 10-80 tubing</td>
			<td>Microbore Tubing</td>
			<td>AAQ04133</td>
			<td>ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress

द्रव कतरनी तनाव endothelial समारोह में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है. सबसे संवहनी बिस्तरों में, रक्त प्रवाह में तीव्र वृद्धि से ऊंचा कतरनी तनाव एक संकेत झरना ट्रिगर करता है जिसके परिणामस्वरूप वासोडिलेशन होता है जिससे संवहनी दीवार पर यांत्रिक तनाव को समाप्त किया जाता है। कतरनी तनाव के पैटर्न भी अच्छी तरह से लेमिनर कतरनी तनाव के साथ atherosclerosis के विकास में एक महत्वपूर्ण कारक होने के लिए जाना जाता है atheroprotective जा रहा है और परेशान कतरनी तनाव समर्थक atherogenic जा रहा है. जबकि हम विभिन्न मध्यवर्ती सेल संकेतन रास्ते की एक विस्तृत समझ है, रिसेप्टर्स कि पहले रासायनिक मध्यस्थों में यांत्रिक उत्तेजना अनुवाद पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं. मेकेनोसेन्सेटिव आयन चैनल कतरनी की प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण होते हैं और कतरनी-प्रेरित सेल संकेतन को विनियमित करते हैं जिससे वासोएक्टिव मध्यस्थों के उत्पादन को नियंत्रित किया जा सकता है। इन चैनलों जल्द से जल्द सक्रिय संकेत घटककतरा के बीच में हैं और नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन को बढ़ावा देने के माध्यम से कतरनी प्रेरित vasodilation से जोड़ा गया है (जैसे, अंदर से सुधार K+ [कीर] और क्षणिक रिसेप्टर क्षमता [टीआरपी] चैनल) और endothelium hyperpolarizing कारक (जैसे, किर और कैल्शियम सक्रिय कश्मीर+ [KCa] चैनल) और एक अनिर्धारित तंत्र है कि piezo चैनल शामिल है के माध्यम से कतरनी प्रेरित वाहिकासंकीर्णन. जैवभौतिक तंत्र को समझना जिसके द्वारा इन चैनलों कतरनी बलों द्वारा सक्रिय कर रहे हैं (यानी, सीधे या एक प्राथमिक mechano-रिसेप्टर के माध्यम से) संभावित नए लक्ष्य प्रदान करने के लिए endothelial रोग के साथ जुड़े pathophysiology को हल कर सकता है और अतींद्रजनन। यह अभी भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग कर वास्तविक समय में आयन चैनलों के प्रवाह प्रेरित सक्रियण रिकॉर्ड करने के लिए एक बड़ी चुनौती है। अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए मानक तरीके, इस तरह के शंकु और प्लेट rheometer और बंद समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष आयन चैनल सक्रियण के वास्तविक समय अध्ययन की अनुमति नहीं है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक संशोधित समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष है कि अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के तहत mechanosensitive आयन चैनलों की वास्तविक समय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है का वर्णन करने के लिए है.

माइक्रोस्कोप मंच (ऊपरी पैनल) पर एमपीपी प्रवाह कक्ष के विभिन्न विचारों को दर्शाने वाली एकाधिक तस्वीरें और एमपीपी प्रवाह कक्ष (नीचे फलक) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 1में दर्?...

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Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

अच्छी तरह से परिभाषित शीर तनाव के तहत एकल कोशिका आयन धाराओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य कतरनी तनाव से mechanosensitive आयन चैनलों की वास्तविक समय सक्रियण की जांच में उपयोग के लिए एक संशोधित समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष का वर्णन है.

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

संशोधित समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष का उपयोग शोधकर्ताओं को तनाव कतरनी के लिए mechanosensitive आयन चैनलों की कार्यात्मक प्रतिक्रिया से संबंधित प्रमुख सवालों के जवाब में मदद कर सकते हैं । इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह वास्तविक समय की जांच को आसानी से इकट्ठे, पुन: प्रयोज्य समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष में सक्रिय आयन चैनलों को प्रवाहित करने की अनुमति देता है। प्रक्रिया शुरू करने के लिए, टुकड़ा सी के आयताकार अंतरिक्ष के किनारों के चारों ओर सिलिकॉन इलास्टोमर समाधान की एक पतली परत लागू करें, और धीरे-धीरे आयताकार कवर ग्लास, पीस डी रखें, सीधे इलास्टोमर समाधान पर पूरी तरह से टुकड़ा सी के खुले आयताकार स्थान को कवर करने के लिए सावधानी से अतिरिक्त सिलिकॉन इलास्टोमर समाधान को मिटा दें।फिर, आयताकार कवर ग्लास, टुकड़ा एफ, टुकड़ा ई के नीचे करने के लिए पालन करने के लिए प्रक्रिया दोहराएं और सिलिकॉन इलास्टोमर समाधान कमरे के तापमान पर रात भर इलाज करने के लिए अनुमति देते हैं । अब, एमपीपी फ्लो चैंबर को क्रमिक रूप से पिछले के शीर्ष पर प्रत्येक टुकड़े को रखकर इकट्ठा करें, नीचे के कक्ष, टुकड़ा ई, फिर टुकड़ा सी, टुकड़ा बी के साथ शुरुआत करें, इसके बाद शीर्ष पर टुकड़ा ए। इसके बाद, कोनों पर प्रत्येक टुकड़े के पेंच छेद संरेखित करें और एमपीपी प्रवाह कक्ष में प्रवाह का प्रशासन करते समय होने से लीक को रोकने के लिए टुकड़ों को कसकर एक साथ पेंच करें।एक छह अच्छी तरह से थाली में, प्रत्येक अच्छी तरह से चार से पांच, 12 मिलीमीटर कवर ग्लास हलकों जगह है । कोशिकाओं को 10% और 30% के बीच सहेजें, जैसे कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए एकल कोशिकाओं तक पहुंचा जा सकता है। इसके बाद, कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति देने के लिए दो घंटे से कम समय के लिए मानक संस्कृति स्थितियों के तहत कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, और 24 घंटे से अधिक नहीं, एंडोथेलियल कोशिकाओं के रूप में 24 घंटे से अधिक समय तक उप-प्रवाह पर वरीयता प्राप्त होने पर पैच करना मुश्किल हो जाएगा।इसके बाद, छह-अच्छी प्लेट के एक कुएं से पालन कोशिकाओं वाले कवर ग्लास को हटा दें और पीबीएस में जल्दी से कुल्ला करें। फिर, कवर ग्लास को कोशिकाओं के साथ 35 मिलीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल बीएएफ समाधान के दो मिलीलीटर होते हैं। तुरंत कवर ग्लास को कोशिकाओं के साथ एमपीपी फ्लो चैंबर में स्थानांतरित करें।कवर ग्लास सर्कल को आयताकार कवर ग्लास, पीस डी में स्थानांतरित करें, जिसका पालन एमपीपी फ्लो चैंबर के पीस सी से किया जाता है। कवर ग्लास सर्कल और कोशिकाओं को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए बीएएफ समाधान जोड़ें। इसके बाद, कवर ग्लास सर्कल को पीस डी पर ऐसी स्थिति दें कि कोशिकाएं टुकड़ा बी के भट्ठा उद्घाटन के अनुरूप होंगी सुनिश्चित करें कि कवर ग्लास सर्कल प्रवाह आवेदन द्वारा कवर ग्लास सर्कल की स्थिति के व्यवधान से बचने के लिए समाधान ग्लास आसंजन के माध्यम से टुकड़ा डी का पालन करता है।इसके बाद उचित क्रम में टुकड़ों को एक साथ पंगा लेकर एमपीपी फ्लो चैंबर को इकट्ठा करें। कक्ष को माइक्रोस्कोप चरण में स्थानांतरित करें और तुरंत बीएएफ समाधान के साथ कक्ष को छिद्रित करें। इसके बाद, प्रयोग के लिए एक अंधेरे सीमा और स्पष्ट नाभिक के साथ एक स्वस्थ कोशिका की पहचान करें।ऐसी कोशिकाओं से बचें जो ब्लूबिंग या कोशिकाएं दिखाई देती हैं जो अन्य कोशिकाओं के संपर्क में हैं। कतरनी तनाव को नियंत्रित करने के लिए, माइक्रोबोर ट्यूबिंग के साथ लगे तीन तरह के ल्यूयर लॉक के लिए एक 30 मिलीलीटर स्नातक सिरिंज सिलेंडर को जोड़ने के द्वारा एक गुरुत्वाकर्षण परफ्यूजन प्रणाली स्थापित करें । इसके बाद, दो तरफा टेप का उपयोग कर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग आसपास के फैराडे पिंजरे में स्नातक सिलेंडर संलग्न करें।एमपीपी चैंबर में टयूबिंग डालने से पहले सिरिंज को प्री-फिल करें और बीएएफ सॉल्यूशन के साथ टयूबिंग करें। फिर, टुकड़ा ए के एमपीपी फ्लो चैंबर इनलेट होल में टयूबिंग डालें, एमपीपी फ्लो चैंबर को समाधान के साथ भरें, जैसे कि इसे वैक्यूम जलाशय में हटाया जा रहा है। कक्ष के लिए प्रवाह बंद करो और शीर्ष निशान करने के लिए स्नातक सिलेंडर फिर से भरना।एक दिए गए सिरिंज सिलेंडर ऊंचाई पर कक्ष के माध्यम से प्रवाह करने के लिए समाधान की अनुमति देकर एक स्टॉपवॉच का उपयोग करके प्रवाह दर की मैन्युअल रूप से गणना करें। प्रवाह को बदलने और इस समीकरण का उपयोग करके समानांतर कक्ष में कतरनी तनाव की गणना करने के लिए सिरिंज को बढ़ाएं या कम करें। कतरनी तनाव का वांछित स्तर पाए जाने तक इस प्रक्रिया को दोहराएं।इसके बाद, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग के माइक्रोस्कोप चरण में पालन कोशिकाओं वाले एक इकट्ठे कक्ष को स्थानांतरित करें। और टयूबिंग डालें, पूर्व BAF समाधान के साथ भरा, टुकड़ा A.तो के छेद में, कक्ष को भरने और BAF समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने, एक साथ । एक बार वांछित पैच विन्यास सफलतापूर्वक प्राप्त हो जाने के बाद, चैनल धाराओं को कमरे के तापमान पर स्थिर स्नान में स्थिर करने की अनुमति दें।जैसे ही धाराओं को स्थिर कर दिया है, एक कदम के लिहाज से शेरनी लागू होते हैं, जिससे बढ़ी हुई धारा को कतरनी तनाव वृद्धि के अगले कदम से पहले स्थिर करने की अनुमति मिलती है। कक्ष में प्रवाह को रोककर कोशिकाओं के लिए कतरनी जोखिम निकालें, जिससे मशीनोसेंसिव चैनल धाराओं को स्थिर स्नान में देखी गई बेसलाइन धाराओं पर लौटने की अनुमति मिली। यहां दिखाया गया है कि एक प्राथमिक माउस मेसेंटेरिक एंडोथेलियल सेल से कीर वर्तमान की एक प्रतिनिधि कच्ची रिकॉर्डिंग है जिसमें उल्लेखनीय रैखिक जावक रिसाव वर्तमान है।नकारात्मक 140 से सकारात्मक 40 मिलीवोल्ट्स का रैंप 400 मिलीसेकंड पर पैच पर लागू किया गया था। रिसाव वर्तमान असली कीर चैनल गतिविधि के विश्लेषण को रोकता है। रिसाव वर्तमान घटाना करने के लिए, पहले रिसाव वर्तमान के रैखिक ढलान चालन की गणना करें।कच्चे डेटा पर रिसाव वर्तमान साजिश करने के लिए पूरे कच्चे ट्रेस के इसी वोल्टेज द्वारा कई जी ढलान । लाइन को बाहरी रैखिक रिसाव को बिल्कुल ओवरले करना चाहिए। फिर, पूरे ट्रेस से प्लॉट किए गए रिसाव धारा को घटाएं ताकि रैखिक जावक वर्तमान प्रति पिकोफराड शून्य पिकोम्परेस के बारे में हो, और असली कीर वर्तमान का विश्लेषण किया जा सके।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि कक्ष में कवर ग्लास को ठीक से स्थान दिया जाए ताकि कोशिकाएं प्रयोगों के लिए सुलभ हों। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि कवर स्लिप का पर्याप्त रूप से टुकड़ा डी का पालन किया जाता है, जैसे कि द्रव प्रवाह कोशिकाओं वाले कवर ग्लास को बाधित नहीं करता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

बैक्टीरियल आसंजन के अध्ययन में कतरें तनाव का परिचय

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

एकल कक्ष का विश्लेषण बेसिलस subtilis प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और फ्लो का उपयोग Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

मात्रात्मक उच्च throughput टी कोशिकाओं के लिए एकल कक्ष cytotoxicity परख

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Vacuolar टूटना की सिंगल सेल माप intracellular रोगज़नक़ों की वजह

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

कतरनी तनाव के मानव यकृत Sinusoidal अन्तःस्तर जिन स्थितियों को Leucocyte भर्ती अध्ययन के लिए एक फ्लो आसंजन परख

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

अलग माउस त्वचा क्षेत्र से Cytofluorimetric विश्लेषण के लिए एकल कोशिका निलंबन की तैयारी

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

टी लिम्फोसाइट-आसंजन अणु बातचीत का अध्ययन के लिए आसंजन के तहत कतरनी तनाव की परख

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

अलगाव साल्मोनेला typhimurium-मैक्रोफेज से युक्त Phagosomes का

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

सिंगल सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा Efferocytosis की ठहराव

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Murine सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं के कतरनी प्रवाह प्रेरित प्रवासन का विश्लेषण इन विट्रो में

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...